Al Cattaneo Lab obiettivo Huntington con l'applicazione della tecnica CRISPR / Cattaneo Lab aims to Huntington with the application of CRISPR's technique.

Al Cattaneo Lab obiettivo Huntington con l'applicazione della tecnica CRISPRCattaneo Lab aims to Huntington with the application of CRISPR's technique.



Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Joseph Cotellessa

Cervello colpito da corea di Huntington / Brain affected by Huntington's chorea

Si dice che CRISPR, la nuova tecnica che consente di correggere il DNA lettera per lettera, abbia rivoluzionato la vita dei ricercatori. Vediamo come, cominciando dal Cattaneo Lab, il laboratorio di biologia delle cellule staminali e farmacologia delle malattie neurodegenerative dell’Università di Milano, dove la farmacologa Chiara Zuccato è impegnata, insieme agli altri ricercatori del gruppo diretto da Elena Cattaneo, a fare luce sulle basi molecolari della Corea di Huntington.

“Abbiamo iniziato a usare CRISPR nel 2015 ed è una tecnica magica, fenomenale, ha cambiato la strategia dei nostri esperimenti. La malattia che studiamo, l’Huntington, colpisce il cervello ed è causata da mutazioni in un gene che, nella sua versione sana, serve a produrre una proteina importante per lo sviluppo e il funzionamento dei neuroni, l’huntingtina (HTT). Quando questo gene muta (la mutazione consiste nell’espansione di  triplette CAG ripetute) si produce una versione tossica della proteina che danneggia i neuroni e fa insorgere la malattia. Tra i nostri obiettivi  c’è lo studio delle funzioni di questo gene per verificare se sono compromesse dalla mutazione. Per riuscirci introduciamo mutazioni mirate nel gene e lo facciamo nelle cellule staminali embrionali di topo e anche umane. Quindi osserviamo se sono in grado di differenziarsi correttamente in neuroni. In pratica studiamo le correlazioni fra struttura e funzione.”

Che vantaggi offre la nuova tecnica?

“Quando ho cominciato a muovere i primi passi in laboratorio, nel 1999, servivano due o tre anni solo per ingegnerizzare il gene di interesse e potevamo anche non riuscirci. Si usava la ricombinazione omologa, la tecnica per cui ha ricevuto il Nobel Mario Capecchi. Ma è una tecnica difficile da usare, con un’efficienza molto bassa.

Oggi, 

grazie a CRISPR, ci basta poco più di un mese. Un paio di settimane per ricevere dalla ditta fornitrice il kit su misura, che include l’enzima taglia-DNA (Cas9) e la guida di RNA che trova il punto esatto sul gene da editare. Altre due o tre settimane per eseguire l’esperimento. Nel nostro gruppo ci sono tre colleghi che si dedicano a tempo pieno a riscrivere parti di sequenza del gene Huntington con l’aiuto di CRISPR, due senior e un neolaureato.

Come facevate prima che arrivasse questa tecnica?

“Siccome la ricombinazione omologa richiede tempi lunghi e non sempre funziona, usavamo dei filamenti di DNA circolare (plasmidi) contenenti il gene d’interesse modificato (transgene), che si integravano in punti casuali del genoma delle cellule. Ogni cellula conservava il suo gene endogeno e in più riceveva il gene estraneo appositamente mutato.

Sebbene questo sia un buon approccio per studiare la funzione genica, non rispecchia però quello che accade in una situazione fisiologica perché il transgene si inserisce in punti casuali e potrebbe interrompere sequenze di altri geni. Quindi era necessario produrre tante repliche (almeno 10 ) delle cellule ingegnerizzate (cloni) per essere certi che i risultati ottenuti non fossero un artefatto. Inoltre, abbiamo anche sempre validato i nostri risultati in modelli knock-in prodotti in collaborazione con gruppi esperti di ricombinazione omologa.

