USING ISOTHERMAL TITRATION CALORIMETRY TO CHARACTERIZE ENZYME KINETICS / UTILIZZO DELLA CALORIMETRIA DELLA TITOLAZIONE ISOTERMICA PER CARATTERIZZARE LA CINETICA ENZIMATICA

 USING ISOTHERMAL TITRATION CALORIMETRY TO CHARACTERIZE ENZYME KINETICS / UTILIZZO DELLA CALORIMETRIA DELLA TITOLAZIONE ISOTERMICA PER CARATTERIZZARE LA CINETICA ENZIMATICA

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

 Principles 

Enzymes are proteins that function as biological catalysts, which play crucial roles in the biochemical processes that occur in living organisms.  Understanding how enzymes function, and how to activate or inhibit their activity, is a core research focus for biochemists. Since many drug targets are enzymes, the development of new therapies requires understanding of how the target enzyme binds and catalyzes its natural substrate. Several drugs are therapeutic enzymes, which are injected into the patient to treat genetic disorders characterized by missing or defective enzymes. Enzymes are also important in other industries including food science, biofuels, and detergents. Although enzymes were discovered in the mid-1800s, isolated and purified since the early 20th century, and cloned and expressed in recombinant systems since the 1970s, there is a continued need for efficient and detailed enzyme analysis to exploit the potential of enzyme-driven catalytic reactions. New enzymes are also being discovered. Reliable enzyme kinetics data are crucial to understand and control enzyme effectiveness and create next-generation drugs. Isothermal titration calorimetry (ITC) techniques have been successfully applied to study enzyme kinetics and inhibition. ITC is a well-established, versatile technique that is widely used for measuring reaction thermodynamics.  In this review, we discuss how ITC generates real-time, enzyme kinetics data, comparable to other enzyme assays. 

Understanding enzyme behavior and kinetics When an enzyme interacts with its substrate, it forms an enzyme-substrate complex. This complex gets converted to the transition state, the transition state complex is then transformed into an enzyme-product complex, which finally dissociates to give product and free enzyme. 

The mathematical definition of KM means that it effectively quantifies the affinity of binding between the enzyme and its substrate when product formation is the rate-limiting step. The lower the KM, the lower the concentration of substrate required to achieve a given rate. 

This makes KM a valuable metric for comparing the performance of different enzymatic systems and for: 

Establishing the approximate concentrations of intracellular substrates 

Comparing the performance of enzyme isoforms from different organisms or tissues

 Comparing the performance of native and recombinant forms of enzymes

 Identifying strategies for ligand-induced enzyme activity modification 

Most enzymes are now expressed as recombinant proteins, and their associated substrates can usually be produced in a similar way or chemically synthesized. With both components in place, the challenge is to identify an efficient assay for detailed study of the reaction. 

In systems where the substrate or product is detectable by a spectrophotometer, continuous assays are performed by adding the enzyme to solutions of different substrate concentrations and monitoring the resulting product formation or decreasing substrate concentration.

 Early in the assay, when the amount of substrate is in excess over the enzyme, the observed rate is linear with time and is referred to as the initial rate or velocity. 

Plotting initial velocity vs. substrate concentration results in a Michaelis-Menten curve that can be used to determine KM and Vmax. 

This type of assay provides a powerful bioanalytical tool that is used to characterize native and engineered enzymes.  

In many instances, the product or substrate does not have a convenient chromophore.

 Even if one product can be monitored spectroscopically, synthesized substrate analogues may not have such features. 

When designing substrate analogues in order to probe enzyme mechanism one should only have to consider the chemistry of the catalytic reaction rather than issues around performing assays. 

The latter can often complicate design strategies since the inclusion of a chromophore can be cumbersome, time consuming and expensive. An alternative is a discontinuous assay, by mixing enzyme and substrate using stopped flow or quench flow techniques. 

The reaction proceeds for different times before quenching using a pH jump or a temperature change. The amount of formed product or remaining substrate in the reaction is quantified using mass spectrometry or chromatography. 

