La scoperta dei biofilm / The discovery of biofilms

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Siti comuni di infezione da biofilm. Un biofilm raggiungere il flusso sanguigno e può diffondersi in qualsiasi superficie umida del corpo umano.

Sites of biofilm infection. A biofilm reaches the bloodstream and may spread to any humid surface of the human body.

La scoperta, molto interessante, che illumina sul perché spesso sia difficile combattere le infezioni, viene dall’osservazione che un gran numero di agenti patogeni sono raggruppati in comunità chiamate biofilm.

In un articolo intitolato "I biofilm batterici: una causa comune di infezioni persistenti," JW Costerton, del Center for Biofilm Engineering del Montana ha definito un biofilm batterico come: "una comunità strutturata di cellule batteriche racchiuse in una matrice polimerica autoprodotta e aderente ad un materiale inerte o ad una superficie vivente ".

In parole povere, questo significa che i batteri possono aderire insieme, su qualsiasi superficie e iniziare a formare una matrice protettiva intorno a loro. Una sorta di “nicchia ecologica”. La matrice è costituita da polimeri - sostanze composte da molecole con unità strutturali ripetitive che sono collegate da legami chimici.

Secondo il Center for Biofilm Ingegneria Montana State University, un biofilm si forma quando i batteri aderiscono alle superfici in ambienti liquidi ed iniziano a espellere una sostanza viscida, una sorta di “colla” che li può ancorare a tutti i tipi di materiali - dai metalli, alla plastica, alle particelle del suolo, ai materiali medici degli impianti e, più significativamente, sul tessuto umano o animale.

Le prime colonie batteriche che aderiscono ad una superficie inizialmente creano legami deboli, reversibili, chiamati forze di Van der Waals. Però, se quelle colonie non vengono immediatamente separate dalla superficie alla quale aderiscono, possono ancorarsi più stabilmente utilizzando molecole di adesione cellulare, proteine sulla loro superficie che legano altre cellule in un processo chiamato “adesione cellulare”.

Questi ‘pionieri batterici’ facilitano l'arrivo di altri agenti patogeni, fornendo siti di adesione più diversi. Cominciano anche costruendo la matrice che tiene insieme i biofilm. Se ci sono specie che non sono in grado di legarsi ad una superficie da soli, questi sono spesso in grado di ancorarsi alla matrice o direttamente a colonie precedenti.

Durante la colonizzazione, le cose iniziano a complicarsi. Diversi studi hanno dimostrato che durante il periodo di tempo in cui un biofilm si comincia a creare, gli agenti patogeni all'interno del biofilm possono comunicare tra loro grazie ad un fenomeno chiamato quorum sensing. Anche se i meccanismi alla base quorum sensing non sono stati ancora pienamente compresi, il fenomeno consente ad un batterio unicellulare di percepire quanti altri batteri sono nelle immediate vicinanze. Se un batterio è in grado di rilevare che è circondato da una densa popolazione di altri agenti patogeni, quello è più incline ad unirsi a loro e contribuire alla formazione di un biofilm. Si associano in comunità batteriche.

I batteri che svolgono la funzione di quorum sensing comunicano la loro presenza attraverso l'emissione di messaggi chimici che i loro colleghi agenti infettivi sono in grado di riconoscere. Quando i messaggi diventano abbastanza forti, i batteri rispondono in massa, comportandosi come una comunità. Un quorum sensing può verificarsi dentro una singola specie batterica e tra specie diverse, e può regolare una serie di processi diversi, ma essenzialmente si comporta come una rete di comunicazione. Una varietà di differenti molecole possono essere utilizzate come segnali.

"I batteri causano la patologia parlando tra loro con un vocabolario chimico", ha detto Doug Hibbins della Princeton University. Il Dr. Bonnie Bassler, Hibbins, uno studente laureato del laboratorio di microbiologia del Princeton University, ha fatto una ricerca che ha finalmente fatto luce su come i batteri che causano il biofilm nel colera comunicano tramite quorum sensing.

"Formare un biofilm è uno dei passaggi cruciali nella progressione del colera", afferma Bassler. "Loro [i batteri] si coprono in una sorta di ‘scudo’ contro gli antibiotici, potendo così crescere rapidamente. Quando sentono di essere in numero consistente, cercano di lasciare il corpo."

Anche se i batteri del colera utilizzano gli intestini come terreno fertile, dopo che si sono formati un numero sufficiente di biofilm, i batteri planctonici all'interno dei biofilm cercano di lasciare quel corpo al fine di infettare un nuovo ospite.

Non ci volle molto per Bassler e per la sua squadra per rendersi conto del fatto che i batteri all'interno dei biofilm del colera devono segnalare a tutti gli altri che è il momento per la colonia per interrompere la riproduzione e di concentrarsi invece sull’obiettivo di lasciare quel corpo.

"Abbiamo capito che i batteri genericamente parlano tra loro con quorum sensing, ma non sapevamo le parole chimiche specifiche che il colera usa" ha detto Bassler.

Poi Higgins ha isolato CAI-1 - una sostanza chimica che si trova naturalmente nel colera. Un altro studente laureato ha capito come riprodurre quella molecola in laboratorio. Per moderare il livello di CAI-1 in contatto con i batteri del colera, Higgins è riuscito a controllare chimicamente il comportamento del colera in un test di laboratorio. Il suo team alla fine ha confermato che quando CAI-1 è assente, i batteri del colera creano e attaccano i biofilm al loro ospite. Ma quando i batteri si sono riforniti di sufficienti sostanze chimiche, smettono di creare i biofilm e rilasciano tossine, comunicando in questo modo alla comunità batterica che è il momento di lasciare quel corpo. Così, CAI-1 può benissimo essere la singola molecola che permette ai batteri del colera presenti all'interno di un biofilm di comunicare con la comunità batterica di supporto. Anche se è probabile che i batteri in un biofilm del colera possano comunicare con altri segnali oltre CAI-1, lo studio è un buon esempio del fatto che le molecole di segnalazione hanno un ruolo chiave nel determinare le condizioni di un biofilm.

Allo stesso modo, i ricercatori della University of Iowa (molti dei quali sono ora presso l'Università di Washington) hanno trascorso l'ultimo decennio a cercare di identificare le molecole che permettono alle specie batteriche P. aeruginosa di formare i biofilm nei polmoni dei pazienti con fibrosi cistica. Anche se il P. aeruginosa isolato dai polmoni dei pazienti con fibrosi cistica si presenta in biofilm e si comporta come un biofilm, fino a poco tempo fa, non c'erano prove oggettive disponibili per confermare che le specie batteriche hanno effettivamente formato dei biofilm nei polmoni di pazienti con la malattia, né c’era un modo per dire in quale percentuale P. aeruginosa nei polmoni era effettivamente associata nella modalità di biofilm.

"Avevamo bisogno di un modello per dimostrare che il P. auruginosa nei polmoni con fibrosi cistica si comportava come un biofilm. Questo ci avrebbe potuto far capire lo stile di vita di P. auruginosa, "ha affermato Pradeep Singh, MD, autore principale dello studio, che è ora presso l'Università di Washington.

Singh e i suoi colleghi hanno infine scoperto che P. aeruginosa utilizza una delle due particolari molecole di quorum sensing per avviare la formazione dei biofilm. Nel novembre 1999, il suo team di ricerca ha individuato l'intero genoma batterico, identificando 39 geni che sono fortemente controllati dal sistema di quorum-sensing.

In uno studio del 2000, pubblicato su Nature, Singh e colleghi hanno sviluppato un test molto sensibile che mostra la presenza di P. auruginosa nei polmoni con fibrosi cistica e produce alcuni markers, proprio quelle molecole di quorum-sensing che sono i segnali per la formazione dei biofilm.

Ed è così che si è scoperto che P. aerugnosa secerne due molecole di segnalazione, una che è lunga, e un’ altra che è breve. Utilizzando il nuovo test, il team è stato in grado di dimostrare che le forme planctoniche di P. aeruginosa producono molecole più lunghe di segnalazione. In alternativa, quando hanno testato ceppi isolati di P. aeruginosa nei polmoni dei pazienti con fibrosi cistica (che erano in forma di biofilm), tutti i ceppi prodotti dalle molecole di segnalazione, ma in ragione opposta, erano più corte che lunghe.

È interessante notare che quando i ceppi di biofilm di P. aeruginosa furono separati in singole forme batteriche, quei ceppi tornarono a produrre molecole di segnali più lunghi rispetto a quelli brevi. Gli studiosi si posero un’altra domanda: questo dato significava che un cambiamento nella lunghezza di segnalazione molecolare poteva indicare se i batteri rimanevao come forme planctoniche o si sviluppavano in biofilm?

Per scoprirlo, il team ha preso i batteri dalla coltura nella quale li aveva creati e li ha fatti crescere come un biofilm di nuovo. Quindi ha osservato che i ceppi di batteri in forma di biofilm producevano molecole con segnale più brevi che lunghi.

"Il fatto che il P. aeruginosa [nei polmoni dei pazienti con fibrosi cistica] sta producendo dei segnali specifici ci dice che c'è un biofilm e che la maggior parte dei P. aeruginosa nel polmone si trova nello stato di biofilm ", ha affermato Greenberg, un altro membro del team di ricerca. Egli ritiene che i risultati consentono una definizione biochimica chiara dello stato in cui i batteri sono in un biofilm. Tecniche simili a quelle usate dal suo gruppo saranno probabilmente utilizzate per determinare le proprietà di altre molecole di segnalazione dei biofilm.

Sviluppo dei biofilm

Una volta che la colonizzazione è iniziata, il biofilm cresce attraverso una combinazione di divisione cellulare e di reclutamento. La fase finale di formazione dei biofilm è nota come sviluppo ed è la fase in cui si stabilizza il biofilm e può modificarsi per forma e per dimensioni. Questo sviluppo di un biofilm permette alle cellule che sono al suo interno di diventare più resistenti agli antibiotici somministrati in modo standard. Infatti, a seconda del microrganismo e del tipo di sistema antimicrobico e sperimentale, i batteri dei biofilm possono essere fino a mille volte più resistenti allo stress antimicrobico dei batteri della stessa specie che viaggiano liberi.

I Biofilm crescono lentamente, in luoghi diversi, e le infezioni da biofilm hanno tempi lunghi per riuscire a produrre sintomi evidenti. Tuttavia, i batteri dei biofilm possono muoversi in numerosi modi che permettono loro di infettare facilmente nuovi tessuti. I biofilm possono muoversi collettivamente, ondeggiano o rotolano lungo la superficie, o si staccano in ciuffi. Talvolta, in una strategia di disseminazione denominata "sciamatura/semina", una colonia di biofilm si differenzia per formare un "muro" esterno di batteri stazionari, mentre la regione interna del biofilm "liquefà", consentendo alle cellule planctoniche di "nuotare" fuori dal biofilm.

La ricerca sulle basi molecolari e genetiche dello sviluppo dei biofilm ha messo in chiaro che quando le cellule passano dalle forme planctoniche alla modalità di comunità, subiscono anche un cambiamento nel comportamento che coinvolge l’alterazione nell'attività di numerosi geni. Ci sono prove che i geni specifici debbono essere trascritti durante la fase di attacco dello sviluppo di biofilm. In molti casi, è richiesta l'attivazione di questi geni per la sintesi della matrice extracellulare che protegge i patogeni all'interno.

Secondo Costerton, i geni che permettono di sviluppare un biofilm sono attivati dopo che questi hanno raggiunto un numero sufficiente di cellule, tale che si possano legare ad una superficie solida. "Così, sembra che l'adesione sia ciò che stimola la sintesi della matrice extracellulare in cui i batteri sessili sono incorporati," afferma il biologo molecolare. "Questa informazione- che i batteri hanno un senso del ‘tatto’ che consente il rilevamento di una superficie e l'espressione di geni- specifici è di per sé un argomento interessante della ricerca."

Alcune caratteristiche possono facilitare anche la capacità di alcuni batteri nel formare dei biofilm. Gli scienziati del Dipartimento di Microbiologia e Genetica Molecolare, della Harvard Medical School, hanno condotto uno studio in cui hanno creato una forma "mutante" della specie batterica P. Aeruginosa (PA).

I mutanti mancavano dei geni che codificano per le appendici, simili a capelli, chiamati pili. È interessante notare che i mutanti sono stati in grado di formare dei biofilm. Dal momento che i pili del P. Aeruginosa sono coinvolti in un tipo di motilità chiamati spasmi di superficie associati, il team ha ipotizzato che questa contrazione potrebbe essere richiesta proprio per facilitare l'aggregazione delle cellule nelle micro-colonie che in seguito vanno a formare un biofilm stabile.