Oggi possiamo fare tutto molto più velocemente, con CRISPR, in un quindicesimo del tempo, modificando il gene endogeno senza aggiungere DNA estraneo. Si possono ordinare facilmente i reagenti su misura per ogni esperimento, per qualche centinaio di dollari.

Ci sono anche dei blog in cui i ricercatori condividono i trucchi per migliorare le condizioni sperimentali. Insomma esiste una comunità aperta che si scambia informazioni sulla tecnica e questo aiuta a risolvere problemi e a raggiungere più velocemente un risultato.”

Quando vi accingete a riscrivere il gene, come scegliete quali mutazioni introdurre?
“Ci basiamo su un lavoro evoluzionistico che abbiamo iniziato circa 5 anni fa. Il gene che ci interessa è unico perché non ha altri geni simili nel genoma umano e quindi per studiarlo lo confrontiamo con il gene corrispondente in altre specie. Abbiamo una banca di DNA provenienti da più di 200 organismi diversi, dalle amebe ai ricci di mare, dai pesci agli anfibi, dai rettili ai mammiferi. C’è un nostro dottorando a Kyoto, che studia il gene nelle scimmie.

Il gene Huntington è molto grande e produce una proteina di più di 3000 elementi di base (amminoacidi).  Confrontando le proteine di diverse specie abbiamo scoperto che la parte più interessante è rappresentata dai primi 500 amminoacidi che bastano da soli a svolgere funzioni importanti per i neuroni. Noi mutagenizziamo questa regione per capire se ci sono porzioni ancora più piccole, anche singoli aminoacidi, essenziali per lo svolgimento di queste funzioni”.

Come introducete l'enzima taglia-DNA e la sua guida dentro le cellule?

“Inseriamo il plasmide che contiene le sequenze per l’enzima Cas9 e per l’RNA guida dentro ai liposomi, che sono vescicole lipidiche, mettiamo la miscela sopra alle cellule da editare e i liposomi si fondono con la membrana citoplasmatica che le riveste, liberando il contenuto all’interno. Cas9 e RNA guida raggiungono quindi il sito bersaglio sul DNA da mutare”.

CRISPR presenta anche dei problemi?

“Può capitare che agisca anche in punti del DNA diversi da quelli desiderati, di solito sono siti simili all’obiettivo scelto. Accade però molto raramente perché la tecnica è veramente specifica. Se abbiamo il sospetto che questo possa accadere, una volta eseguito l’editing si può sequenziare il DNA cellulare per verificare che non ci siano effetti off-target. Ormai costa poco farlo.”

La tecnica viene continuamente perfezionata per renderla sempre più versatile e precisa. Voi usate solo la ricetta classica, quella con l’enzima Cas9?

“Abbiamo usato anche altre varianti, compresa quella che riconosce un sito bersaglio sul DNA senza tagliarlo, una variante specifica detta dead-Cas9 che può essere legata a proteine che attivano o silenziano promotori e che è quindi particolarmente utile quando vogliamo modulare l’espressione di un gene e non mutarlo. In situazioni diverse può essere più utile l’una o l’altra, è bello avere a disposizione più opzioni tra cui scegliere”.

ENGLISH


It is said that CRISPR, the new technique that corrects DNA letter by letter, has revolutionized the lives of the researchers. Let's see how, starting from Cattaneo Lab, the laboratory of biology of stem cells and pharmacology of neurodegenerative diseases at the University of Milan, where the pharmacologist Chiara Zuccato is committed, along with other researchers in the group led by Elena Cattaneo, to shed light on the bases molecular of Huntington's Disease.

"We started using CRISPR in 2015 and is a magical technique, phenomenal, has changed the strategy of our experiments. The disease we are studying, the Huntington, affects the brain and is caused by mutations in a gene that, in its healthy version, is used to produce a protein important for the development and functioning of neurons, huntingtin (HTT). When this gene mutates (the mutation consists in the expansion of CAG repeat) it produces a toxic version of the protein that damages neurons and gives rise to the disease. Among our objectives we are studying the function of this gene to see if they compromised by the mutation. To do that we introduce targeted mutations in the gene and we do it in embryonic mouse stem cells and even human. Then we observe if they are able to differentiate properly into neurons. In practice we study the correlations between structure and function. "

What advantages does the new technique?