These are specialized techniques that are often very useful for measuring fast kinetics or isolating intermediates. However, for routine analysis these methods can be time consuming and expensive, since multiple experiments are needed to generate a single Michaelis-Menten plot. 

 There are also coupled enzymatic assays, where the product of enzymatic catalysis of interest is the substrate for a second assay. Sometimes these assays require multiple steps.

 The final product is then monitored by a continuous or discontinuous assay. Even with these options, it is not always possible or straightforward to measure changes in substrate or product concentration in tradition assays, because:

Opaque or turbid solutions interfere with spectrophotometric detection. Native, recombinant and/or mutant enzyme activity is below the detection limit of the assay.

 Either the substrate or product does not have a chromophore, and it is too costly or time-consuming to label them. Discontinuous assays require multiple steps.

 No straightforward coupled reaction exists. 

Coupled assays introduce inaccuracies and are difficult to troubleshoot.

 Substrate/enzymatic activity is unknown. Protein function is unknown. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) is a powerful and versatile technique that is widely used for measuring the binding affinity and thermodynamics of equilibrium association reactions. 

ITC is also an accepted, universal labelfree assay technique that can be applied to any enzyme-catalyzed system, provided that the reaction is associated with a change in enthalpy.

 ITC does not rely on a spectrophotometer, and the experiments are quick – ITC data for a Michaelis-Menten curve can be generated in 30 -90 minutes with current instrumentation - and only small amounts of material are required, making it an appealing alternative for enzyme kinetics and inhibition assays. 

ITC for enzyme kinetics 

ITC measures enzyme kinetic parameters because the thermal power generated as the reaction proceeds is a direct and sensitive observable event. The use of ITC to measure the heat generated during an enzymatic reaction is a wellestablished assay. The rate of an enzymatic reaction is directly proportional to the thermal power, defined as the heat (Q) produced as a function of time: 

 Power = dQ/dt. 

 A typical experiment has the substrate in the ITC injection syringe, and enzyme in the ITC cell. After the substrate is added to the enzyme, there is a reaction which either takes in or releases heat, triggering a heat change in the ITC cell. 

The data generated shows a spike with a positive or negative area associated with each injection.  ITC directly measures dQ/dt after the injection of substrate, at different substrate concentrations. The change in thermal power is represented by a change in the Y axis position of the raw ITC data, compared to the Y axis position for a control titration where there is no enzymatic reaction.

Versatility of ITC for enzyme kinetics assays 

ITC has been used to characterize most classes of enzymes. 

Todd and Gomez and Bianconi discuss the use of ITC to characterize almost every class of enzyme. Other examples include: β-glucosidase and other cellulases and enzymes which have important roles in efficiently breaking down cellulose in biomass  

 Na+,K+-ATPase 

  Xylinases

  Carbapenem-hydrolyzing class D β-lactamases  

Gingipain K (hydrolyzes IgG)

 Cyclic nucleotide phosphodiestases 

Trypsin  

Choline sulfatase 

 Lysosomal enzyme and other therapeutic enzymes  

Human salivary α-amylase. Human soluble epoxide hydrolase.

 Kinases  

A typical experiment for enzyme kinetics has the enzyme in the ITC cell and substrate in the ITC syringe.

 It is also helpful if there is some indication of approximate KM so that appropriate substrate concentrations can be used to yield a complete Michaelis-Menten curve with some points of the curve below KM and some above it. 

 Typical enzyme and substrate concentrations for ITC enzyme assays are in the range of spectroscopic assays. Enzyme in the ITC cell is in the sub-nanomolar to micromolar range (the higher the KM value, the higher the concentration needed). 

The required concentration is often less than that used for traditional ITC protein-ligand binding assays.  Substrate in the syringe is in the micromolar to millimolar range and is higher than the KM value.  

Enzyme kinetics parameters will vary due to salt, pH, etc. 

