Understanding T Cell Phenotype and Function to Enable Improved Therapeutics / Comprensione del fenotipo e della funzione delle cellule T per consentire una migliore terapia

 Understanding T Cell Phenotype and Function to Enable Improved Therapeutics / Comprensione del fenotipo e della funzione delle cellule T per consentire una migliore terapia

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa /  Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Introduction 

The human immune system is made up of a complex network of cells that provide continuous surveillance for anything that is non-self, such as bacteria or viruses. There are two main branches—innate and adaptive immunity—that serve different functions, but work together to overcome the different challenges the body may face. Innate immune cells are responsible for the initial response, rapidly recognizing the antigen, and generating a proinflammatory response to quickly and efficiently contain it. This includes the recruitment of macrophages, neutrophils, monocytes and dendritic cells, which in turn stimulates cells in the adaptive immunity pathway to multiply and differentiate to overcome the specific infection. This adaptive branch is mainly made up of the thymus-derived lymphocytes (T lymphocytes) and bone-marrow-derived lymphocytes (B lymphocytes), and its roles include the elimination of foreign species, the formation of immunological memory, and ensuring tolerance to self-antigens. Natural killer cells (NK cells) lie in between the two branches, as they possess some qualities of both.

Modulation of T Cells in Novel Therapies

 T cells are vital for pathogen elimination and tumor immunosurveillance, and the body is capable of producing an array of specialized T cells that provide unique responses to the diverse spectrum of tumor cells and pathogens (viruses, bacteria, and parasites) that are capable of penetrating host defenses. Upon elimination of a tumor or pathogen, the majority of adaptive cells die, and memory cells are formed to provide a rapid response should recurrence or reinfection occur. The immune system therefore relies on a fine balance of pathways to regulate immune activation and immune suppression in order to maintain homeostasis. Too much suppression can reduce host tumor immunosurveillance, allowing oncogenic cells to proliferate uncontrollably, while over-activation of the immune system can lead to autoimmune diseases . The modulation of T cells is an exciting prospect for the development of novel therapies for both immuno-oncology—where increasing T cell function may provide a clinical benefit—and autoimmune applications, where suppressing activation is desired. Additionally, modulating T cell receptors (TCRs) and their associated signaling pathways may be of clinical relevance to many further therapeutic areas, such as adoptive cell therapy or vaccine development.

 Immuno-Oncology 

In the past, cancer treatment was limited to surgery, chemotherapy and radiotherapy, but there have been a number of recent advances in this field and immunotherapy—using the body’s immune system against tumors—has become a promising area for research. Several of these novel cancer treatments target T cell inhibitory receptors, including cytotoxic T lymphocyte associated antigen  (CTLA-4) and programmed cell death  (PD-1), both of which are immune checkpoints that help inhibit immune response. In individuals with cancer, overexpression of molecules that bind to these and other inhibitory receptors suppresses the immune system, allowing cancer cells to proliferate without threat. Targeting of these inhibitory receptors with anti-CTLA-4 and antiPD-1 monoclonal antibodies blocks the interaction between the molecule and its receptor, reducing immunosuppression, and has been shown to be beneficial in a number of cancer types . There are nearly 40 kinase inhibitors (KIs) targeting early signaling events during T cell activation already approved by the FDA for use in oncology applications, plus a further 250 or so in clinical trials . Further to this, other key areas of current research include producing chimeric antigen receptor (CAR) T cells— which are raised against over-expressed receptors on the surface of target cells known as tumor associated antigens (TAAs)—or engineering TCR T cells against neoantigens, which can provide an efficient, patientspecific approach to drive cancer immunity. 

Autoimmunity

 In contrast to the events seen in tumor cells, increased activation and TCR signaling are both major factors in autoimmune disease. Therapeutic approaches that inhibit T cell activation, proliferation and viability, therefore, offer clinical potential . For example, expression of the transcription factor FOXP3 by regulatory T cells has been observed to suppress immune responses and, in the absence of this transcription factor, autoimmunity arises . Heightened T cell kinase activity is also associated with autoimmunity, and KIs are already used for the treatment of a number of diseases, such as rheumatoid arthritis . 

Stages in T Cell Biology 

Thorough evaluation of T cell phenotype and function is critical to understanding their cell biology and building better therapeutics. There has been huge progress over recent years in the characterization of the T cell family, especially from advances in DNA and RNA sequencing . This characterization and evaluation of different T cell subtypes is ongoing, and is contributing to further discoveries in this field.