Una volta che un biofilm si è ufficialmente costituito, esso contiene spesso i canali in cui i nutrienti che gli sono indispensabili per sopravvivere possono circolare. Le cellule, nelle diverse regioni di un biofilm, mostrano anche diversi modelli di espressione genica. Poiché i biofilm spesso sviluppano un proprio metabolismo, a volte si confondono con i tessuti degli organismi superiori, in cui le cellule contigue lavorano insieme per creare una rete in cui i minerali che servono alla sopravvivenza di quei biofilm possano fluire.

"C'è una percezione degli organismi unicellulari di tipo asociale, ma è una percezione sbagliata", ha detto Andre Levchenko, assistente professore di ingegneria biomedica a Whiting Facoltà di Ingegneria della Johns Hopkins University, una filiale dell'Istituto universitario per le nanobiotecnologie. "Quando i batteri sono sotto stress, che è la storia della loro vita, fanno squadra e formano questa collettività chiamata biofilm. Se guardate i biofilm presenti in natura, hanno un'architettura molto complicata. Sono come le città, con dei loro specifici canali, per far entrare le sostanze nutritive e per permettere ai rifiuti di uscire ".

Capire come tale cooperazione tra gli agenti patogeni si evolva e si mantenga rappresenta uno dei problemi più spinosi della biologia evolutiva. Ciò deriva dalla realtà che, in natura, questi 'trucchi' dei batteri per sopravvivere si evolvono e sfruttano qualsiasi sinergia per difendere se stessi, fino a quando non si arriva alla rottura di quella cooperazione. Così, che cosa induce i batteri a contribuire e a condividere le risorse in un biofilm, piuttosto che rubarle tra di loro? Recentemente, il Dr. Michael Brockhurst dell 'Università di Liverpool e colleghi presso l'Université di Montpellier e l'Università di Oxford hanno condotto numerosi studi nel tentativo di capire perché i batteri in un biofilm collaborano e condividono risorse piuttosto che combattersi tra loro.

Il team ha osservato più da vicino i biofilm di P. fluorescens, biofilm che si formano quando le cellule singole producono un polimero che “incolla” le cellule insieme, permettendo così la colonizzazione di superfici liquide. Mentre la produzione del polimero è metabolicamente molto costoso per le singole cellule, i benefici della vita di gruppo dei biofilm sono offerti da un maggiore accesso all'ossigeno che fornisce quella vita in colonia. Eppure, evolutivamente parlando, una tale impostazione permette a possibili "imbroglioni" per entrare nel biofilm. Questi falsi cooperanti potrebbero usufruire della matrice protettiva ma non contribuire a dare energia per costruire la matrice. Se troppi "imbroglioni" entrano in un biofilm, quel biofilm alla fine s’indebolirà e poi si romperà.

Dopo diversi anni di studio, Brockhurst e il suo team si resero conto che l'evoluzione a breve termine della diversità all'interno di un biofilm è un fattore importante per comprendere il modo in cui i suoi diversi membri collaborano con successo. Il team ha scoperto che, una volta all'interno di un biofilm, P.fluorescens si differenzia in varie forme, ognuna delle quali utilizza diverse risorse nutritive. Il fatto che questi "diversi cooperatori" non tutti cooperino per gli stessi prodotti chimici e sostanze nutritive, riduce sostanzialmente la concorrenza per le risorse all'interno del biofilm. A ciascuno la sua.

Quando il gruppo di scienziati ha manipolato le diverse specie batteriche all'interno dei biofilm sperimentali, ha scoperto che diversi biofilm che contenevano pochi "imbroglioni" avevano prodotto gruppi più grandi rispetto ai biofilm di una stessa specie batterica.

Allo stesso modo i ricercatori della Johns Hopkins; Virginia Tech; dell'Università della California, a San Diego e Lund in Svezia, hanno pubblicato i risultati di uno studio che ha trovato che una volta che i batteri cooperano e formano un biofilm, l’associazione migliora ulteriormente la loro sopravvivenza.

Il gruppo ha creato un nuovo dispositivo per osservare il comportamento dei batteri E. coli costretti a crescere in spazi angusti. Il dispositivo, che permette agli scienziati di utilizzare volumi estremamente piccoli di cellule in soluzione, contiene una serie di piccole camere di varie forme e dimensioni che mantengono i batteri uniformemente sospesi in un terreno di coltura.

Senza troppe sorprese per i ricercatori, i batteri che vivevano in condizioni anguste nel dispositivo hanno cominciato a formare un biofilm. Il team ha ripreso lo sviluppo del biofilm in un video, e gli studiosi sono stati in grado di osservare l'auto-organizzazione progressiva e la costruzione del biofilm batterico in un arco di di 24 ore.

In primo luogo, Andre Levchenko e Hojung Cho della Johns Hopkins hanno registrato il comportamento dei singoli strati di E. coli usando la microscopia in tempo reale. "Siamo stati sorpresi di trovare che le cellule crescono in spazi angusti via via si sono organizzate in strutture altamente regolari", ha detto Levchenko.

Ulteriori osservazioni con il microscopio hanno rivelato che più vasta era la popolazione di cellule tra loro associate che risiedeva negli spazi angusti, e più ordinato nella sua struttura è diventato il biofilm. Come le cellule del biofilm sono diventate più ordinate e compatte, più il biofilm è diventato sempre più difficile da penetrare.

Levchenko ha anche osservato che E. coli a forma di bastoncello, che erano troppo corti o troppo lunghi, in genere non si sono organizzati bene nella densità, lo snodo principale circolare del biofilm. Invece, i batteri di forme dispari o gruppi altamente disordinati di cellule, sono stati trovati sui bordi del biofilm, dove formavano spigoli vivi.

Problemi di infezione recidivante?

I ricercatori spesso fanno notare che, una volta che i biofilm si sono stabilizzati, i batteri planctonici possono periodicamente lasciare il biofilm per conto proprio. Quando lo fanno, possono moltiplicarsi rapidamente e disperdersi in altri contesti.

Secondo Costerton, esiste un modello naturale periodico programmato di distacco delle cellule planctoniche dai biofilm. Questo significa che i biofilm possono agire come quello che Costerton definisce l’infezione acuta. Poiché i batteri in un biofilm sono protetti da una matrice, il sistema immunitario dell'ospite è meno attrezzato per innescare una reazione contro la loro presenza.

Ma se i batteri planctonici vengono periodicamente rilasciati dai biofilm, di volta in volta forme batteriche singole entrano nei diversi tessuti, ed è allora che il sistema immunitario diventa improvvisamente consapevole della loro presenza. Come reazione il Sistema Immunitario può innescare una risposta infiammatoria che porta a sintomi intensificati. Pertanto, il rilascio periodico di batteri planctonici da alcuni biofilm può essere ciò che provoca numerose infezioni recidivanti croniche.

Come Matthew R. Parsek della Northwestern University descrive in un articolo del 2003 pubblicato su Annual Review of Microbiology, qualsiasi agente patogeno che sopravvive in una forma cronica trae benefici mantenendo vivo l'ospite.

Dopo tutto, se una forma batterica cronica uccide semplicemente il suo ospite, essa non avrà più un posto dove vivere. Quindi, secondo Parsek, l’infezione cronica si traduce spesso in una "situazione di stallo della malattia", dove i batteri di moderata virulenza sono alquanto contenuti dalle difese dell'ospite. Gli agenti infettivi in realtà non uccidono l’ospite umano o animale che sia, ma l’ospite a sua volta non è mai in grado di uccidere completamente i patogeni.

Parsek ritiene che il modo ottimale per i batteri di sopravvivere in tali circostanze è proprio nei biofilm, affermando che "la crescente evidenza suggerisce che la modalità di crescita dei biofilm può giocare un ruolo fondamentale in entrambi questi adattamenti. La crescita del biofilm aumenta la resistenza dei batteri e può rendere quegli organismi visibili al sistema immunitario ... in ultima analisi, questa moderazione della virulenza dei batteri può servire nell'interesse dei batteri stessi, aumentando la longevità dell' ospite ".

La comprensione dei biofilm come entità infettive

Forse perché molti biofilm sono sufficientemente densi da essere visibili ad occhio nudo, le comunità microbiche sono stata tra le prime ad essere studiate dai primi microbiologi. Anton van Leeuwenhoek ha raschiato il biofilm della placca dei denti ed ha osservato con il suo primitivo microscopio ciò che ha descritto al loro interno come "animaletti". Tuttavia, secondo Costerton e il gruppo presso il Centro di biofilm ricerca presso Montana State University, non è stato possibile fino al 1970 che gli scienziati cominciassero a capire che i batteri nel biofilm avevano adottato una modalità di sopravvivenza così da costituire una componente molto importante della biomassa batterica nella maggior parte degli ambienti. Quindi, soltanto intorno agli anni 1980-1990 gli scienziati hanno cominciato a capire veramente come i batteri possano costituire una comunità elaborata ed organizzata nei biofilm.

Robert Kolter, professore di microbiologia e genetica molecolare presso la Harvard Medical School, uno tra i primi scienziati a studiare come i biofilm si sviluppano, afferma: "Sin dal primo momento studiando i biofilm c’è stata una rivoluzione radicale degli studi precedenti."

Come la maggior parte dei genetisti microbici, Kolter era stato addestrato nella tradizione che risale al Robert Koch e Louis Pasteur, e cioè che batteriologia è condotta meglio quando si studiano ceppi puri di batteri planctonici. "Sicuramente questo ha rappresentato un progresso enorme per la microbiologia moderna, ma ha anche distratto i microbiologi da una visione più organismica dei batteri”, e Kolter ha aggiunto: "Certamente abbiamo ritenuto tutti per tanto tempo che le culture planctoniche fossero l'unico modo per lavorare. Eppure in natura i batteri non vivono così"… "In effetti, la maggior parte di essi (dei batteri) si organizzano in siti comunitari."

Anche se la ricerca sui biofilm è lievitata negli ultimi decenni, la maggior parte delle ricerche sui biofilm fino ad oggi si è concentrata sui biofilm esterni, o quelli che si formano sulle varie superfici nel nostro ambiente naturale (le attrezzature mediche, le protesi, ecc.).

Negli ultimi anni però, gli scienziati hanno sviluppato strumenti migliori per analizzare i biofilm esterni, e ben presto hanno scoperto che i biofilm possono causare una vasta gamma di problemi negli ambienti industriali. Ad esempio, i biofilm si possono sviluppare all’interni dei tubi, e questo può portare all’ intasamento e alla loro corrosione. I biofilm che si creano sui pavimenti e sui contatori possono rendere difficile il risanamento nelle aree preposte alla preparazione degli alimenti.

Poiché i biofilm hanno la capacità d’intasare tubi, i bacini idrografici, le aree di stoccaggio, e di contaminare i prodotti alimentari, le grandi aziende con strutture che possono subire negativamente la loro presenza hanno naturalmente accolto con interesse la ricerca sui biofilm, in particolare la ricerca che specifica come i biofilm possono essere eliminati.

Questo significa che molti progressi recenti nella rilevazione dei biofilm sono il risultato di collaborazioni tra ecologisti microbici, ingegneri ambientali, e matematici. Questa ricerca ha generato nuovi strumenti analitici che aiutano gli scienziati a identificare i biofilm.

Ad esempio, l'azienda canadese FAS International Ltd ha creato un pennello endoluminale. I medici possono utilizzare il pennello per ottenere campioni dall'interno di cateteri. I campioni prelevati dai cateteri possono essere inviati ad un laboratorio, dove i ricercatori sapranno determinare se sono presenti nel campione dei biofilm. Se vengono rilevati dei biofilm, il catetere deve essere immediatamente sostituito, poiché l'inserimento di cateteri con biofilm può condurre il paziente a soffrire di numerose infezioni, alcune delle quali sono potenzialmente letali.

Gli scienziati ora si rendono conto che i biofilm non sono solo composti da batteri. Quasi ogni specie di microrganismi - tra cui virus, funghi, e archeobatteri - hanno meccanismi attraverso i quali essi possono aderire alle superfici e gli uni agli altri. Inoltre, si è ormai capito che i biofilm sono estremamente diversi tra loro. Ad esempio, possono abitare i biofilm che formano la placca dentale più di 300 diverse specie di batteri.