In order to avoid excessive heats of dilution it is necessary to dialyze the enzyme in the chosen buffer and then use the same buffer to make up the substrate solution.  

There are two methods that can be used to measure enzyme kinetic parameters with ITC: the multiple-injection method, which uses pseudo-first order conditions, and the continuous assay/single injection method, which uses a single injection of substrate into enzyme. 

  Multiple-injection method ITC experiments for enzyme kinetics reactions are commonly conducted this way, with multiple injections of the substrate generating multiple rate determinations under pseudo-first order steady-state conditions in a single ITC titration experiment.  

The rate data can be obtained by having relatively low amounts of enzyme in the ITC cell, relatively high amounts of substrate in the injection syringe and by leaving shorter gaps between injections. The aim here is to ensure that subsequent to each injection, steady-state conditions are maintained and no more than 5% of the injected substrate is depleted prior to the next injection. 

In addition, it is also necessary a control where the identical solutions of substrate used in enzyme assays are injected into the reaction buffer. 

 Methods

 Introduction Isothermal Titration Calorimetry (ITC) is a powerful and versatile technique that is widely used for measuring the binding affinity and thermodynamics of equilibrium association reactions.

 ITC is also an accepted, universal label-free assay technique that can be applied to any enzyme-catalyzed system, provided that the reaction is associated with a change in enthalpy – see the companion whitepaper and other review articles. 

ITC does not rely on a spectroscopic readout and labeled reagents, and the experiments are quick – ITC data for a Michaelis-Menten curve can be generated in 30 -90 minutes with current instrumentation – and only small amounts of material are required, making it an appealing alternative for enzyme kinetics and inhibition assays. 

Preparation of enzyme and substrate 

A typical experiment for enzyme kinetics has the enzyme in the ITC cell and substrate in the ITC syringe.

 It is necessary to accurately quantify the molar concentration of both enzyme and substrate.

 This is most conveniently done using spectroscopic means where the reactants have chromophores and experimentally determined or calculated molar extinction coefficients. 

Biochemists often express amounts of protein in terms of activity units, where 1 unit of an enzyme is defined as the amount that catalyzes the formation of 1 μmol of product per minute under defined conditions. 

If an enzyme preparation is impure, the concentration may be expressed as units per mL.

 The specific activity is defined as units per mg of protein; the greater the purity of the preparation, the greater the specific activity. 

With enzymatic assay by ITC, it is necessary to determine the apparent molar enthalpy, making it advantageous if the exact molar concentration of substrate can be determined in the solution as well as active enzyme concentration for accurate kcat determination. 

It is also helpful if there is some indication of approximate KM so that appropriate substrate concentrations can be used to yield a complete Michaelis-Menten curve with some points of the curve below KM and some above it.  

Typical enzyme and substrate concentrations for ITC enzyme assays are in the range of spectroscopic assays. Enzyme in the ITC cell is in the sub-nanomolar to micromolar range (the higher the KM value, the higher the concentration needed). 

The required concentration is often less than that used for traditional ITC protein-ligand binding assays. 

 Substrate in the syringe is in the micromolar to millimolar range and is higher than the KM value. See below for guidelines.

 With all ITC experiments it is important that the reactants are made up in appropriate and well-defined buffer systems. 

Enzyme kinetics parameters will vary due to pH, salt, pH, etc.

 In order to avoid excessive heats of dilution it is necessary to dialyze the enzyme in the chosen buffer and then use the same buffer to make up the substrate solution. 

When choosing a buffer system, it might be necessary to prepare substrate solutions at quite high concentrations, needing a high concentration of buffer salt to ensure good buffering of the solution and prevent pH drift. 

As an added precaution, it is recommended to check the pH of all solutions and mixtures both before and after performing titrations. If the enzyme reaction requires any cofactors, the concentration of cofactor is matched in substrate and enzyme solutions. 

There are two methods that can be used to measure enzyme kinetic parameters with ITC: the multiple-injection method, which uses pseudo-first order conditions, and the continuous assay/single injection method, which uses a single injection of substrate into enzyme. Descriptions for each method are given below.