Subtypes 

‘T cell’ is an overarching term to describe the function of these immune cells, however, there are multiple subtypes with very distinctive roles. Determining the differences and similarities between these cell populations is vital to understand the roles they could play in therapeutics. The two main types of T cells—cytotoxic (TC) and helper (TH)—can be broken down into further subtypes, and there are also additional populations, such as invariant natural killer T (iNKT) cells, and mucosal associated invariant T (MAIT) cells. TC cells are programmed to kill infected cells and tumors, while TH cells produce cytokines and chemokines that recruit and activate other immune cell subsets at areas of infection. TH cells can be split into numerous subsets that are specialized for different effector functions. The main subsets are TH1 (respond to virus and intracellular bacteria), TH2 (parasites), TH17 (extracellular bacteria and fungi), TH9, T follicular helper cells (TFH), and regulatory T cells (TREG). T cells recognize pathogens by binding with antigen presenting cells (APCs) that process foreign proteins and display antigens complexed with major histocompatibility complexes (MHCs) on their cell surface, where it can interact with TCRs. The recognition of pathogens by APCs leads to the release of cytokines that cause the genetic differentiation of T cells into specific subsets, allowing them to effectively respond to and eliminate the pathogen. For instance, interferon (IFN)-α/β and IL-12 cytokines are generated in response to many viruses, and induce the expression of the transcription factor T-bet, causing T cells to differentiate into the TH1 subset2 . Increased or decreased activity of these TH cell subsets, and the balance between different subset levels, has been linked with different disease states; TH1, TH9 and TH17 are linked to autoimmunity, while TH2 is associated with asthma and other allergies. For instance, TH1 and TH2 cells cross-regulate one another, and TH1 | TH2 imbalance with TH2 dominance can lead to secondary infections, viral reactivations or an inability to clear the initial infection, and is also seen in sepsis. To help maintain this delicate balance, TREG cells control T cell proliferation and cytokine production. As would be expected, TREG cells reduce the chances of autoimmunity by suppressing inflammatory processes, but abnormal functioning of TREG cells is also associated with some tumors . The modulation of different subtypes of T cells, therefore, has therapeutic potential for a range of disease states, making it crucial to identify the most effective points in T cell biology to target. 

Activation

 T cells emerge from the thymus in a resting, naïve state (TN cells), unable to produce any kind of immune response. 

Activation from this naïve state—principally via the TCR pathway—is therefore critical for their proliferation and programming to the correct subtype. This is achieved through a complex series of interactions between the T cell and an APC. The TCR cannot bind antigens directly, and must be presented with broken-down antigen peptides by the APC using the CD3 receptor and MHC molecules. There are two types of MHC: class I molecules present antigens to the CD8 co-receptor on TC cells, while MHC class II interacts with the CD4 co-receptor on TH cells2 . There is also costimulation through a number of other membrane proteins complexes. Binding of antigen-presenting MHC molecules to CD4 | CD8 allows transduction of the signal into the cytosol of the T cell, inducing IL-2 production and secretion and T cell proliferation, resulting in full T cell activation . 

Killing 

CD8+ TC cells play a primary role in the cytotoxic elimination of infected or cancerous cells, and can interact with almost every cell in the body. Binding with MHC1 triggers the killer function of these cells, with three major mechanisms to kill infected or malignant cells. The primary method is the calcium-dependent release of cytotoxic granules containing perforin and granzyme B into the cytosol of a target cell . Perforin polymerizes to form transmembrane pores in cell membranes, while granzymes initiate an enzyme cascade, with both actions leading to apoptosis. A second method is the secretion of anti-tumor or anti-viral cytokines—mainly TNF-α and IFN-γ—which are normally delivered into the cytosol of the infected cell. The last method is through FasL molecules on activated TC cells binding to the Fas receptor on target cells. This activates the caspase pathway, initiating apoptosis of the target cell . 

Memory 

Following the primary response and the termination of a foreign body, an extreme decline in the T cell population occurs. At this point, some T cells differentiate into memory T cells that have an ability to ‘remember’ the foreign body they played a role in removing, with a half-life of around 8–15 years. These cells are divided into two main subsets— central memory (TCM) and effector memory (TEM) cells2 —and can be activated more easily, with increased proliferative potential, for a more rapid response. TEM cells have a rapid effector function—producing granzyme B and IFN-γ—but limited proliferation, and control initial exposure to the reinfection or reemergence of the foreign body. TCM cells display an increased proliferation potential following antigen reencounter, but require more time to proliferate and induce the production of more effector cells that can eliminate the target. While these two subsets give a broad overview, memory cells show a huge plasticity, and should be seen as a spectrum rather than two distinct classes, offering huge potential for the development of T cell therapies. 