Inoltre, i biofilm sono stati trovati davvero ovunque in natura, al punto che qualsiasi microbiologo tradizionale può riconoscere che la loro presenza è onnipresente. Essi possono essere trovati sulle rocce e sui ciottoli sul fondale della maggior parte dei torrenti o dei fiumi e spesso si formano sulla superficie delle pozze d'acqua stagnante. In realtà, i biofilm sono componenti importanti di catene alimentari nei fiumi e torrenti e diventano nutrimento per i pesci. I biofilm crescono anche nelle piscine acide dello Yellowstone National Park (il più grande parco mondiale) e sui ghiacciai in Antartide.

Paolo Stoodley, del Centro di biofilm dell’Università Statale in Ingegneria del Montana, attribuisce gran parte del ritardo nello studio biofilm alle difficoltà di lavorare con biofilm eterogenei rispetto a popolazioni planctoniche omogenee. In un articolo pubblicato su Nature Reviews del 2004, il biologo molecolare descrive molte ragioni per cui i biofilm sono estremamente difficili da studiare in coltura, come il fatto che la diffusione di liquido attraverso un biofilm e le forze che agiscono su un fluido del biofilm debbono essere calcolate accuratamente se un biofilm deve essere coltivate correttamente. Secondo Stoodley, la necessità di padroneggiare queste tecniche di laboratorio così difficili ha dissuaso molti scienziati dal tentativo di lavorare con i biofilm.

Inoltre, dal momento che gran parte della tecnologia necessaria per rilevare dei biofilm all’interno dell’organismo è stata creata nello stesso periodo del sequenziamento del genoma umano, l'interesse sui batteri dei biofilm, e gli assegni di ricerca che avrebbero accompagnato tale interesse, sono stati in gran parte dirottati su progetti che si focalizzavano sulla genetica. Tuttavia, dal momento che la ricerca genetica è riuscita a scoprire la causa di una delle malattie croniche più comuni, i biofilm sono tornati- solo negli ultimi anni - in una fase di studio più intensa, e oggi vengono indagati con la giusta attenzione per cercare di comprendere meglio gravi condizioni infettive, in grado di provocare una vasta gamma di malattie croniche.

In poco tempo, i ricercatori che studiano i biofilm interni hanno già compreso che questi sono la causa di numerose infezioni croniche e malattie, e l'elenco delle malattie attribuite a queste colonie batteriche continua a crescere rapidamente.

Secondo una dichiarazione pubblica dal National Institutes of Health, oltre il 65% di tutte le infezioni microbiche sono causate da biofilm. Questo numero può sembrare elevato, ma secondo Kim Lewis del Dipartimento di Ingegneria Chimica e Biologica presso la Tufts University: "Se si ricorda che tali infezioni comuni, come sono ad esempio le infezioni del tratto urinario (causate da E. coli e di altri agenti patogeni), le infezioni da catetere (causate da Staphylococcus aureus e di altri agenti patogeni gram-positivi), le infezioni del bambino dell'orecchio medio (causata da Haemophilus influenzae, per esempio), o la formazione della comune placca dentale e della gengivite, che sono tutti disturbi causati dai biofilm, sono difficili da trattare o frequentemente recidivanti, questa ipotesi appare molto realistica ".

Come cita Lewis, forse i biofilm più accuratamente studiati, sono quelli che compongono la placca dentale. "La placca è un biofilm sulle superfici dei denti", afferma Parsek. "Questo accumulo di microrganismi sottopone i denti e i tessuti gengivali ad alte concentrazioni di metaboliti batterici che si traducono in patologie dentali".

Inoltre ha recentemente dimostrato che i biofilm sono presenti sul tessuto rimosso dell’ 80% dei pazienti sottoposti a chirurgia per la sinusite cronica. Secondo Parsek, i biofilm possono anche causare osteomielite, una malattia in cui le ossa e il midollo osseo possono essere infettati. Ciò è confermato dal fatto che gli studi di microscopia hanno dimostrato la formazione dei biofilm sulle superfici ossee infette da esseri umani e modelli animali sperimentali. Parsek ipotizza anche un ruolo dei biofilm nelle prostatiti croniche poiché gli studi di microscopia hanno anche documentato la presenza di biofilm sulla superficie del condotto prostatico. I microbi che colonizzano le fibre di tessuto e dei tamponi vaginali possono anche formare dei biofilm, causando infiammazione e malattie come la sindrome da shock tossico.

I biofilm possono anche causare la formazione dei calcoli renali. Le aggregazioni di sali minerali che causano i calcoli renali causano malattie ostruendo il flusso dell’ urina e producendo infiammazioni e infezioni ricorrenti che possono finire con il portare ad insufficienza renale. Circa il 15% -20% dei calcoli renali si verificano nel contesto di infezioni del tratto urinario. Secondo Parsek, queste aggregazione di sali minerali sono prodotte dall'interazione tra i batteri che infettano e i substrati minerali derivati dalle urine. Questa interazione si traduce in un biofilm complesso composto da batteri, produzioni di tossine batteriche, e materiale cristallizzato di sali minerali.

Forse il primo accenno al ruolo dei batteri nella formazione di questi calcoli è stato fatto nel 1938, quando Hellstrom ha esaminato i calcoli che espellevano i suoi pazienti ed ha trovato batteri incorporati dentro. L’analisi microscopica dei calcoli rimossi chirurgicamente dai pazienti infetti ha rivelato elementi che caratterizzano la crescita dei biofilm. Per prima cosa, i batteri sulla superficie e all'interno dei calcoli sono organizzati in micro-colonie e circondati da una matrice composta da minerali cristallizzati.

Poi c'è l’endocardite, una malattia che comporta l'infiammazione degli strati interni del cuore. La lesione infettiva primaria nell’ endocardite è proprio un biofilm complesso costituito da due componenti batteriche che si trovano su una valvola cardiaca. Questo biofilm causa la malattia con tre meccanismi di base. In primo luogo, questa proliferazione interrompe fisicamente la funzionalità della valvola, causando perdite quando la valvola è chiusa e inducendo turbolenza e flusso diminuito quando la valvola è aperta. In secondo luogo, la proliferazione fornisce una fonte di infezione quasi continua del flusso sanguigno che persiste anche con il trattamento antibiotico. Questo provoca febbre ricorrente, infiammazione sistemica cronica e altre infezioni. In terzo luogo, i pezzi della proliferazione infetta possono staccarsi ed essere portato su un punto terminale della circolazione in cui finisce per bloccare il flusso del sangue (un processo noto come embolizzazione). Il cervello, i reni, e le estremità sono particolarmente vulnerabili agli effetti dell’ embolizzazione.

Una varietà di biofilm patogeni sono anche comunemente rintracciati sui dispositivi medici quali le protesi articolari e le valvole cardiache. Secondo Parsek, la microscopia elettronica delle superfici dei dispositivi medici che sono stati focolai d’infezioni, correlate al dispositivo, indica la presenza di un gran numero di batteri. I tessuti prelevati da infezioni croniche che non sono correlate alla presenza di dispositivi, mostrano anche la presenza di colonie di batteri inseriti in un biofilm, circondate da una matrice di esopolisaccaridi. Queste infezioni da biofilm possono essere causate da una singola specie o da una miscela di specie di batteri o funghi.

Secondo il dottor Patel della Mayo Clinic, gli individui con protesi articolari sono spesso ignari del fatto che le loro articolazioni protesiche possono portare infezioni da biofilm.

"Quando la gente pensa all’ infezione, immagina febbre o pus che esce da una ferita", spiega il dottor Patel. "Tuttavia, questo non è quello che si verifica con l'infezione da protesi articolari. I pazienti spesso sperimentano molto dolore, ma non altri sintomi che di solito sono associati con l'infezione. E nessuno pensa ai biofilm. Spesso ciò che succede è che i batteri che causano l'infezione sulle protesi articolari sono gli stessi batteri che vivono innocuamente sulla nostra pelle. Tuttavia, su una protesi articolare, dove queste colonie possono attaccarsi, e proliferare, possono davvero causare problemi nel lungo periodo."

I biofilm possono anche causare leptospirosi, una malattia grave, ma spesso trascurata, che infetta gli esseri umani attraverso l'acqua contaminata. Una nuova ricerca pubblicata nel numero di maggio della rivista Microbiology, dimostra per la prima volta come i batteri che causano la malattia della leptospirosi sopravvivono nell'ambiente.

La leptospirosi è un importante problema di salute pubblica nel sud-est asiatico e del Sud America, con oltre 500.000 casi gravi ogni anno. Tra il 5% e il 20% di questi casi sono fatali. I ratti e altri mammiferi trasportano i patogeni della Leptospira interrogans nei loro reni. Quando urinano, contaminano l'acqua di superficie con i batteri, che possono sopravvivere nell'ambiente per lunghi periodi.

"Questo ci ha portato a vedere se i batteri costruiscono un involucro protettivo intorno a loro stessi per la loro sopravvivenza," ha detto il professor Mathieu Picardeau presso l'Institut Pasteur di Parigi, Francia.

In precedenza, gli scienziati credevano i batteri fossero soltanto in forme planctoniche. Ma il professor Picardeau e il suo team hanno dimostrato che L. interrogans possono associarsi e costruire dei biofilm, che potrebbe essere uno dei principali fattori che controllano la sopravvivenza e la trasmissione della malattia. "Il 90% delle specie di Leptospira che abbiamo testato potrebbe formare dei biofilm. L. interrogans impiega una media di 20 giorni per costruire un biofilm", dice Picardeau.

I biofilm sono stati implicati in una vasta gamma di malattie veterinarie. Ad esempio, i ricercatori del Regional College della Virginia-Maryland di Medicina Veterinaria, presso Virginia Tech, hanno ricevuto una sovvenzione da parte del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti per studiare il ruolo dei biofilm nello sviluppo della Bovine Respiratory Disease Complex (BRDC). Se i biofilm svolgono un ruolo nella malattia respiratoria bovina, è probabilmente solo una questione di tempo prima che vengano individuati come causa delle malattie respiratorie umane.

Come accennato in precedenza, l'infezione dal batterio Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) è la principale causa di morte tra i pazienti con fibrosi cistica. Pseudomonas è in grado di impostare la residenza permanente nei polmoni dei pazienti con fibrosi cistica, dove, se si domanda ai ricercatori più tradizionali, è impossibile riuscire a debellarli. Infine, l’infiammazione cronica prodotta dal sistema immunitario in risposta a Pseudomonas distrugge i polmoni e provoca l’insufficienza respiratoria. Nella fase dell'infezione permanente, s’ipotizza che i biofilm di P.aeruginosa siano presenti nelle vie aeree, anche se ancora molto circa la patogenesi dell'infezione rimane poco chiaro.

La fibrosi cistica è causata da mutazioni nelle proteine dei canali che regolano il cloruro. Come questa atipicità della proteina del canale del cloro porti alla formazione dei biofilm e all’infezione rimane oggetto di accesi dibattiti. È chiaro, tuttavia, che i pazienti affetti da fibrosi cistica manifestino qualche tipo di difetto nel sistema delle difese localizzato sulla superficie delle vie aeree. In qualche modo questo porta ad un’infezione da biofilm debilitante.

I Biofilm hanno il potenziale di causare un’enorme gamma d’infezioni e di patologie

Poiché la ricerca sui biofilm patogeni interni agli organismi rappresenta un nuovo campo di studio, le infezioni sopra descritte quasi certamente rappresentano solo la punta dell'iceberg per quanto riguarda il numero di malattie croniche e le infezioni attualmente causate dai biofilm.

Ad esempio, fino al luglio del 2006 gli studiosi non si erano ancora resi conto del fatto che la maggior parte delle infezioni dell'orecchio sono causate dalla formazione di colonie di batteri raccolti in biofilm. Queste infezioni, che possono essere acute o croniche, sono definite, diffusamente, come otite media (OM). Queste sono le malattie più comuni per le quali i bambini si rivolgono al medico, ricevono antibiotici, o subiscono un intervento chirurgico negli Stati Uniti.

Ci sono due sottotipi di OM cronica. Un’otite media ricorrente (ROM) viene diagnosticata quando i bambini soffrono di infezioni ripetute in un arco di tempo durante il quale ci sono periodi di cura e remissione della patologie e recrudescenze. L’Otite Media cronica viene invece diagnosticata quando i bambini hanno un fluido persistente nelle orecchie che dura per mesi in assenza di altri sintomi, tranne che l’ipoacusia trasmissiva.