 Multiple-injection method ITC experiments for enzyme kinetics reactions are commonly conducted this way, with multiple injections of the substrate generating multiple rate determinations under pseudo-first order steady-state conditions in a single experiment.  

The rate data can be obtained by having relatively low amounts of enzyme in the cell, relatively high amounts of substrate in the injection syringe and by leaving shorter gaps between injections.

 The aim here is to ensure that subsequent to each injection, steady-state conditions are maintained and no more than 5% of the injected substrate is depleted prior to the next injection. 

In addition, it is also necessary a control where the identical solutions of substrate used in enzyme assays are injected into the reaction buffer. 

To obtain a Michaelis-Menten plot from a multiple-injection ITC experiment,  it is necessary to measure the total molar enthalpy of the enzymatic reaction (∆Happ).  

ITALIANO

I principi

Gli enzimi sono proteine ​​che funzionano come catalizzatori biologici, che svolgono un ruolo cruciale nei processi biochimici che avvengono negli organismi viventi. Capire come funzionano gli enzimi e come attivare o inibire la loro attività è un fulcro della ricerca per i biochimici. Poiché molti bersagli farmacologici sono enzimi, lo sviluppo di nuove terapie richiede la comprensione di come l'enzima bersaglio si lega e catalizza il suo substrato naturale. Diversi farmaci sono enzimi terapeutici, che vengono iniettati nel paziente per trattare malattie genetiche caratterizzate da enzimi mancanti o difettosi. Gli enzimi sono importanti anche in altri settori, tra cui la scienza alimentare, i biocarburanti ed i detergenti. Sebbene gli enzimi siano stati scoperti a metà del 1800, isolati e purificati dall'inizio del XX secolo e clonati ed espressi in sistemi ricombinanti dagli anni '70, c'è una continua necessità di analisi enzimatiche efficienti e dettagliate per sfruttare il potenziale del catalizzatore enzimatico reazioni. Vengono scoperti anche nuovi enzimi. I dati affidabili sulla cinetica enzimatica sono fondamentali per comprendere e controllare l'efficacia degli enzimi e creare farmaci di nuova generazione. Le tecniche di calorimetria di titolazione isotermica (ITC) sono state applicate con successo per studiare la cinetica e l'inibizione degli enzimi. ITC è una tecnica consolidata e versatile ampiamente utilizzata per misurare la termodinamica di reazione. 

In questa recensione, discutiamo di come ITC genera dati cinetici enzimatici in tempo reale, paragonabili ad altri dosaggi enzimatici.

Comprensione del comportamento e della cinetica dell'enzima.

 Quando un enzima interagisce con il suo substrato, forma un complesso enzima-substrato. Questo complesso viene convertito allo stato di transizione, il complesso dello stato di transizione viene quindi trasformato in un complesso prodotto enzimatico, che alla fine si dissocia per dare prodotto ed enzima libero.

La definizione matematica di KM significa che quantifica efficacemente l'affinità di legame tra l'enzima e il suo substrato quando la formazione del prodotto è la fase di limitazione della velocità.

 Minore è il KM, minore è la concentrazione di substrato richiesta per ottenere una determinata velocità.

Ciò rende KM una metrica preziosa per confrontare le prestazioni di diversi sistemi enzimatici e per:

Stabilire le concentrazioni approssimative di substrati intracellulari

Confronto delle prestazioni delle isoforme enzimatiche di diversi organismi o tessuti

 Confronto delle prestazioni di forme di enzimi native e ricombinanti

 Identificazione di strategie per la modifica dell'attività enzimatica indotta dal ligando

La maggior parte degli enzimi sono ora espressi come proteine ​​ricombinanti ed i loro substrati associati possono solitamente essere prodotti in modo simile o sintetizzati chimicamente. Con entrambi i componenti in posizione, la sfida è identificare un saggio efficiente per lo studio dettagliato della reazione.