Exhaustion 

One hurdle that T cells can face is exhaustion, a hyporesponsive state first identified in mice with chronic infections, and later witnessed in humans with cancer. It is now understood that the majority of T cells differentiate into exhausted T cells in a hostile tumor microenvironment (TME)—an immunosuppressive network of cancer cells, inflammatory cells, stromal cells and cytokines that restricts T cell activation and induces T cell dysfunction. This hostile microenvironment includes immunosuppressive factors—such as vascular endothelial growth factor, transforming growth factor-β (TGF-β) and indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO)—released by tumor cells, and regulatory immunosuppressive cells that are recruited into the tumor, such as TREG cells and myeloidderived suppressor cells (MDSC) . Exhausted T cells show overexpression of inhibitory receptors, including lymphocyte activation gene protein (LAG-3), PD-1, T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein  (TIM-3), CTLA-4, band T lymphocyte attenuator (BTLA) and T cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domain (TIGIT) . They also have reduced production of cytokines, a slower rate of proliferation and lower cytotoxicity, all of which leads to cancer evading the immune system. Therapeutic interventions to reverse this exhausted state by blocking inhibitory receptors, therefore, have the potential to restore anti-tumor mechanisms, and represent a promising strategy to treat cancer, with clinical trials already ongoing. 

A Role for Advanced Flow Cytometry

 Understanding the processes controlling the activation, activity, and exhaustion of T cells at the molecular level is fundamental to the identification and validation of novel immunotherapies, creating a need for assays to accurately profile T cell function and health. Immunoassays provide powerful tools to qualify and quantify T cells in both a research and clinical setting, but traditional methods—such as enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs)—only allow the measurement of one parameter or analyte per well. In contrast, flow cytometry can be used to study a wide range of T cell-related applications, from assessing intracellular cytokine production, cellular proliferation and cell viability, to analyzing the cell cycle, rare events, and immunophenotyping. In addition to analyzing intact cells, this approach can be used to measure extracellular analytes of interest, by combining analyte-specific beads with fluorescent detection antibodies. A variety of distinct fluorescent dyes can be used to provide a unique signature for each analyte, allowing multiple parameters to be assessed in a single experiment. Advanced flow cytometry with the iQue®  platform provides a robust, high throughput solution for multiplexed studies of T cells. The iQue®  streamlines the flow cytometry workflow, allowing fast sample acquisition in both 96- and 384-well microplate formats, with the ability to connect to automation systems for multiple plate loading—making it ideal for automated, high content applications. Combined with the four of our T cell characterization assay kits (T Cell Activation Cell and Cytokine Profiling Kit (TCA Kit), Human T Cell Mediated Killing Kit, Human T Cell Exhaustion Cell and Cytokine 

 T cell activation markers, cell proliferation, cell viability and secreted cytokines, enabling up to 30 uniqueanalytes to be measured in a single sample . Our T Cell Companion Kits can also be used in combination with the TCA kit and other human T cell immunology kits to measure additional cytokines. This supports a variety of T cell workflows, including antibody screening, functional profiling and cell line development, assessing multiple cell parameters faster, and with fewer cells and less reagents. In addition, it offers the ability to perform high-content phenotypic screening for drug discovery, making it well suited to primary immune cell screening and target identification with siRNA and CRISPR. The case studies discussed here demonstrate the power of using an advanced flow cytometry approach for research on T cell moderation.

Future Developments

 Understanding the regulation of T cells and their interactions with pathogens or tumor cells is now enabling the development of immunotherapies with high clinical efficacy. The ability to target specific subtypes allows better selectivity or function for the treatment of certain pathologies, and opens up more avenues for engineering immune cells to treat more disease states. For instance, γδ T cells—which have TCRs composed of gamma and delta chains, instead of alpha and beta chains seen in other T cells—have been noted to play a significant role in a number of pathologies, interacting with an array of other immune and non-immune cells to affect host responses to infection, injury or malignancy, as well as having a role in allergic and autoimmune diseases. Controlling human γδ T cell activation has been shown to accelerate pathogen clearance and tissue repair from infections, as well as to improve disease stabilization or promote tumor regression in patients with malignancies, as these cells are able to rapidly produce cytokines such as IFN-γ, TNF-α, IL-17. Unfortunately, the mode of action of the γδ TCR—and its role in the development and triggering of effector functions—is not well understood, especially due to differences displayed between mouse and human cells. This lack of understanding limits translation of research into the clinical setting, and demonstrates the need to increase T cell subtype understanding.