Ci sono voluti più di dieci anni per i ricercatori per rendersi conto che l'otite media è causata dai biofilm. Infine, nel 2002, Drs. Ehrlich e J. Christopher Post, uno specialista di otorinolaringoiatria pediatrica presso l’Allegheny General Hospital e direttore medico del Centro per le Scienze genomiche, ha pubblicato la prima prova della presenza dei patogeni nei biofilm nell'orecchio medio nel Journal of American Medical Association , ponendo le basi per un’indagine clinica ulteriore.

In uno studio successivo, Ehrlich e Post hanno prelevato la mucosa dell'orecchio medio - o di un tessuto a membrana – per eseguire biopsie su bambini sottoposti a trattamento per l’otite. Il team ha raccolto biopsie della mucosa non infetta da bambini e adulti sottoposti a impianto cocleare come controllo.

Attravrso l’’utilizzo del microscopio focale a scansione con laser, Luanne Sala Stoodley, Ph.D. ei suoi colleghi hanno ottenuto immagini tridimensionali delle biopsie e hanno valutato i biofilm dividendoli per morfologia osservando con le sonde macchie generiche e specie-specifiche: Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae e Moraxella catarrhalis. I versamenti, quando presenti, sono stati anche valutati per la presenza di sequenze di acido nucleico specifico patogeno (che indica la presenza di batteri vivi).

Lo studio ha trovato dei biofilm sulle mucose nelle orecchie dei bambini [46/50 bambini (92%)] con entrambe le forme di otite. I Biofilm non sono stati osservati in otto esemplari di controllo sulla mucosa dell'orecchio dei pazienti con impianto cocleare.

In realtà, tutti i bambini nello studio che soffriva di otite media cronica sono risultati positivi per biofilm nell'orecchio medio, anche coloro che erano asintomatici, inducendo Ehrlich a concludere che, "Sembra che in molti casi la malattia recidivi non a causa di re-infezioni come sia era pensato in precedenza e che costituiva fino a ieri il modello per il trattamento convenzionale, ma dalla persistenza di biofilm ".

Ehrlich insiste sul fatto che la scoperta dei biofilm, inquadrabile nella patologia delle otiti medie croniche, rappresenti "un'evoluzione, una pietra miliare nella comprensione da parte della comunità medica, di una patologia che affligge milioni di bambini in tutto il mondo, ogni anno, qualora sappia accogliere il paradigma dei biofilm come causa della patologia infettiva cronica."

Il paradigma emergente dei biofilm come causa delle malattie croniche si riferisce ad un nuovo movimento in cui i ricercatori, come Ehrlich, chiedono un enorme cambiamento nel modo in cui la comunità medica vede i biofilm batterici. Quegli scienziati che sostengono un paradigma emergente dei biofilm quali causa delle malattie croniche ritengono che la ricerca sui biofilm sia di estrema importanza a causa del fatto che le entità infettive hanno il potenziale di causare tante forme di malattia cronica.

È recente la scoperta dei ricercatori che i biofilm causino la maggior parte delle infezioni associate all'uso delle lenti a contatto. Nel 2006, Bausch & Lomb ha ritirato la sua soluzione per lenti a contatto ReNu perché un'alta percentuale delle infezioni corneali sono state associate all’uso di quel prodotto. Non è passato molto tempo prima che i ricercatori della University Hospitals Caso Medical Center abbiano scoperto che quelle infezioni sono state causate dalla creazione di biofilm.

"Una volta che [i batteri] vivono in quello stato [di biofilm], le cellule diventano resistenti alle soluzioni per le lenti e innescano una risposta autoimmune", ha detto Mahmoud A. Ghannoum, Ph.D., ricercatore senior dello studio. "Questo studio dovrebbe avvisare i portatori di lenti a contatto dell'importanza di una cura corretta anche per le lenti a contatto, proprio per proteggersi da infezioni oculari potenzialmente virulente" ha sostenuto Ghannoum.

Si è poi scoperto che i biofilm rilevati da Ghannoum e dalla sua squadra erano composti da funghi, in particolare da una specie chiamata Fusarium. Il suo team ha anche scoperto che il ceppo di funghi (con il nome accattivante, ATCC 36031) utilizzato per testare l'efficacia delle soluzioni per la cura delle lenti è un ceppo che non produce biofilm come i ceppi fungini clinici fanno spesso.

Purtroppo, Ghannoum e la sua squadra non sono stati in grado di creare un metodo per colpire e distruggere i biofilm fungini che affliggono gli utenti di quel prodotto e di alcune altre soluzioni per lenti a contatto.

Poi c'è il dottor Randall Wolcott che ha da poco scoperto e confermato che il tessuto morto che copre le ferite diabetiche è in gran parte costituito da biofilm. Mentre prima dello studio del Dott.Randal Wolcotte gli arti infetti in genere dovevano essere amputati, ora che quelle infezioni sono state correttamente collegate ai biofilm, possono essere adottate misure specifiche per fermare la diffusione dell'infezione e salvare l'arto. Allo studioso Wolcott è stata assegnata una sovvenzione da parte del National Institutes of Health per studiare ulteriormente i biofilm nell’evoluzione delle ferite croniche.

Il Dr. James Garth e l'equipe medica del Laboratorio Biofilm del Montana State University stanno anche ricercando le relazioni tra ferite e biofilm. Il loro ultimo articolo con l'immagine che mostra una ferita con biofilm era sulla copertina del gennaio-febbraio 2008 di Wound Repair and Regeneration .

Biofilm batterici e malattia infiammatoria cronica

Nel giro di pochi anni, il potenziale dei biofilm nel causare infezioni croniche debilitanti è diventato così chiaro che non vi è dubbio che i biofilm fanno parte dei mix patogeni o "miscela" che causa la maggior parte o tutte le patologie "autoimmuni" o delle malattie croniche o delle malattie infiammatorie.

Infatti, grazie, in gran parte, alla ricerca di un ricercatore biomedico, il Dr. Trevor Marshall, si è compreso che le malattie infiammatorie croniche derivano da un’infezione sostenuta da una flora microbica intestinale patogena legata nei biofilm (collettivamente denominati agenti patogeni Th1).

È ormai noto che il microbiota è composto da numerose specie batteriche, alcune delle quali devono ancora essere scoperte. Tuttavia, la maggior parte degli agenti patogeni che causano le malattie infiammatorie hanno una cosa in comune: cercano tutti i modi per eludere il sistema immunitario e per persistere come forme croniche nell'organismo che ha sviluppato modi per combattere e difendere il nostro organismo.

Alcuni batteri forme-L (delimitate solo dalla membrana plasmatica, ma ancora in grado di dividersi e moltiplicarsi) sono in grado di eludere il sistema immunitario perché, tempo fa, si sono evoluti e sono in grado di risiedere all'interno dei macrofagi, le cellule del sistema immunitario che dovrebbero uccidere gli agenti patogeni invasori. In caso di formazione, i batteri forme-L sono in grado di perdere anche le loro pareti cellulari, che li dovrebbe rendere impermeabili alla risposta immunitaria che dovrebbe rilevare gli invasori patogeni identificando le proteine sulle loro pareti cellulari. Il fatto che i batteri forme-L non abbiano pareti cellulari significa anche che gli antibiotici beta-lattamici, che lavorano sulla parete cellulare batterica, sono completamente inefficaci ad ucciderli.

Chiaramente, la trasformazione in forma L offre a qualsiasi agente patogeno un vantaggio di sopravvivenza. Ma tra questi i non patogeni non in uno stato di forma-L, quando aderiscono ad un biofilm lo fanno probabilmente per migliorare la loro capacità di eludere il sistema immunitario. Una volta che un numero sufficiente di agenti patogeni cronici si siano raggruppati e formano una comunità stabile, con una matrice protettiva forte, è probabile che possano essere in grado di risiedere in qualsiasi zona del corpo, causando nell’ospite una serie di sintomi cronici che possono essere sia di natura neurologica che fisica.

I ricercatori che si occupano di Biofilm possono anche spiegare che, non a caso, i biofilm alloggiano con maggiore facilità in un ospite immunocompromesso. Le ricerche di Marshall hanno messo in chiaro che molti dei patogeni Th1 sono in grado di creare sostanze che si legano e inattivano il recettore della vitamina D - un recettore fondamentale del corpo che controlla l'attività del sistema immunitario innato, o costituisce una prima linea del corpo per la difesa contro le infezioni intracellulari.

Così, quando i pazienti accumulano un numero maggiore di patogeni Th1, sempre più forme batteriche croniche creano sostanze capaci di disattivare il VDR. Questo provoca un effetto valanga, in cui il paziente diventa sempre più immunocompromesso, mentre acquista una carica batterica più grande.

Per prima cosa, è possibile che molti dei batteri che sopravvivono all'interno dei biofilm siano in grado di creare sostanze che bloccano VDR. Così, la formazione dei biofilm può contribuire alla disfunzione immunitaria. Viceversa, quando i pazienti acquisiscono batteri forma-L ed altre forme batteriche persistenti, capaci di creare sostanze VDR-bloccanti, diventa estremamente facile per i biofilm formarsi su qualsiasi superficie o tessuto del corpo umano.

Pertanto, i pazienti che iniziano ad acquisire batteri forme-L, quasi sempre cadono vittime di infezioni da biofilm, dal momento che è fin troppo facile per gli agenti patogeni raggrupparsi in biofilm quando il sistema immunitario non funziona.

Ad oggi, vi è anche assenza di criteri rigorosi che separano batteri di forma-L dai batteri dei biofilm o altre forme patogene croniche. Ciò significa che batteri forma-L possono formare un biofilm, e così facendo possono assicurarsi la sopravvivenza che li rende veramente impermeabili al sistema immunitario. Alcuni batteri forma-L non possono formare un biofilm completo, ma possono comunque possedere la capacità di circondarsi di una matrice protettiva. In queste circostanze si potrebbe dire che sono in uno stato di "biofilm-like".

Marshall si riferisce spesso agli agenti patogeni che causano malattie infiammatorie come “patologia batterica intra-fagocitica”, oppure “ metagenomica del microbiota batterico”, termini che suggeriscono che la maggior parte delle forme batteriche croniche possiedono proprietà di entrambi i batteri di forma-L e di biofilm. La patogenesi batterica intra-fagocitica si riferisce al fatto che gli agenti patogeni si trovano all'interno delle cellule del sistema immunitario. Il termine metagenomica indica che ci sono un numero enorme di specie diverse (ognuna con una sua peculiarità genetica) di queste forme batteriche croniche. Infine, il riferimento al microbiota chiarisce che le comunità dei biofilm sostengono la loro attività patogena.

Ad esempio, se si ha la possibilità di osservare al microscopio in campo oscuro, i batteri forma-L sono spesso racchiusi in guaine protettive di biofilm. Se il sangue contiene i patogeni le colonie batteriche raggiungono un punto in cui si espandono e scoppiano fuori dalla cella, causando la degenerazione della cellula. Poi si estendono come enormi lunghe tubuli di biofilm, che presumibilmente coadiuvano con gli agenti patogeni diffusi nelle altre cellule. Questi tubuli contribuiscono anche a diffondere il DNA batterico alle cellule vicine.

Chiaramente, vi è un grande bisogno di maggiore ricerca su come le diverse forme batteriche croniche interagiscono tra loro. Fino ad oggi, i ricercatori dei batteri forma-L sono essenzialmente concentrati unicamente sui batteri forma-L, mentre non indagano la frequenza dei patogeni mentre si formano come biofilm o diventano parti di comunità di altri biofilm con batteri con pareti cellulari. Al contrario, la maggior parte dei ricercatori di biofilm sono concentrati sullo studio del modo in cui i biofilm si sviluppano senza considerare la presenza di batteri forma-L. Quindi, è probabile che saranno necessari diversi anni prima che saremo in grado di capire meglio probabili sovrapposizioni tra gli stili di vita di batteri forma-L e biofilm.

Chi è scettico sul fatto che i biofilm possano costituire una gran parte del microbiota e che causano la malattia infiammatoria dovrebbe prendere in considerazione molti degli studi più recenti che hanno collegato le infezioni da biofilm ad un rischio più elevato per molte forme di malattia infiammatoria cronica. Prendete, per esempio, gli studi che hanno trovato un legame tra la malattia parodontale e le diverse importanti condizioni infiammatorie. Nel 1989 articolo pubblicato nel British Medical Journal ha mostrato una correlazione tra la malattia dentale e il rischio cardiovascolare (ictus, malattie cardiache, diabete). Tra tutti i fattori di età, esercizio fisico, dieta, fumo, peso, livello di colesterolo nel sangue, l'uso di alcol e l'assistenza sanitaria, le persone che hanno avuto la malattia parodontale avevano una significativamente la più alta incidenza di malattie cardiache, ictus e morte prematura. Più di recente, questi risultati sono stati confermati in studi negli Stati Uniti, Canada, Gran Bretagna, Svezia e Germania. Gli effetti sono sorprendenti. Ad esempio, i ricercatori dell’ Health Bureau canadese hanno scoperto che le persone con malattia paradontale avevano due volte più alto il rischio di morte per malattie cardiovascolari.