"When I started to take its first steps in the laboratory, in 1999, they needed two or three years just to engineer the gene of interest and we could not even do that. He used homologous recombination, the technique for which he received the Nobel Mario Capecchi. But it is a difficult technique to use, with very low efficiency.

Today,
thank CRISPR, we just a little over a month. A couple of weeks to receive from the company supplying the bespoke kit that includes the DNA-cutting enzyme (Cas9) and RNA guide that finds the exact spot on the gene to be edited. Other two or three weeks to perform the experiment. In our group there are three colleagues who are dedicated full-time to rewrite the Huntington gene sequence parts with the help of CRISPR, two senior and a recent graduate.

As it did before the arrival of this technique?

"Since the homologous recombination takes a long time and does not always work, we used the circular DNA filaments (plasmids) containing the gene of interest modified (transgene), who integrated at random points of the cell genome. Every cell retained its endogenous gene plus received the foreign gene specifically mutated.

Although this is a good approach to study gene function, it does not reflect what happens in a physiological situation because the transgene is inserted in random places and may stop sequences of other genes. So it was necessary to produce many replicas (at least 10) of the engineered cells (clones) to ensure that the results were not an artifact. In addition, we also always validated our results in knock-in products in collaboration with expert groups homologous recombination models.

Today we can do everything much faster, with CRISPR, in one fifteenth of the time, by modifying the endogenous gene without adding foreign DNA. You can easily sort the reagents tailored to each experiment, for a few hundred dollars.

There are also blogs in which researchers share the tricks to improve the experimental conditions. In short, there is an open community that exchanges information on technique and this helps to solve problems and achieve a faster result. "

When you are preparing to rewrite the gene, how do you choose which mutations introduced?
"We rely on an evolutionary work that we started about 5 years ago. The gene that interests us is unique because it does not have similar genes in the human genome and then to study it we compare it with the corresponding gene in other species. We have a DNA bank from more than 200 different organizations, from amoebas to sea urchins, from fish to amphibians, reptiles to mammals. There is one of our graduate student at Kyoto, which studies the gene in monkeys.

The Huntington gene is very large and produces a protein of more than 3000 base elements (amino acids). By comparing proteins of different species we found that the most interesting part is represented by the first 500 amino acids alone can perform important functions for neurons. We mutagenizziamo this region to see if there are still smaller portions, even individual amino acids, essential for the performance of these functions. "

How to introduce the enzyme cuts DNA and his leadership in the cells?

"We insert the plasmid that contains sequences for Cas9 enzyme and for the guide RNA within liposomes, which are lipid vesicles, put the mixture on top of the cell to edit and liposomes fuse with the plasma membrane that covers them, freeing the contained within. Cas9 guide RNA and then reach the target site on the DNA to mutate. "

CRISPR also has problems?

"It may happen that also acts in DNA points other than the desired ones, are usually similar sites chosen objective. But it happens very rarely because the technique is very specific. If we suspect that this will happen, when executed editing you can sequence the cellular DNA to verify that there are no off-target effects. Now just do it costs. "

The technique is continuously improved to make it more versatile and precise. You use only the classic recipe, the one with the Cas9 enzyme?

"We also used other versions, including the one that recognizes a target site on the DNA without cutting it, a specific variant called dead-Cas9 that can be linked to proteins that activate or mute promoters and which is therefore particularly useful when we want to modulate the expression of a gene and not change it. In different situations can be more useful one or the other, it is nice to have more options to choose from. "


Da.

http://www.lescienze.it/news/2017/03/20/news/crispr_elena_cattaneo_huntington-3461268/

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