Expanding this approach even further to the study of other immune cell types—such as natural killer cells and macrophages—offers additional options for the design of new immunotherapeutic approaches. This is highlighted in the field of oncology, where there is still huge demand for new and improved therapies that can effectively treat a broader range of cancers. Approaches such as tumorassociated APC (tAPC)-reprogramming nanoparticles offer enormous potential, genetically reprogramming cancer cells so that they can act as tAPCs. These particles have already demonstrated cell-mediated cytotoxic immune responses with systemic effects in both in vitro and in vivo studies, by inducing activation of TC cells. Monoclonal antibodies are also a popular choice for the development of novel immunotherapies, and T cell characterization could help to improve future treatments. Other cells, such as MAIT cells, have been identified to play a protective role in infections, with cell numbers seen to increase in the lungs and other affected tissues of patients with Mycobacterium tuberculosis (TB). It is thought that these cells actively migrate to the site of inflammation, as MAIT cell numbers are often lower in the blood of patients suffering from inflammatory diseases— such as Crohn’s disease, multiple sclerosis and rheumatoid arthritis—but increased in inflamed tissue.

Summary 

Furthering our understanding of T cell subtypes, and their phenotypes and functions, is imperative to continue the development of new and improved therapeutic approaches. This will undoubtedly require rapid and reliable profiling of T cell activation and function on a large scale, and advanced flow cytometry offers enormous potential for the characterization, evaluation, and discovery of new modulators for regulating T cell function. The iQue® 3 advanced flow cytometry platform provides a rapid, high throughput solution to the study or monitoring of T cell function and phenotype, as well as to help identify early biomarkers or perform serological characterizations. This technology is equally relevant to a range of other techniques within T cell immunology, including T cell bioengineering with CRISPR | Cas9. The method offers a rapid, robust, and convenient solution for characterization of cellular responses, and is ideal for assisting in the development of new immunological therapies.

ITALIANO

Introduzione

Il sistema immunitario umano è costituito da una complessa rete di cellule che forniscono una sorveglianza continua per tutto ciò che non è auto, come batteri o virus. Ci sono due rami principali - immunità innata e adattativa - che svolgono funzioni diverse, ma lavorano insieme per superare le diverse sfide che il corpo può affrontare. Le cellule immunitarie innate sono responsabili della risposta iniziale, riconoscono rapidamente l'antigene e generano una risposta proinfiammatoria per contenerlo rapidamente ed efficacemente. Ciò include il reclutamento di macrofagi, neutrofili, monociti e cellule dendritiche, che a sua volta stimola le cellule nel percorso dell'immunità adattativa a moltiplicarsi e differenziarsi per superare l'infezione specifica. Questo ramo adattativo è costituito principalmente dai linfociti derivati ​​dal timo (linfociti T) e dai linfociti derivati ​​dal midollo osseo (linfociti B), ed i suoi ruoli includono l'eliminazione di specie estranee, la formazione della memoria immunologica e la garanzia della tolleranza a auto-antigeni. Le cellule natural killer (cellule NK) si trovano tra i due rami, poiché possiedono alcune qualità di entrambi.

Modulazione dei linfociti T in nuove terapie

Le cellule T sono vitali per l'eliminazione dei patogeni e la sorveglianza immunitaria del tumore e il corpo è in grado di produrre una serie di cellule T specializzate che forniscono risposte uniche al diverso spettro di cellule tumorali e patogeni (virus, batteri e parassiti) in grado di penetrare difese dell'ospite. Dopo l'eliminazione di un tumore o di un patogeno, la maggior parte delle cellule adattive muore e le cellule della memoria si formano per fornire una risposta rapida in caso di recidiva o reinfezione. Il sistema immunitario si basa quindi su un sottile equilibrio di percorsi per regolare l'attivazione immunitaria e la soppressione immunitaria al fine di mantenere l'omeostasi. Una soppressione eccessiva può ridurre l'immunosorveglianza del tumore ospite, consentendo alle cellule oncogene di proliferare in modo incontrollabile, mentre un'eccessiva attivazione del sistema immunitario può portare a malattie autoimmuni. La modulazione dei linfociti T è una prospettiva entusiasmante per lo sviluppo di nuove terapie sia per l'immuno-oncologia - dove l'aumento della funzione delle cellule T può fornire un beneficio clinico - sia per le applicazioni autoimmuni, dove si desidera l'attivazione della soppressione. Inoltre, i recettori modulanti delle cellule T (TCR) e le loro vie di segnalazione associate possono essere di rilevanza clinica per molte altre aree terapeutiche, come la terapia cellulare adottiva o lo sviluppo di vaccini.