Poiché sappiamo che la malattia parodontale è causata dai batteri del biofilm, la spiegazione più logica per il fatto che le persone con problemi dentali abbiano molte più probabilità di soffrire di malattie cardiache e ictus è che i biofilm nelle loro bocche si sono progressivamente diffusi alle superfici umide dei loro sistemi della circolazione sanguigna. O forse se i batteri nel biofilm parodontali creano sostanze VDR vincolanti, la loro capacità di rallentare la funzione immunitaria innata permette la costituzione di nuovi biofilm (e batteri forma-L) che infettano il cuore e i vasi sanguigni più facilmente. Al contrario, l'infezione sistemica con VDR, permettendo l’aggregazione dei batteri nei biofilm ha anche la possibilità di indebolire le difese immunitarie nelle gengive e di facilitare la malattia parodontale.

In realtà, sembra che i batteri dei biofilm nella bocca facilitino anche la formazione di biofilm e batteri forma-L nel cervello. I ricercatori della Vasant Hirani presso l'University College di Londra ha pubblicato i risultati di uno studio che ha trovato che le persone anziane che hanno perso i loro denti sono a più di tre volte più a rischio di problemi di memoria e la demenza.

Al momento la Foundation Research Autoimmunity non ha fondi per coltivare i biofilm dai pazienti in trattamento e, anche se lo facesse, gli attuali metodi di coltura dei biofilm interni restano inaffidabili. Secondo Stoodley, "La mancanza di metodi standard per la coltivazione, la quantificazione e la verifica dei biofilm nei risultati di coltura continua ad avere una variabilità incalcolabile nei sistemi di laboratorio. La microbiologia dei biofilm è complessa e non è ben rappresentata da eventuali culture in vitro. Sebbene l’omogeneità consenta un'enumerazione statistica, la misura in cui i biofilm in coltura rifletta lo stato reale è discutibile".

In quale altro modo possiamo acquisire i biofilm batterici?

Come discusso finora, i biofilm si formano spontaneamente con i batteri come comunità all'interno del corpo umano insieme. Oppure, le persone possono ingerire biofilm mangiando cibo contaminato.

Secondo i ricercatori dell'Università di Guelph nell’ Ontario, in Canada, è sempre più ipotizzato che i biofilm svolgano un ruolo importante nella contaminazione delle carni durante la loro lavorazione e il confezionamento. Il gruppo avverte che debbono essere intraprese maggiori attenzioni per ridurre la presenza di agenti patogeni di origine alimentare, come Escherichia coli e Listeria monocytogenes e di altri microrganismi quali quelli della specie Pseudomonas (tutti questi sono in grado di formare dei biofilm) in tutta la catena di trasformazione alimentare, per garantire la sicurezza e la qualità del prodotto. La maggior parte di questi microrganismi sono ubiquitari nell'ambiente o si rintracciano proprio negli impianti di trasformazione veicolati tramite animali sani.

Hans Blaschek dell’ University of Illinois ha scoperto che questi microrganismi formano biofilm su gran parte dei prodotti alimentari che consumiamo tranquillamente.

"Se tu potessi vedere un pezzo di sedano che è stata ingrandito 10.000 volte, sapresti che cosa gli scienziati che combattono gli agenti patogeni di origine alimentare combattono", dice Blaschek.

"E 'come guardare un paesaggio lunare, pieno di crateri e crepe. E molti degli agenti patogeni che causano malattie a trasmissione alimentare, come Shigella, E. coli, Listeria , creano un biofilm appiccicoso, con sostanze zuccherine che creano una sorta di colla che consente a questi agenti infettivi di assumere una consistenza solida".

Secondo Blaschek, il problema dei biofilm incontrato dai produttori industriali di alimenti confezionati può costituire un triplo problema. "Se si è sfortunati abbastanza da avere a che fare con un agente patogeno e il patogeno ha le caratteristiche di essere in grado di formare biofilm, e si ha a che fare con un prodotto alimentare che è minimamente trasformato, bene, si è tre volte sfortunati," ha detto lo scienziato. "Si può essere in grado di combattere l'organismo sulle superfici, ma le cellule di questi biofilm sono molto abili ad allinearsi nelle aree più profonde."

Scott Martin, dell’ Università di Scienze dell’ Illinois e professore di nutrizione umana è d'accordo, e afferma: "Una volta che l'organismo patogeno si attacca a quel prodotto, nessun tipo di lavaggio lo rimuoverà. I microbi attaccano alla superficie dei prodotti un biofilm appiccicoso e il lavaggio da solo non serve. "

I biofilm si possono anche trovare nelle acque potabili. Uno studio, pubblicato dai ricercatori del Dipartimento di Scienze Biologiche, presso il Virginia Polytechnic Institute, ha isolato dei biofilm di M. avium dall’acqua della doccia di una donna con malattia polmonare da M. avium.

Una tecnica molecolare chiamata fingerprinting del DNA ha dimostrato che il M. avium isolato da quell'acqua era la stessa forme che causava la malattia respiratoria di quella donna.

Colpire le infezioni da biofilm

Anche se la comunità medica sta rapidamente riconoscendo un gran numero di malattie e infezioni causate dai biofilm, la maggior parte dei ricercatori sono convinti che i biofilm siano difficili o impossibili da distruggere, in particolare quelle cellule che formano gli strati più profondi dello spessore di un biofilm. La maggior parte dei documenti sui biofilm afferma che sono resistenti agli antibiotici somministrati in una modalità standard. Ad esempio, nonostante il fatto che Ehrlich e il suo team abbia scoperto che i batteri dei biofilm causino otite media, non sono in grado di offrire una soluzione efficace che sarebbe effettivamente quella di consentire la distruzione del biofilm nel canale uditivo. Altre squadre di ricercatori hanno cercato di creare diversi metodi per rompere i biofilm che costituiscono la causa di numerose infezioni.

Questo significa che i pazienti con infezioni da biofilm sono generalmente definiti dai medici tradizionali come coloro che hanno un'infezione incurabile. In alcuni casi, un biofilm patogenetico può essere reciso con tutto il tessuto sul quale si attacca ad un paziente, oppure sono stati compiuti diversi sforzi per drenare le componenti dei biofilm fuori dal corpo. Ad esempio, i medici che curano l’otite media dei pazienti con miringotomia, spesso adottano una procedura chirurgica in cui le piccole provette sono poste nel timpano per drenare continuamente il liquido infettivo.

Quando si tratta di somministrazione di antibiotici nel tentativo di combattere i biofilm, si ha una sola certezza. I ricercatori hanno ripetutamente tentato di distruggere i biofilm dando ai pazienti dosi costanti ed elevate di antibiotici. Purtroppo, quando somministrato in dosi elevate, l'antibiotico potrebbe indebolire temporaneamente i biofilm, ma essendo incapace di distruggerli, le cellule inevitabilmente persistono e permettono al biofilm di rigenerarsi (si parla di antibiotico-resistenza).

"Si può somministrare ad un paziente anche una dose elevata di antibiotici, e può sembrare che l'infezione sia scomparsa", dice Levchenko. "Ma in pochi mesi, riappare, ed è di solito in una forma resistente agli antibiotici."

Quello che la stragrande maggioranza dei ricercatori che lavora con i biofilm non riesce a capire è che gli antibiotici non sono in grado di distruggere biofilm. Il problema è che gli antibiotici sono efficaci contro i biofilm solo se somministrati in un modo molto specifico. Inoltre, solo alcuni antibiotici sembrano essere adatti contro specifici biofilm. Dopo decenni di ricerche, gran parte delle quali derivano da dati di modellistica molecolare, Marshall è stato il primo a creare un protocollo antibiotico che sembra colpire e distruggere il biofilm. Centrale al trattamento, che si chiama il Protocollo Marshall, è il fatto che i biofilm e altri agenti patogeni Th1 soccombono a specifici antibiotici batteriostatici presi a dosi molto basse, come “informazioni”. Ed è solo quando gli antibiotici vengono somministrati in questo modo che sono in grado di eradicare completamente i biofilm.

In un articolo intitolato "The Riddle of Resistance biofilm", il dottor Kim Lewis della Tulane University ha discusso i meccanismi con cui somministrando gli antibiotici a basso dosaggio questi diventano in grado di rompere i biofilm, mentre gli antibiotici somministrati in un modo standard (alti dosaggi costanti) non possono farlo. Secondo Lewis, l'uso di antibiotici pulsati, a bassissimo dosaggio, sono più efficaci e questo dato è supportato da osservazioni sue e dei suoi colleghi sui metodi che hanno utilizzato in laboratorio per combattere i biofilm batterici.

ENGLISH

The discovery, very interesting, that illuminates why it is often difficult to fight infections, comes from the observation that a large number of pathogens are grouped into communities called biofilms.

In an article titled "Bacterial Biofilms - a common cause of persistent infections," JW Costerton, of the Montana Center for Biofilm Engineering, defined a bacterial biofilm as "a structured community of bacterial cells enclosed in a self-produced and adherent polymer matrix An inert material or a living surface ".

In a nutshell, this means that bacteria can adhere together on any surface and begin to form a protective matrix around them. A sort of "ecological niche". The matrix consists of polymers - substances composed of molecules with repetitive structural units that are linked by chemical bonds.

According to the Center for Biofilm Engineering at Montana State University, a biofilm is formed when bacteria adhere to surfaces in liquid environments and begin to eject a viscous substance, a kind of "glue" that can attach them to all kinds of materials - from metals, plastic, soil particles, medical implants and, most significantly, human or animal tissue.

The first bacterial colonies that adhere to a surface initially create weak, reversible ties, called Van der Waals forces. However, if those colonies are not immediately separated from the surface to which they adhere, they can anchor more firmly using cell adhesion molecules, proteins on their surface that binds other cells in a process called "cell adhesion."

These 'bacterial pioneers' facilitate the arrival of other pathogens, providing more different adhesion sites. They also start building the matrix that holds biofilms together. If there are species that are not able to bind to a surface on their own, these are often able to anchor to the matrix or directly to previous colonies.

During colonization, things begin to get complicated. Several studies have shown that during the period of time that a biofilm is being created, pathogenic agents within the biofilm can communicate with one another through a phenomenon called quorum sensing. Although the quorum sensing mechanisms have not yet been fully understood, the phenomenon allows a single-cell bacterium to perceive how many other bacteria are in the immediate vicinity. If a bacterium can detect that it is surrounded by a densely populated population of other pathogens, it is more inclined to join them and contribute to the formation of a biofilm. They associate themselves with bacterial communities.

The bacteria that carry the quorum sensing function communicate their presence through the emission of chemical messages that their infectious agent's colleagues are able to recognize. When messages become strong enough, bacteria respond in bulk, acting as a community. A quorum sensing can occur within a single bacterial species and between different species, and can regulate a number of different processes, but essentially behaves as a communication network. A variety of different molecules can be used as signals.

"Bacteria cause the disease talking to each other with a chemical vocabulary," said Doug Hibbins of Princeton University. Dr. Bonnie Bassler, Hibbins, a graduate student at Princeton University's Microbiology Laboratory, has done a research that has finally shed light on how bacteria that cause biofilm in cholera communicate through quorum sensing.

"Forming a biofilm is one of the crucial steps in cholera progression," says Bassler. "They [the bacteria] cover themselves in a sort of 'shield' against antibiotics, so they can grow rapidly. When they feel they are in large numbers, they try to leave the body."

Although cholera bacteria use the intestines as fertile soil, after enough biofilms have been formed, planktonic bacteria within biofilms try to leave that body in order to infect a new host.

It did not take long for Bassler and his team to realize that the bacteria within the cholera biofilm should signal to everyone else that it is time for the colony to stop the reproduction and instead focus on the lens To leave that body.

"We understand that bacteria generally talk to each other with quorum sensing, but we did not know the specific chemical words that cholera use," Bassler said.