Nei sistemi in cui il substrato o il prodotto è rilevabile da uno spettrofotometro, le analisi continue vengono eseguite aggiungendo l'enzima a soluzioni di diverse concentrazioni di substrato e monitorando la formazione del prodotto risultante o diminuendo la concentrazione del substrato.

 All'inizio del test, quando la quantità di substrato è in eccesso rispetto all'enzima, la velocità osservata è lineare con il tempo e viene indicata come velocità o velocità iniziale.

Tracciando la velocità iniziale rispetto alla concentrazione del substrato si ottiene una curva di Michaelis-Menten che può essere utilizzata per determinare KM e Vmax.

Questo tipo di analisi fornisce un potente strumento bioanalitico utilizzato per caratterizzare gli enzimi nativi e ingegnerizzati.

In molti casi, il prodotto o il substrato non ha un cromoforo conveniente.

 Anche se un prodotto può essere monitorato spettroscopicamente, gli analoghi del substrato sintetizzato potrebbero non avere tali caratteristiche.

Quando si progettano analoghi del substrato per sondare il meccanismo enzimatico, è necessario considerare solo la chimica della reazione catalitica piuttosto che i problemi relativi all'esecuzione dei saggi.

Quest'ultimo può spesso complicare le strategie di progettazione poiché l'inclusione di un cromoforo può essere macchinoso, dispendioso in termini di tempo e costoso. Un'alternativa è un'analisi discontinua, mescolando enzima e substrato utilizzando tecniche di flusso interrotto o flusso di raffreddamento.

La reazione procede per tempi diversi prima della tempra utilizzando un salto di pH o una variazione di temperatura. La quantità di prodotto formato o substrato rimanente nella reazione viene quantificata mediante spettrometria di massa o cromatografia.

Queste sono tecniche specializzate che sono spesso molto utili per misurare cinetiche veloci o isolare intermedi. Tuttavia, per l'analisi di routine questi metodi possono richiedere tempo e denaro, poiché sono necessari più esperimenti per generare un unico diagramma di Michaelis-Menten.

 Esistono anche analisi enzimatiche accoppiate, in cui il prodotto della catalisi enzimatica di interesse è il substrato per una seconda analisi. A volte questi test richiedono più passaggi.

Il prodotto finale viene quindi monitorato mediante un'analisi continua o discontinua. Anche con queste opzioni, non è sempre possibile o semplice misurare i cambiamenti nella concentrazione del substrato o del prodotto nei saggi tradizionali, perché:

Le soluzioni opache o torbide interferiscono con il rilevamento spettrofotometrico. 

L'attività enzimatica nativa, ricombinante e / o mutante è inferiore al limite di rilevamento del test.

 O il substrato o il prodotto non ha un cromoforo ed è troppo costoso o richiede tempo etichettarli. 

Le analisi discontinue richiedono più passaggi.

 Non esiste alcuna reazione accoppiata diretta.

I test accoppiati introducono imprecisioni e sono difficili da risolvere.

 L'attività enzimatica / del substrato è sconosciuta.

 La funzione delle proteine ​​è sconosciuta.

 La calorimetria di titolazione isotermica (ITC) è una tecnica potente e versatile ampiamente utilizzata per misurare l'affinità di legame e la termodinamica delle reazioni di associazione di equilibrio.

L'ITC è anche una tecnica di dosaggio senza etichette universale accettata che può essere applicata a qualsiasi sistema catalizzato da enzimi, a condizione che la reazione sia associata a una variazione dell'entalpia.

 ITC non si basa su uno spettrofotometro e gli esperimenti sono rapidi: i dati ITC per una curva di Michaelis-Menten possono essere generati in 30-90 minuti con la strumentazione attuale e sono necessarie solo piccole quantità di materiale, rendendolo un'alternativa interessante per l'enzima cinetica e saggi di inibizione.