Immuno-oncologia

In passato, il trattamento del cancro era limitato alla chirurgia, alla chemioterapia e alla radioterapia, ma ci sono stati una serie di recenti progressi in questo campo e l'immunoterapia, utilizzando il sistema immunitario del corpo contro i tumori, è diventata un'area promettente per la ricerca. Molti di questi nuovi trattamenti contro il cancro prendono di mira i recettori inibitori delle cellule T, tra cui l'antigene associato ai linfociti T citotossici (CTLA-4) e la morte cellulare programmata (PD-1), entrambi checkpoint immunitari che aiutano a inibire la risposta immunitaria. Negli individui affetti da cancro, la sovraespressione di molecole che si legano a questi e ad altri recettori inibitori sopprime il sistema immunitario, consentendo alle cellule tumorali di proliferare senza minacce. L'obiettivo di questi recettori inibitori con anticorpi monoclonali anti-CTLA-4 e antiPD-1 blocca l'interazione tra la molecola e il suo recettore, riducendo l'immunosoppressione e ha dimostrato di essere utile in numerosi tipi di cancro. Ci sono quasi 40 inibitori della chinasi (KIs) che prendono di mira eventi di segnalazione precoce durante l'attivazione delle cellule T già approvati dalla FDA per l'uso in applicazioni oncologiche, più altri 250 circa negli studi clinici. Oltre a questo, altre aree chiave dell'attuale ricerca includono la produzione di cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR) - che vengono sollevate contro i recettori sovraespressi sulla superficie delle cellule bersaglio noti come antigeni associati al tumore (TAA) - o l'ingegnerizzazione di cellule T TCR contro neoantigeni, che possono fornire un approccio efficiente e specifico per il paziente per guidare l'immunità contro il cancro.

Autoimmunità

Contrariamente agli eventi osservati nelle cellule tumorali, l'aumento dell'attivazione e la segnalazione del TCR sono entrambi fattori principali nella malattia autoimmune. Gli approcci terapeutici che inibiscono l'attivazione, la proliferazione e la vitalità delle cellule T, quindi, offrono un potenziale clinico. Ad esempio, è stato osservato che l'espressione del fattore di trascrizione FOXP3 da parte delle cellule T regolatorie sopprime le risposte immunitarie e, in assenza di questo fattore di trascrizione, si manifesta l'autoimmunità. L'accresciuta attività della chinasi delle cellule T è anche associata all'autoimmunità e gli IS sono già utilizzati per il trattamento di una serie di malattie, come l'artrite reumatoide.

Fasi della biologia delle cellule T.

La valutazione approfondita del fenotipo e della funzione delle cellule T è fondamentale per comprendere la loro biologia cellulare e costruire terapie migliori. Negli ultimi anni sono stati compiuti enormi progressi nella caratterizzazione della famiglia delle cellule T, soprattutto grazie ai progressi nel sequenziamento del DNA e dell'RNA. Questa caratterizzazione e valutazione di diversi sottotipi di cellule T è in corso e sta contribuendo a ulteriori scoperte in questo campo.

Sottotipi

"Cellula T" è un termine generale per descrivere la funzione di queste cellule immunitarie, tuttavia, esistono più sottotipi con ruoli molto distintivi. Determinare le differenze e le somiglianze tra queste popolazioni di cellule è fondamentale per comprendere i ruoli che potrebbero svolgere nella terapia. I due tipi principali di linfociti T, citotossici (TC) e helper (TH), possono essere suddivisi in ulteriori sottotipi e ci sono anche popolazioni aggiuntive, come le cellule T (iNKT) natural killer invarianti e le cellule T invarianti associate alla mucosa ( MAIT) cellule. Le cellule TC sono programmate per uccidere le cellule infette ed i tumori, mentre le cellule TH producono citochine e chemochine che reclutano e attivano altri sottoinsiemi di cellule immunitarie nelle aree di infezione. Le cellule TH possono essere suddivise in numerosi sottoinsiemi specializzati per diverse funzioni effettrici. I sottogruppi principali sono TH1 (rispondono a virus e batteri intracellulari), TH2 (parassiti), TH17 (batteri e funghi extracellulari), TH9, cellule T helper follicolari (TFH) e cellule T regolatorie (TREG). I linfociti T riconoscono i patogeni legandosi con le cellule presentanti l'antigene (APC) che elaborano proteine ​​estranee e mostrano antigeni complessati con i principali complessi di istocompatibilità (MHC) sulla loro superficie cellulare, dove possono interagire con i TCR. Il riconoscimento di agenti patogeni da parte degli APC porta al rilascio di citochine che causano la differenziazione genetica delle cellule T in sottoinsiemi specifici, consentendo loro di rispondere efficacemente ed eliminare l'agente patogeno. Ad esempio, le citochine dell'interferone (IFN) -α / β e IL-12 sono generate in risposta a molti virus e inducono l'espressione del fattore di trascrizione T-bet, facendo differenziare le cellule T nel sottoinsieme TH12. L'aumento o la diminuzione dell'attività di questi sottoinsiemi di cellule TH e l'equilibrio tra i diversi livelli di sottoinsiemi sono stati collegati a diversi stati di malattia; TH1, TH9 e TH17 sono collegati all'autoimmunità, mentre TH2 è associato all'asma e ad altre allergie. Ad esempio, le cellule TH1 e TH2 si regolano reciprocamente. Lo squilibrio di TH2 con dominanza di TH2 può portare a infezioni secondarie, riattivazioni virali o incapacità di eliminare l'infezione iniziale, ed è anche visto nella sepsi. Per aiutare a mantenere questo delicato equilibrio, le cellule TREG controllano la proliferazione delle cellule T e la produzione di citochine. Come ci si aspetterebbe, le cellule TREG riducono le possibilità di autoimmunità sopprimendo i processi infiammatori, ma anche il funzionamento anormale delle cellule TREG è associato ad alcuni tumori. La modulazione di diversi sottotipi di cellule T, quindi, ha un potenziale terapeutico per una serie di stati patologici, rendendo cruciale identificare i punti più efficaci nella biologia delle cellule T da prendere di mira.