Then Higgins isolated CAI-1 - a chemical that is naturally found in cholera. Another graduate student understands how to reproduce that molecule in the lab. To moderate the level of CAI-1 in contact with cholera bacteria, Higgins has been able to chemically control the cholera's behavior in a laboratory test. His team finally confirmed that when CAI-1 is absent, cholera bacteria create and attack biofilms at their host. But when the bacteria are fed up with enough chemicals, they stop creating biofilms and release toxins, thus communicating to the bacterial community that it is time to leave that body. Thus, CAI-1 can well be the single molecule that allows cholera bacteria present within a biofilm to communicate with the bacterial support community. Although it is likely that bacteria in a cholera biofilm can communicate with other signals beyond CAI-1, the study is a good example of the fact that signaling molecules play a key role in determining the conditions of a biofilm.

Likewise, researchers at the University of Iowa (many of whom are now at the University of Washington) spent the last decade trying to identify molecules that allow P. aeruginosa bacterial species to form biofilms in the lungs of the Patients with cystic fibrosis. Although P. aeruginosa isolated from the lungs of patients with cystic fibrosis occurs in biofilm and behaves like a biofilm, until recently, there was no objective evidence available to confirm that bacterial species actually formed biofilms in Lungs of patients with the disease, and there was no way to tell what percentage of P. aeruginosa in the lungs was actually associated with biofilm mode.

"We needed a model to show that P. auruginosa in the lungs with cystic fibrosis behaved like a biofilm. This could have made us understand the P. auruginosa lifestyle," said Pradeep Singh, MD, principal author of Which is now at the University of Washington.

Singh and her colleagues finally discovered that P. aeruginosa uses one of the two quorum sensing molecules to initiate the formation of biofilms. In November 1999, his research team identified the entire bacterial genome, identifying 39 genes that are strongly controlled by the quorum-sensing system.

In a 2000 study published in Nature, Singh and colleagues developed a very sensitive test that shows the presence of P. auruginosa in the lungs with cystic fibrosis and produces some markers, precisely those quorum-sensing molecules that are the signals for the Biofilm formation.

And so it has been discovered that P. aerugnosa secures two signaling molecules, one that is long, and one that is short. Using the new test, the team was able to demonstrate that planktonic forms of P. aeruginosa produce longer signaling molecules. Alternatively, when they tested isolated P. aeruginosa strains in the lungs of patients with cystic fibrosis (which were in the form of biofilm), all the strains produced by the signaling molecules, but on the contrary, were shorter than long.

It is interesting to note that when P. aeruginosa biofilm strains were separated into single bacterial forms, those strains returned to produce longer molecule signals than shorts. The researchers asked another question: did this figure mean that a change in the length of molecular signaling could indicate whether the bacteria remained as planctonic forms or developed in biofilm?

To find out, the team took the bacteria from the crop in which they had created them and made them grow like a biofilm again. He then noted that bacterial strains in the form of biofilms produced molecules with shorter signal than long.

"The fact that P. aeruginosa [in the lungs of patients with cystic fibrosis] is producing specific signals tells us that there is a biofilm and that most P. aeruginosa in the lungs is in the biofilm state" Said Greenberg, another member of the research team. He believes that the results allow a clear biochemical definition of the state in which the bacteria are in a biofilm. Techniques similar to those used by his group will probably be used to determine the properties of other biofilm signaling molecules.

Development of biofilms

Once colonization has begun, the biofilm grows through a combination of cell division and recruitment. The final phase of biofilm formation is known as development and is the stage where biofilm stabilizes and can change shape and size. This development of a biofilm allows cells that are internally resistant to standard antibiotics. Indeed, depending on the microorganism and the type of antimicrobial and experimental system, biofilm bacteria can be up to a thousand times more resistant to the antimicrobial stress of bacteria of the same species that travel freely.

Biofilms grow slowly, in different places, and biofilm infections have long times to produce obvious symptoms. However, biofilm bacteria can move in a number of ways that allow them to easily infect new tissues. Biofilms can move collectively, sway or roll along the surface, or they break into tufts. Sometimes, in a dissemination strategy called "swarming / sowing", a biofilm colony differs to form an external "wall" of stationary bacteria, while the internal region of the biofilm "liquefies", allowing planktonic cells to "swim" out From biofilm.

Research on the molecular and genetic basis of biofilm development has made it clear that when cells move from planctonic forms to community mode, they also undergo a change in behavior that involves the alteration in the activity of many genes. There is evidence that specific genes have to be transcribed during the attack phase of biofilm development. In many cases, activation of these genes is required for the synthesis of the extracellular matrix that protects the pathogens inside.

According to Costerton, the genes that allow developing a biofilm are activated after they have reached a sufficient number of cells, such that they can bind to a solid surface. "Thus, it seems that adhesion is what stimulates the synthesis of the extracellular matrix in which the sessile bacteria are incorporated," states the molecular biologist. "This information - that bacteria have a sense of 'touch' that allows the detection of a surface and the expression of genes-specific is in itself an interesting topic of research."

Some features may also facilitate the ability of certain bacteria to form biofilms. Scientists from the Department of Microbiology and Molecular Genetics, Harvard Medical School, conducted a study in which they created a "mutant" form of bacterial species P. Aeruginosa (PA).

The mutants lacked genes coding for appendages, similar to hair, called pili. Interestingly, mutants have been able to form biofilms. Since P. Aeruginosa's pilias are involved in a type of motility called associated surface spasms, the team has suggested that this contraction may be required precisely to facilitate cell aggregation in the micro-colonies that subsequently form A stable biofilm.

Once a biofilm has officially been formed, it often contains channels where the nutrients that are indispensable to survive can circulate. Cells, in the different regions of a biofilm, also show different patterns of gene expression. Because biofilms often develop their own metabolism, they sometimes confuse with the tissues of higher organisms where contiguous cells work together to create a network where the minerals that serve the survival of those biofilms can flow.

"There is a perception of unicellular organisms of an asocial nature, but it's a wrong perception," said Andre Levchenko, assistant professor of biomedical engineering at Whiting's Engineering Faculty at Johns Hopkins University, a branch of the University Institute for Nanobiotechnologies. "When the bacteria are under stress, which is the story of their life, they team up and form this collectivity called biofilm." If you look at biofilms in nature, they have a very complicated architecture, they are like cities with their specific channels, to enter nutrients and to allow waste to come out ".

Understanding how such cooperation between pathogens evolves and remains one of the most pivotal problems in evolutionary biology. This is due to the fact that in nature, these bacteria 'tricks' to survive evolve and exploit any synergy to defend themselves until it comes to the breakup of that cooperation. So what causes bacteria to contribute and share resources in a biofilm instead of stealing them from one another? Recently, Dr. Michael Brockhurst of the University of Liverpool and colleagues at the University of Montpellier and the University of Oxford have conducted numerous studies in an attempt to understand why bacteria in a biofilm collaborate and share resources rather than fighting each other.

The team looked closer to the biofilms of P. fluorescens, biofilms that form when single cells produce a polymer that "glues" the cells together, thus allowing the colonization of liquid surfaces. While polymer production is metabolically very expensive for individual cells, the benefits of biofilm group life are offered by increased access to oxygen supplying that colony life. Still, evolutionarily speaking, such a setting allows possible "cheating" to enter the biofilm. These fake co-workers could take advantage of the protective matrix but do not help to give the energy to build the matrix. If too many "cheaters" enter a biofilm, that biofilm will eventually weaken and then break.

After several years of study, Brockhurst and his team realized that the short-term evolution of diversity within a biofilm is an important factor in understanding how its various members collaborate successfully. The team found that once inside a biofilm, P.fluorescens differs in various shapes, each of which uses several nutritional resources. The fact that these "different co-operators" do not all cooperate for the same chemicals and nutrients, substantially reduces competition for resources within the biofilm. Each one is his.

When the team of scientists manipulated the different bacterial species within experimental biofilms, he discovered that several biofilms containing few "cheaters" had produced larger groups than biofilms of the same bacterial species.

Similarly, Johns Hopkins researchers; Virginia Tech; Of the University of California, San Diego and Lund in Sweden, published the results of a study that found that once bacteria cooperate and form a biofilm, the association further improves their survival.

The team has created a new device to observe the behavior of E. coli bacteria forced to grow in confined spaces. The device, which allows scientists to use extremely small volume cells in solution, contains a series of small rooms of various shapes and sizes that keep the bacteria evenly suspended in a culture medium.

Without many surprises for the researchers, the bacteria that lived in the tight condition in the device began to form a biofilm. The team has resumed the development of biofilm in a video, and scholars have been able to observe progressive self-organization and construction of bacterial biofilm within 24 hours.

First, Andre Levchenko and Hojung Cho of Johns Hopkins recorded the behavior of individual E. coli layers using real-time microscopy. "We were surprised to find that the cells grow in narrow spaces, so they have been organized in highly regular structures," said Levchenko.

Further observations with the microscope revealed that the largest population of associated cells was living in the narrow spaces, and more orderly in its structure became the biofilm. As biofilm cells became more orderly and compact, more and more biofilms have become increasingly difficult to penetrate.

Levchenko also noted that E. coli in the form of a rod, which was too short or too long, generally did not fit well in density, the main circular linkage of the biofilm. Instead, odd odor bacteria or highly disordered cell groups were found on the edges of the biofilm, where they formed sharp edges.

Relapsing Infection Problems?

Researchers often point out that, once biofilms are stabilized, planktonic bacteria may periodically leave the biofilm on their own. When they do, they can multiply quickly and disperse into other contexts.

According to Costerton, there is a programmed natural periodic pattern of detachment of planctonic cells from biofilms. This means that biofilms can act as what Costerton calls acute infection. Since bacteria in a biofilm are protected by a matrix, the immune system of the host is less equipped to trigger a reaction against their presence.

But if planktonic bacteria are periodically released by biofilms, from time to time individual bacterial forms enter the different tissues, and then the immune system suddenly becomes aware of their presence. As a reaction the Immune System can trigger an inflammatory response that leads to intensified symptoms. Therefore, the periodic release of planktonic bacteria from some biofilms may be what causes numerous chronic recurrent infections.

As Matthew R. Parsek of Northwestern University describes in a 2003 article published in the Annual Review of Microbiology, any pathogen that survives in a chronic form benefits from keeping the guest alive.

After all, if a chronic bacterial form simply kills its host, it will no longer have a place to live. Thus, according to Parsek, chronic infection often results in a "stalemate of disease", where moderate virulence bacteria are quite contained by host defenses. Infectious agents do not actually kill the human or animal host, but the host is never able to kill the pathogens completely.

Parsek believes that the best way for bacteria to survive under such circumstances is in biofilms, saying that "growing evidence suggests that biofilm growth can play a crucial role in both of these adaptations." Biofilm growth increases resistance Of bacteria and can make those organisms visible to the immune system ... ultimately, this moderation of bacterial virulence can serve in the interests of the bacteria themselves, increasing the longevity of the host. "

Understanding biofilms as infectious entities

Perhaps because many biofilms are sufficiently dense to be visible to the naked eye, microbial communities have been among the first to be studied by early microbiologists. Anton van Leeuwenhoek scraped the teeth plaque biofilm and observed with his primitive microscope what he described as "animal" in them. However, according to Costerton and the group at the Biofilm Research Center at Montana State University, it was not possible until 1970 that scientists began to understand that bacteria in the biofilm had adopted a way of survival so as to be a very important component of Bacterial biomass in most environments. So, only around the 1980s and 1990s, scientists began to understand how bacteria could form an elaborate and organized community in biofilms.

Robert Kolter, a professor of microbiology and molecular genetics at Harvard Medical School, one of the first scientists to study how biofilms develop, states: "From the very first time studying biofilms there has been a radical revolution in previous studies."

Like most microbial genetics, Kolter had been trained in the tradition that dates back to Robert Koch and Louis Pasteur, namely that bacteriology is best conducted when studying pure strains of planktonic bacteria. "Surely this has been a huge step forward for modern microbiology, but has also distracted microbiologists from a more organismic vision of bacteria," and added: "We've all long considered that planctonic cultures were the only way to work. Yet in nature, bacteria do not live that way "..." In fact, most of them (bacteria) are organized in community sites. "

Although research on biofilms has risen in recent decades, most biofilm research has focused on external biofilms, or those that are formed on the various surfaces in our natural environment (medical equipment, prostheses, etc.). .).

In recent years, however, scientists have developed better tools for analyzing external biofilms, and soon discovered that biofilms can cause a wide range of problems in industrial environments. For example, biofilms can develop into the tubes, and this can lead to clogging and corrosion. Biofilms that are created on floors and counters can make it difficult to refresh in areas where food is prepared.

Since biofilms have the ability to clog tubes, river basins, storage areas, and contaminate foodstuffs, large farms with structures that may be negatively affected by their presence have of course received the interest in biofilm research Particularly the research that specifies how biofilms can be eliminated.