Attivazione

Le cellule T emergono dal timo in uno stato di riposo e ingenuo (cellule TN), incapaci di produrre alcun tipo di risposta immunitaria.

L'attivazione da questo stato ingenuo, principalmente tramite il percorso TCR, è quindi fondamentale per la loro proliferazione e programmazione nel sottotipo corretto. Ciò si ottiene attraverso una complessa serie di interazioni tra la cellula T e un APC. Il TCR non può legarsi direttamente agli antigeni e deve essere presentato con peptidi di antigeni scomposti dall'APC utilizzando il recettore CD3 e le molecole MHC. Esistono due tipi di MHC: le molecole di classe I presentano antigeni del co-recettore CD8 sulle cellule TC, mentre l'MHC di classe II interagisce con il co-recettore CD4 sulle cellule TH2. C'è anche la costimolazione attraverso una serie di altri complessi di proteine ​​di membrana. Legame delle molecole MHC che presentano l'antigene al CD4 | Il CD8 consente la trasduzione del segnale nel citosol delle cellule T, inducendo la produzione e la secrezione di IL-2 e la proliferazione delle cellule T, con conseguente attivazione completa delle cellule T.

Uccidere

Le cellule CD8 + TC svolgono un ruolo primario nell'eliminazione citotossica delle cellule infette o cancerose e possono interagire con quasi tutte le cellule del corpo. Il legame con MHC1 innesca la funzione killer di queste cellule, con tre meccanismi principali per uccidere le cellule infette o maligne. 

Il metodo principale è il rilascio calcio-dipendente di granuli citotossici contenenti perforina e granzima B nel citosol di una cellula bersaglio. La perforina polimerizza per formare pori transmembrana nelle membrane cellulari, mentre i granzimi iniziano una cascata enzimatica, con entrambe le azioni che portano all'apoptosi. 

Un secondo metodo è la secrezione di citochine antitumorali o antivirali, principalmente TNF-α e IFN-γ, che vengono normalmente rilasciate nel citosol della cellula infetta. 

L'ultimo metodo è attraverso molecole FasL su cellule TC attivate che si legano al recettore Fas sulle cellule bersaglio. Questo attiva la via delle caspasi, avviando l'apoptosi della cellula bersaglio.

Memoria

A seguito della risposta primaria e della cessazione di un corpo estraneo, si verifica un estremo calo della popolazione di cellule T. A questo punto, alcune cellule T si differenziano in cellule T della memoria che hanno la capacità di "ricordare" il corpo estraneo che hanno svolto un ruolo nella rimozione, con un'emivita di circa 8-15 anni. Queste cellule sono divise in due sottoinsiemi principali - cellule di memoria centrale (TCM) e memoria effettrice (TEM) 2 - e possono essere attivate più facilmente, con un maggiore potenziale proliferativo, per una risposta più rapida. Le cellule TEM hanno una funzione effettrice rapida, producendo granzima B e IFN-γ, ma con una proliferazione limitata e controllano l'esposizione iniziale alla reinfezione o alla ricomparsa del corpo estraneo. Le cellule TCM mostrano un potenziale di proliferazione aumentato in seguito al reincontro dell'antigene, ma richiedono più tempo per proliferare e indurre la produzione di più cellule effettrici in grado di eliminare il bersaglio. Sebbene questi due sottoinsiemi offrano un'ampia panoramica, le cellule di memoria mostrano un'enorme plasticità e dovrebbero essere viste come uno spettro piuttosto che come due classi distinte, offrendo un enorme potenziale per lo sviluppo di terapie con cellule T.

Esaurimento

Un ostacolo che le cellule T possono affrontare è l'esaurimento, uno stato di iporesponsività identificato per la prima volta nei topi con infezioni croniche e successivamente osservato negli esseri umani con cancro. È ormai chiaro che la maggior parte delle cellule T si differenziano in cellule T esauste in un microambiente tumorale ostile (TME), una rete immunosoppressiva di cellule tumorali, cellule infiammatorie, cellule stromali e citochine che limita l'attivazione delle cellule T e induce la disfunzione delle cellule T. Questo microambiente ostile include fattori immunosoppressivi, come il fattore di crescita endoteliale vascolare, il fattore di crescita trasformante-β (TGF-β) e l'indoleamina 2,3-diossigenasi (IDO), rilasciati dalle cellule tumorali e le cellule immunosoppressive regolatorie che vengono reclutate nel tumore , come le cellule TREG e le cellule soppressori di derivazione mieloide (MDSC). Le cellule T esaurite mostrano una sovraespressione dei recettori inibitori, inclusa la proteina del gene di attivazione dei linfociti (LAG-3), PD-1, dominio dell'immunoglobulina delle cellule T e proteina del dominio della mucina (TIM-3), CTLA-4, attenuatore dei linfociti della banda T (BTLA) e Immunoglobulina a cellule T e dominio del motivo inibitorio basato sulla tirosina immunorecettore (TIGIT). Hanno anche una ridotta produzione di citochine, un tasso di proliferazione più lento e una citotossicità inferiore, il che porta al cancro che elude il sistema immunitario. Gli interventi terapeutici per invertire questo stato di esaurimento bloccando i recettori inibitori, quindi, hanno il potenziale per ripristinare i meccanismi antitumorali e rappresentano una strategia promettente per il trattamento del cancro, con studi clinici già in corso.

Un ruolo per la citometria a flusso avanzata

La comprensione dei processi che controllano l'attivazione, l'attività e l'esaurimento delle cellule T a livello molecolare è fondamentale per l'identificazione e la convalida di nuove immunoterapie, creando la necessità di analisi per profilare accuratamente la funzione e la salute delle cellule T. I dosaggi immunologici forniscono potenti strumenti per qualificare e quantificare le cellule T sia in ambito di ricerca che clinico, ma i metodi tradizionali, come i saggi di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), consentono solo la misurazione di un parametro o analita per pozzetto. Al contrario, la citometria a flusso può essere utilizzata per studiare un'ampia gamma di applicazioni relative alle cellule T, dalla valutazione della produzione di citochine intracellulari, la proliferazione cellulare e la vitalità cellulare, all'analisi del ciclo cellulare, eventi rari e immunofenotipizzazione. Oltre ad analizzare le cellule intatte, questo approccio può essere utilizzato per misurare gli analiti extracellulari di interesse, combinando sfere specifiche dell'analita con anticorpi di rilevamento fluorescenti. È possibile utilizzare una varietà di coloranti fluorescenti distinti per fornire una firma univoca per ogni analita, consentendo la valutazione di più parametri in un singolo esperimento. La citometria a flusso avanzata con la piattaforma iQue®  fornisce una soluzione robusta e ad alto rendimento per gli studi multiplex dei linfociti T. L'iQue®  semplifica il flusso di lavoro della citometria a flusso, consentendo una rapida acquisizione del campione in entrambi i formati di micropiastre da 96 e 384 pozzetti, con la possibilità di connettersi a sistemi di automazione per il caricamento di più piastre, rendendolo ideale per applicazioni automatizzate ad alto contenuto. In combinazione con i quattro dei nostri kit di analisi di caratterizzazione delle cellule T (cellula T di attivazione e kit di profilo delle citochine (kit TCA), kit di uccisione mediata da cellule T umane, cellula di esaurimento delle cellule T umane e citochina  Da naïve (TN) a memoria di cellule staminali (TSCM) a memoria centrale (TCM) a memoria di transizione (TTM) a memoria effettrice (TEM) a effettore terminale (TTE ) Cellule T fino alla morte cellulare. 

 Marcatori di attivazione delle cellule T, proliferazione cellulare, vitalità cellulare e citochine secrete, che consentono di misurare fino a 30 analiti univoci in un singolo campione. I nostri kit T Cell Companion possono anche essere utilizzati in combinazione con il kit TCA e altri kit immunologici di cellule T umane per misurare ulteriori citochine. Ciò supporta una varietà di flussi di lavoro delle cellule T, inclusi lo screening degli anticorpi, il profilo funzionale e lo sviluppo della linea cellulare, la valutazione di più parametri cellulari più velocemente e con meno cellule e meno reagenti. Inoltre, offre la capacità di eseguire uno screening fenotipico ad alto contenuto per la scoperta di farmaci, rendendolo adatto allo screening delle cellule immunitarie primarie e all'identificazione del bersaglio con siRNA e CRISPR. I casi di studio discussi qui dimostrano la potenza dell'utilizzo di un approccio avanzato di citometria a flusso per la ricerca sulla moderazione delle cellule T.