This means that many recent advances in biofilm detection are the result of collaborations between microbial ecologists, environmental engineers, and mathematicians. This research has generated new analytical tools that help scientists identify biofilms.

For example, the Canadian company FAS International Ltd has created an endolumenic brush. Doctors can use the brush to obtain samples from inside the catheter. Samples taken from the catheters can be sent to a laboratory where researchers will know if they are present in the biofilm sample. If biofilms are detected, the catheter should be replaced immediately, as catheter insertion with biofilm can lead the patient to suffer from numerous infections, some of which are potentially lethal.

Scientists now realize that biofilms are not just made up of bacteria. Almost every kind of microorganism - including viruses, fungi, and archeobacteria - have mechanisms through which they can adhere to the surfaces and to each other. Moreover, it has now become clear that biofilms are extremely different. For example, they can inhabit biofilms that form the dental plaque of more than 300 different species of bacteria.

In addition, biofilms have been found everywhere in nature, so that any traditional microbiologist can recognize that their presence is omnipresent. They can be found on rocks and pebbles on the backdrop of most streams or rivers and often form on the surface of stagnant water puddles. In fact, biofilms are important components of food chains in rivers and streams and become nourishment for fish. Biofilms also grow in the acidic pools of the Yellowstone National Park and the glaciers in Antarctica.

Paul Stoodley, of the Biofilm Center of the State University of Montana Engineering, attributes most of the delay in the biofilm study to the difficulties of working with heterogeneous biofilms compared to homogenous planktonic populations. In an article published in Nature Reviews in 2004, the molecular biologist describes many reasons why biofilms are extremely difficult to study in culture, such as the fact that the spread of liquid through a biofilm and the forces acting on a biofilm fluid must Be accurately calculated if a biofilm needs to be cultivated properly. According to Stoodley, the need to master these lab techniques so difficult has deterred many scientists from attempting to work with biofilms. [

Moreover, since much of the technology needed to detect biofilms within the body was created at the same time as the sequencing of the human genome, interest in biofilm bacteria, and research grants that would have accompanied this interest , Were largely hijacked on projects that focused on genetics. However, since genetic research has been able to find out the cause of one of the most common chronic diseases, biofilms have returned - only in recent years - in a more intensive study phase, and are now being investigated with the right attention to look for To better understand serious infectious conditions, which can cause a wide range of chronic illnesses.

In a short time, researchers who study internal biofilms have already realized that these are the cause of many chronic infections and illnesses, and the list of diseases attributed to these bacterial colonies continues to grow rapidly.

According to a public statement from the National Institutes of Health, over 65% of all microbial infections are caused by biofilm. This number may seem high, but according to Kim Lewis of the Department of Chemical and Biological Engineering at Tufts University: "If you remember that these common infections, such as urinary tract infections (caused by E. coli and other agents Pathogens), catheter infections (caused by Staphylococcus aureus and other gram-positive pathogens), middle ear infant infections (caused by Haemophilus influenzae, for example), or formation of the common dental plaque and gingivitis , Which are all disorders caused by biofilms, are difficult to treat or are frequently recurrent, this hypothesis seems very realistic. "

As Lewis quotes, perhaps the most thoroughly studied biofilms are the ones that make up the dental plaque. "Plaque is a biofilm on the tooth surfaces," says Parsek. "This build-up of microorganisms puts teeth and gingival tissues at high concentrations of bacterial metabolites that translate into dental pathologies."

It has also recently shown that biofilms are present on the removed tissue of 80% of patients undergoing chronic sinusitis surgery. According to Parsek, biofilms can also cause osteomyelitis, an illness in which bone and bone marrow can be infected. This is confirmed by the fact that microscopy studies have shown the formation of biofilms on bone-infected human surfaces and experimental animal models. Parsek also assumes a role of biofilms in chronic prostatitis as microscopy studies have also documented the presence of biofilm on the surface of the prostate duct. Microbes that colonize tissue fibers and vaginal swabs can also form biofilms, causing inflammation and diseases such as toxic shock syndrome.

Biofilms can also cause kidney stones formation. Aggregates of mineral salts that cause kidney stones cause diseases obstructing the urine flow and producing inflammation and recurrent infections that may end up leading to kidney failure. About 15% -20% of kidney stones occur in the context of urinary tract infections. According to Parsek, these aggregations of mineral salts are produced by the interaction between the bacteria that infect and the mineral substrates derived from the urine. This interaction translates into a complex biofilm composed of bacteria, bacterial toxin production, and crystallized mineral salts.

Perhaps the first mention of the role of bacteria in the formation of these calculations was made in 1938, when Hellstrom examined the calculations that expelled his patients and found inbuilt bacteria inside. The microscopic analysis of surgically removed calculations by infected patients revealed elements that characterize the growth of biofilms. First, bacteria on the surface and inside the calculations are organized in micro-colonies and surrounded by a crystallized mineral matrix.

Then there is endocarditis, a disease that causes inflammation of the inner layers of the heart. Primary infectious lesion in endocarditis is a complex biofilm consisting of two bacterial components found on a cardiac valve. This biofilm causes the disease with three basic mechanisms. First, this proliferation physically interrupts the functionality of the valve, causing leaks when the valve is closed and inducing turbulence and decreased flow when the valve is open. Secondly, proliferation provides a source of almost constant infection of the blood stream that persists even with antibiotic treatment. This causes recurrent fever, chronic systemic inflammation and other infections. Third, the pieces of infected proliferation can detach itself and be brought to a terminal end point where it ends to block blood flow (a process known as embolization). The brain, kidneys, and extremities are particularly vulnerable to the effects of embolization.

A variety of pathogenic biofilms are also commonly tracked on medical devices such as joint prostheses and heart valves. According to Parsek, the electronic microscopy of the surfaces of medical devices that were the outbreak of infection, related to the device, indicates the presence of a large number of bacteria. Chronic tissue infections that are not related to the presence of devices also show the presence of colonies of bacteria inserted in a biofilm, surrounded by an exopolysaccharide matrix. These biofilm infections can be caused by a single species or mixture of bacterial or fungi species.

According to Dr. Patel of the Mayo Clinic, individuals with joint prostheses are often unaware of the fact that their prosthetic joints can lead to biofilm infections.

"When people think of infection, imagine a fever or pus that comes out of a wound," explains Dr. Patel. "However, this is not what happens with joint prosthesis infection. Patients often experience a lot of pain, but no other symptoms that are usually associated with infection, and no one thinks about biofilm. That bacteria that cause joint-prosthesis infection are the same bacteria that are harmless to our skin. However, on a joint prosthesis, where these colonies can attack and proliferate, they can really cause problems in the long run. "

Biofilms can also cause leptospirosis, a serious but often neglected disease that infects humans through contaminated water. A new research published in the May issue of Microbiology magazine shows for the first time that bacteria that cause leptospirosis disease survive in the environment.

Leptospirosis is an important public health problem in Southeast Asia and South America with over 500,000 serious cases every year. Between 5% and 20% of these cases are fatal. Rats and other mammals carry the pathogens of the Leptospira interrogans in their kidneys. When they urinate, they contaminate surface water with bacteria, which can survive in the environment for long periods of time.

"This has led us to see if bacteria build a protective enclosure around themselves for their survival," said Professor Mathieu Picardeau at the Institut Pasteur in Paris, France.

Previously, scientists believed the bacteria were only in planktonic form. But Professor Picardeau and his team have shown that L. interrogans can associate and build biofilms, which could be one of the main factors controlling the survival and transmission of the disease. "90% of the Leptospira species we have tested may be biofilm. L. interrogans takes an average of 20 days to build a biofilm," says Picardeau.

Biofilms have been implicated in a wide range of veterinary illnesses. For example, researchers at Virginia Tech's Virginia-Maryland Regional College researchers at Virginia Tech received a grant from the US Department of Agriculture to study the role of biofilms in the development of Bovine Respiratory Disease Complex (BRDC) . If biofilms play a role in bovine respiratory disease, it is probably only a matter of time before they are identified as a cause of human respiratory illness.

As mentioned earlier, infection by Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) bacterium is the leading cause of death among patients with cystic fibrosis. Pseudomonas is able to set permanent residency in the lungs of patients with cystic fibrosis, where, if asked to more traditional researchers, it is impossible to succeed in eradicating them. Finally, the chronic inflammation produced by the immune system in response to Pseudomonas destroys the lungs and causes respiratory failure. In the phase of permanent infection, it is hypothesized that P. aeruginosa biofilms are present in the airways, although much still remains unclear about the pathogenesis of the infection.

Cystic fibrosis is caused by mutations in the protein of the chloride-regulating channels. As this atypicality of chlorine channel protein leads to biofilm formation and infection remains the subject of heated debates. It is clear, however, that patients with cystic fibrosis manifest some kind of defect in the defense's system located on the airway surface. Somehow this leads to a debilitating biofilm infection.

Biofilms have the potential to cause a huge range of infections and pathologies

Since research into pathogenic biofilms into organisms represents a new field of study, the infections described above almost certainly represent only the tip of the iceberg with regard to the number of chronic diseases and infections currently caused by biofilms.

For example, until July 2006, scholars had not yet realized that most of the ear infections were caused by the formation of bacterial colonies collected in biofilms. These infections, which may be acute or chronic, are defined, broadly, as otitis media (OM). These are the most common diseases for children to turn to the doctor, receive antibiotics, or undergo surgery in the United States.

There are two subtypes of chronic OM. A recurrent middle age (ROM) is diagnosed when children are suffering from repeated infections over a period of time during which there are periods of cure and remission of pathologies and recurrences. Chronic Otitis media is diagnosed when children have persistent ears in the ears that last for months without any other symptoms, except hypoacusia transmitting.

It took more than ten years for researchers to realize that the otite media is caused by biofilms. Finally, in 2002, Drs. Ehrlich and J. Christopher Post, a pediatric otolaryngology specialist at the Allegheny General Hospital and medical director of the Genome Science Center, published the first evidence of the presence of pathogens in biofilms in the middle ear in the Journal of American Medical Association, Laying the groundwork for further clinical investigation.

In a subsequent study, Ehrlich and Post have taken the middle ear mucosa - or membrane tissue - to biopsies on children undergoing treatment for otitis. The team has collected non-infected mucosa biopsies from children and adults undergoing cochlear implantation as a control.

Using the laser scanning focal microscope, Luanne Sala Stoodley, Ph.D., and his colleagues obtained three-dimensional biopsies and evaluated biofilms by dividing them by morphology by observing generic and species-specific spots: Haemophilus Influenzae, Streptococcus pneumoniae and Moraxella catarrhalis. Spills, when present, were also evaluated for the presence of specific pathogenic nucleic acid sequences (indicating the presence of live bacteria).

The study found biofilm on mucous membranes in the ears of children [46/50 children (92%)] with both forms of otitis. Biofilms were not observed in eight specimens on the ear mucosa of patients with cochlear implant.

In fact, all the children in the chronic media otitis media were positive for biofilms in the middle ear, even those who were asymptomatic, inducing Ehrlich to conclude that, "In many cases, recurrent illness does not appear to be due to kills -infections as it was previously thought and which constituted the model for conventional treatment until today, but by the persistence of biofilm. "

Ehrlich insists that the discovery of biofilms, which is a cornerstone of the chronic mediocre otitis, is "an evolution, a milestone in understanding the medical community, of a disease that afflicts millions of children worldwide every year if he knows the biofilm paradigm as a cause of chronic infectious disease. "

The emerging paradigm of biofilms as a cause of chronic diseases refers to a new movement in which researchers, such as Ehrlich, ask for a huge change in the way the medical community sees bacterial biofilms. Those scientists who support an emerging paradigm of biofilms as a cause of chronic illness believe that biofilm research is of the utmost importance because infectious entities have the potential to cause many forms of chronic disease.

Researchers recently discovered that biofilms cause most of the infections associated with the use of contact lenses. In 2006, Bausch & Lomb withdrew its ReNu contact lens solution because a high percentage of corneal infections were associated with the use of that product. It was not long before researchers at the University Hospitals Case Medical Center discovered that those infections were caused by the creation of biofilms.

"Once [the bacteria] live in that [biofilm] state, cells become resistant to lens solutions and trigger an autoimmune response," said Mahmoud A. Ghannoum, Ph.D., senior researcher at the study. "This study should alert contact lenses of the importance of proper cure for contact lenses, just to protect themselves against potentially virulent eye infections," Ghannoum said.