Sviluppi futuri

 La comprensione della regolazione dei linfociti T e delle loro interazioni con agenti patogeni o cellule tumorali sta ora consentendo lo sviluppo di immunoterapie ad alta efficacia clinica. La capacità di indirizzare sottotipi specifici consente una migliore selettività o funzione per il trattamento di determinate patologie e apre più strade per l'ingegneria delle cellule immunitarie per il trattamento di più stati di malattia. Ad esempio, è stato osservato che i linfociti T γδ, che hanno TCR composti da catene gamma e delta, invece di catene alfa e beta osservate in altre cellule T, giocano un ruolo significativo in una serie di patologie e cellule non immunitarie per influenzare le risposte dell'ospite a infezioni, lesioni o malignità, oltre ad avere un ruolo nelle malattie allergiche e autoimmuni. È stato dimostrato che il controllo dell'attivazione delle cellule T γδ umane accelera l'eliminazione dei patogeni e la riparazione dei tessuti dalle infezioni, nonché migliora la stabilizzazione della malattia o promuove la regressione del tumore nei pazienti con tumori maligni, poiché queste cellule sono in grado di produrre rapidamente citochine come IFN-γ, TNF-α, IL-17. Sfortunatamente, la modalità di azione del γδ TCR - e il suo ruolo nello sviluppo e nell'attivazione delle funzioni effettrici - non è ben compreso, soprattutto a causa delle differenze mostrate tra le cellule del topo e quelle umane. Questa mancanza di comprensione limita la traduzione della ricerca nel contesto clinico e dimostra la necessità di aumentare la comprensione dei sottotipi di cellule T.

Espandere ulteriormente questo approccio allo studio di altri tipi di cellule immunitarie, come le cellule natural killer e i macrofagi, offre ulteriori opzioni per la progettazione di nuovi approcci immunoterapeutici. Ciò è evidenziato nel campo dell'oncologia, dove c'è ancora un'enorme richiesta di terapie nuove e migliorate in grado di trattare efficacemente una più ampia gamma di tumori. Approcci come le nanoparticelle di riprogrammazione di APC (tAPC) associate al tumore offrono un potenziale enorme, riprogrammando geneticamente le cellule tumorali in modo che possano agire come tAPC. Queste particelle hanno già dimostrato risposte immunitarie citotossiche cellulo-mediate con effetti sistemici in studi sia in vitro che in vivo, inducendo l'attivazione delle cellule TC. Gli anticorpi monoclonali sono anche una scelta popolare per lo sviluppo di nuove immunoterapie e la caratterizzazione delle cellule T potrebbe aiutare a migliorare i trattamenti futuri. Altre cellule, come le cellule MAIT, sono state identificate per svolgere un ruolo protettivo nelle infezioni, con un aumento del numero di cellule nei polmoni e in altri tessuti colpiti dei pazienti con Mycobacterium tuberculosis (TB). Si pensa che queste cellule migrino attivamente verso il sito dell'infiammazione, poiché il numero di cellule MAIT è spesso inferiore nel sangue dei pazienti affetti da malattie infiammatorie - come il morbo di Crohn, la sclerosi multipla e l'artrite reumatoide - ma è aumentato nei tessuti infiammati.

Riassunto

Approfondire la nostra comprensione dei sottotipi di cellule T e dei loro fenotipi e funzioni è fondamentale per continuare lo sviluppo di approcci terapeutici nuovi e migliorati. Ciò richiederà indubbiamente un profilo rapido e affidabile dell'attivazione e della funzione delle cellule T su larga scala e la citometria a flusso avanzata offre un enorme potenziale per la caratterizzazione, la valutazione e la scoperta di nuovi modulatori per la regolazione della funzione delle cellule T. La piattaforma avanzata di citometria a flusso iQue®  fornisce una soluzione rapida e ad alto rendimento per lo studio o il monitoraggio della funzione e del fenotipo delle cellule T, nonché per aiutare a identificare i biomarcatori precoci o eseguire caratterizzazioni sierologiche. Questa tecnologia è ugualmente rilevante per una serie di altre tecniche all'interno dell'immunologia delle cellule T, inclusa la bioingegneria delle cellule T con CRISPR | Cas9. Il metodo offre una soluzione rapida, robusta e conveniente per la caratterizzazione delle risposte cellulari ed è ideale per assistere nello sviluppo di nuove terapie immunologiche.

Da:

https://offers.the-scientist.com/hubfs/downloads/TS/Sartorius/TS_PPL_Sartorius_T%20Cell_White%20Paper/Understanding-T-Cell-White-Paper-en-L.pdf?hsCtaTracking=78ba9876-ab76-407f-99d3-7c6556114882%7Cbdd7b779-9541-445c-a554-8cb79626105b