It was then discovered that the biofilms detected by Ghannoum and its team were composed of fungi, in particular by a species called Fusarium. His team also found that the fungi strain (with the catching name, ATCC 36031) used to test the efficacy of lens care solutions is a strain that does not produce biofilms such as clinical fungal strains often do.

Unfortunately, Ghannoum and his team have been unable to create a method to strike and destroy fungal biofilms that afflict users of that product and some other contact lens solutions.

Then there is Dr. Randall Wolcott who has recently discovered and confirmed that dead tissue covering diabetic wounds is largely biofilm. While before the Dr. Wolcotte's study, infected limbs would have to be amputated, now that those infections have been properly linked to biofilms, specific measures can be taken to stop the spread of infection and save the limb. Wolcott has been awarded a grant by the National Institutes of Health to further study biofilms in the evolution of chronic wounds.

Dr. James Garth and the Biofilm Laboratory at Montana State University are also researching the relationship between wounds and biofilm. Their latest article with an image showing a wound with biofilm was on the cover of January-February 2008 of Wound Repair and Regeneration.

Bacterial Biofilms and Chronic Inflammatory Disease

Within a few years, the potential of biofilms in causing debilitating chronic infections has become so clear that there is no doubt that biofilms are part of the pathogen or "mixture" mix that causes most or all "autoimmune" or Chronic illnesses or inflammatory diseases.

In fact, thanks largely to the research of a biomedical researcher, Dr. Trevor Marshall, it was understood that chronic inflammatory diseases are caused by an infection sustained by a pathogenic microbial pathogenic flora bound in biofilms (collectively referred to as Th1 pathogens ).

It is now known that the microbiota is made up of numerous bacterial species, some of which still need to be discovered. However, most pathogenic agents that cause inflammatory diseases have one thing in common: they seek all ways to circumvent the immune system and to persist as chronic forms in the body that has developed ways to fight and defend our body.

Some form-L bacteria (delineated only from the plasma membrane, but still able to divide and multiply) are able to evade the immune system because, over time, have evolved and are able to reside within macrophages, Cells of the immune system that should kill invading pathogens. In the case of formation, the L-Form bacteria can also lose their cell walls, which should make them waterproof to the immune response that should detect pathogenic invaders by identifying proteins on their cell walls. The fact that the L-Forms bacteria do not have cell walls also means that beta-lactam antibiotics, working on the cellular cell wall, are completely ineffective to kill them.

Clearly, L-shaped transformation offers any pathogen an advantage of survival. But among these, non-pathogens not in a state of form-L, when they adhere to a biofilm, they are likely to improve their ability to elude the immune system. Once a sufficient number of chronic pathogens have clustered and formed a stable community with a strong protective matrix, they are likely to be able to reside in any area of the body causing the host to experience a series of chronic symptoms that Can be both neurological and physical.

Researchers dealing with Biofilm may also explain that biofilms are by far the easiest way to accommodate an immunocompromised host. Marshall's research has made it clear that many of the Th1 pathogens are able to create substances that bind and inactivate the vitamin D receptor - a fundamental body receptor that controls the innate immune system's activity or is a first line Of the body for defense against intracellular infections.

Thus, when patients accumulate more Th1 pathogens, more and more chronic bacterial forms create substances capable of deactivating VDR. This causes an avalanche effect, in which the patient becomes increasingly immunocompromised while acquiring a larger bacterial charge.

First, it is possible that many of the bacteria that survive within the biofilm can create substances that block VDR. Thus, the formation of biofilms can contribute to immune dysfunction. Conversely, when patients acquire form-L bacteria and other persistent bacterial forms capable of creating VDR-blockers, it becomes extremely easy for biofilms to form on any surface or tissue of the human body.

Therefore, patients who are beginning to acquire L-form bacteria almost always fall victim to biofilm infections, since it is far too easy for pathogens to group into biofilm when the immune system does not work.

To date, there is also no strict criteria separating L-shaped bacteria from biofilm bacteria or other chronic pathogenic forms. This means that form-L bacteria can form a biofilm, and thus they can secure the survival that makes them truly waterproof to the immune system. Some form-L bacteria can not form a complete biofilm, but may still have the capability to surround a protective matrix. In these circumstances one might say that I am in a "biofilm-like" state.

Marshall often refers to pathogenic agents that cause inflammatory diseases such as "intra-phagocytic bacterial pathology", or "bacterial microbiotic metagenomics", terms that suggest that most chronic bacterial forms possess properties of both L-shaped and Of biofilm. Intra-phagocytic bacterial pathogenesis refers to the fact that pathogenic agents are within the immune system's cells. The metagenomic term indicates that there are a huge number of different species (each with its own genetic peculiarity) of these chronic bacterial forms. Finally, the reference to the microbiota clarifies that biofilm communities support their pathogenic activity.

For example, if you have the chance to observe the dark microscope, the L-form bacteria are often enclosed in biofilm protective sheaths. If the blood contains the pathogens the bacterial colonies reach a point where they expand and break out of the cell, causing cell degeneration. Then they stretch as huge long biofilm tubules, which presumably co-serve with the pathogenic agents spread in the other cells. These tubules also contribute to spreading bacterial DNA to nearby cells.

Clearly, there is a great need for more research into how different chronic bacterial forms interact with each other. To date, form-L bacteria researchers are essentially focused solely on form-L bacteria, while not investigating the frequency of pathogens as they are formed as biofilms or become part of communities of other biofilms with cell-wall bacteria. In contrast, most biofilm researchers are focused on the study of how biofilms develop without considering the presence of L-form bacteria. So, it is likely that it will take several years before we will be able to better understand likely overlaps between life-forms of L-formic and biofilms.

Those who are skeptical of the fact that biofilms can account for a large part of the microbial and cause inflammatory disease should consider many of the latest studies that have linked biofilm infections at a higher risk for many forms of chronic inflammatory disease. Take, for example, studies that have found a link between periodontal disease and various important inflammatory conditions. In 1989 the article published in the British Medical Journal showed a correlation between dental disease and cardiovascular risk (stroke, heart disease, diabetes). Among all age factors, exercise, diet, smoking, weight, blood cholesterol level, alcohol use, and health care, people who had periodontal disease had significantly the highest incidence of illnesses Heart attacks, stroke and premature death. More recently, these findings have been confirmed in studies in the United States, Canada, Great Britain, Sweden and Germany. The effects are amazing. For example, Canadian Health Bureau researchers have found that people with periodontal disease had twice the risk of death for cardiovascular disease.

Since we know that periodontal disease is caused by biofilm bacteria, the more logical explanation for the fact that people with dental problems are much more likely to suffer from heart disease and stroke is that biofilms in their mouths have progressively spread to the surfaces Dampened by their bloodstream systems. Or maybe if bacteria in periodontal biofilms create binding VDR substances, their ability to slow down the innate immune function allows the formation of new biofilms (and L-Form B) that will inflict the heart and blood vessels more easily. In contrast, systemic VDR infection, allowing bacterial aggregation in biofilms, also has the potential to weaken immune defenses in the gums and to facilitate periodontal disease.

In fact, biofilm bacteria in the mouth seem to facilitate the formation of biofilms and form-L bacteria in the brain. Vasant Hirani's researchers at the University College of London published the results of a study that found older people who lost their teeth were more than three times more at risk of memory problems and dementia.

At the moment Foundation Research Autoimmunity has no funds to cultivate biofilms from treatment patients, and even if it does, current methods of growing biofilms remain unreliable. According to Stoodley, "The lack of standard methods for cultivating, quantifying and verifying biofilms in culture results continues to have incalculable variability in laboratory systems. Biofilm microbiology is complex and is not well represented by any cultures in Although homogeneity allows statistical enumeration, the extent to which biofilms in culture reflect the real state is questionable. "

In what way can we acquire bacterial biofilms?

As discussed so far, biofilms form spontaneously with bacteria as a community within the human body together. Or, people can ingest biofilm by eating contaminated food.

According to researchers from the University of Guelph in Ontario, Canada, it is increasingly hypothesized that biofilms play an important role in contamination of meat during their processing and packaging. The group notes that more attention needs to be paid to reducing the presence of pathogenic food-borne agents such as Escherichia coli and Listeria monocytogenes and other micro-organisms such as those of the Pseudomonas species (all of which are capable of forming biofilms) throughout the chain Food processing, to ensure the safety and quality of the product. Most of these microorganisms are ubiquitous in the environment or they are traced to processing plants transported through healthy animals.

Hans Blaschek of the University of Illinois found that these microorganisms make biofilm on most of the food we consume quietly.

"If you could see a piece of celery that was magnified 10,000 times, you know what scientists fighting food-borne pathogens are fighting," Blaschek says.

"It's like looking at a lunar landscape full of craters and cracks, and many of the pathogenic agents that cause foodborne illnesses such as Shigella, E. coli, Listeria, create a sticky biofilm with sugary substances that create a kind of glue Which allows these infectious agents to take on a solid consistency. "

According to Blaschek, the problem of biofilms encountered by industrial manufacturers of packaged foods can be a triple problem. "If you are unlucky enough to have to deal with a pathogen and the pathogen has the characteristics of being able to form biofilm, and it has to do with a food that is minimally transformed, well, you are three times Unlucky, "said the scientist. "You may be able to fight the body on the surfaces, but the cells of these biofilms are very capable of aligning themselves in the deepest areas."

Scott Martin, of the University of Illinois Sciences and professor of human nutrition agrees, and states: "Once the pathogen attacks the product, no type of washing will remove it. Microbes attach to the surface Of the products a sticky biofilm and washing alone does not serve. "

Biofilms can also be found in drinking water. A study, published by researchers at the Department of Biological Sciences at the Virginia Polytechnic Institute, isolated M. avium biofilm from the shower water of a woman with M. avium lung disease.

A molecular technique called DNA fingerprinting has shown that M. avium isolated from that water was the same form that caused the respiratory illness of that woman.

Hitting Biofilm Infections

Although the medical community is rapidly recognizing a large number of diseases and infections caused by biofilms, most researchers are convinced that biofilms are difficult or impossible to destroy, especially those cells that form deeper layers of the thickness of a biofilms. Most biofilm documents claim they are resistant to antibiotics administered in standard mode. For example, despite the fact that Ehrlich and his team have discovered that biofilms bacteria cause otitis media, they are unable to offer an effective solution that would actually allow the destruction of biofilm in the auditory canal. Other research teams have tried to create different methods to break biofilms that are the cause of many infections.

This means that patients with biofilm infections are generally defined by traditional doctors such as those who have an incurable infection. In some cases, a pathogenetic biofilm can be cut off with any tissue attached to a patient, or several efforts have been made to drain biofilm components out of the body. For example, doctors taking care of the average otitis of miringotomy patients often take a surgical procedure where small tubes are placed in the eardrum to continuously drain infectious fluid.

When it comes to administering antibiotics in an attempt to combat biofilms, there is only one certainty. Researchers have repeatedly attempted to destroy biofilms by giving patients consistent and high doses of antibiotics. Unfortunately, when given at high doses, the antibiotic may temporarily weaken the biofilm, but being unable to destroy them, the cells inevitably persist and allow the biofilm to regenerate (it is about antibiotic resistance).

"A high dose of antibiotics can also be given to a patient, and it may seem that the infection has disappeared," says Levchenko. "But in a few months, it reappears, and is usually in a form resistant to antibiotics."

What the vast majority of researchers working with biofilms can not understand is that antibiotics are not able to destroy biofilm. The problem is that antibiotics are effective against biofilms only when administered in a very specific way. In addition, only some antibiotics seem to be suitable against specific biofilms. After decades of research, most of which derive from molecular modeling data, Marshall was the first to create an antibiotic protocol that seems to hit and destroy biofilm. The treatment center, called the Marshall Protocol, is the fact that biofilms and other pathogenic Th1 agents succumb to specific low-dose bacteriostatic antibiotics, such as "information". And it is only when antibiotics are given this way that they are able to completely eradicate biofilms.

In an article titled "The Riddle of Resistance Biofilm", Dr. Kim Lewis of Tulane University discussed the mechanisms by which administering antibiotics at low doses these become able to break biofilms while antibiotics administered in a standard way (high Constant doses) can not do it. According to Lewis, the use of pulsed, low dosage antibiotics is more effective and this is supported by his and colleagues' comments on the methods they have used in the laboratory to combat bacterial biofilms.

Da:

http://www.letiziabernardi.it/index.php?option=com_content&view=article&id=240:la-scoperta-dei-biofilm&catid=8&Itemid=106

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La scoperta dei biofilm / The discovery of biofilms

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