ITC per cinetica enzimatica

ITC misura i parametri cinetici degli enzimi perché la potenza termica generata durante la reazione è un evento osservabile diretto e sensibile. L'uso di ITC per misurare il calore generato durante una reazione enzimatica è un test ben consolidato. 

La velocità di una reazione enzimatica è direttamente proporzionale alla potenza termica, definita come il calore (Q) prodotto in funzione del tempo:

 Potenza = dQ / dt.

 Un tipico esperimento ha il substrato nella siringa per iniezione ITC e l'enzima nella cellula ITC. 

Dopo che il substrato è stato aggiunto all'enzima, c'è una reazione che prende o rilascia calore, innescando un cambiamento di calore nella cella ITC.

I dati generati mostrano un picco con un'area positiva o negativa associata a ciascuna iniezione. ITC misura direttamente dQ / dt dopo l'iniezione del substrato, a diverse concentrazioni del substrato. 

La variazione della potenza termica è rappresentata da una variazione della posizione dell'asse Y dei dati ITC grezzi, rispetto alla posizione dell'asse Y per una titolazione di controllo in cui non c'è reazione enzimatica.

Versatilità dell'ITC per i test di cinetica enzimatica

ITC è stato utilizzato per caratterizzare la maggior parte delle classi di enzimi.

Todd, Gomez e Bianconi discutono dell'uso dell'ITC per caratterizzare quasi tutte le classi di enzimi. Altri esempi includono: β-glucosidasi e altre cellulasi ed enzimi che hanno ruoli importanti nella scomposizione efficiente della cellulosa nella biomassa

 Na +, K + -ATPasi

  Xilinasi

  Β-lattamasi di classe D idrolizzanti i carbapenemi

Gingipain K (idrolizza IgG)

 Fosfodiestasi nucleotidiche cicliche

Tripsina

Colina solfatasi

 Enzima lisosomiale e altri enzimi terapeutici

Α-amilasi salivare umana. Idrolasi epossidica umana solubile.

 Chinasi

Un tipico esperimento per la cinetica enzimatica ha l'enzima nella cellula ITC e il substrato nella siringa ITC.

 È anche utile se c'è qualche indicazione di KM approssimativo in modo che le concentrazioni di substrato appropriate possano essere utilizzate per produrre una curva di Michaelis-Menten completa con alcuni punti della curva sotto KM e alcuni sopra di essa.

 Le concentrazioni tipiche degli enzimi e del substrato per le analisi enzimatiche ITC rientrano nell'intervallo delle analisi spettroscopiche.

 L'enzima nella cellula ITC è nell'intervallo da sub-nanomolare a micromolare (maggiore è il valore KM, maggiore è la concentrazione necessaria).

La concentrazione richiesta è spesso inferiore a quella utilizzata per i test tradizionali di legame proteina-ligando ITC. 

Il substrato nella siringa è compreso tra micromolare e millimolare ed è superiore al valore KM.

I parametri della cinetica enzimatica variano a seconda del sale, del pH, ecc.

Per evitare eccessivi surriscaldamenti di diluizione è necessario dializzare l'enzima nel tampone scelto e quindi utilizzare lo stesso tampone per costituire la soluzione del substrato.

Esistono due metodi che possono essere utilizzati per misurare i parametri cinetici enzimatici con ITC: il metodo di iniezione multipla, che utilizza condizioni di pseudo primo ordine, e il metodo di dosaggio continuo / iniezione singola, che utilizza una singola iniezione di substrato nell'enzima.

 Metodo di iniezione multipla

 Gli esperimenti ITC per reazioni cinetiche enzimatiche sono comunemente condotti in questo modo, con iniezioni multiple del substrato che generano determinazioni di velocità multiple in condizioni di stato stazionario del primo ordine in un singolo esperimento di titolazione ITC.

I dati sulla velocità possono essere ottenuti avendo quantità relativamente basse di enzima nella cellula, quantità relativamente elevate di substrato nella siringa per iniezione e lasciando spazi più brevi tra le iniezioni.

  L'obiettivo qui è di garantire che dopo ogni iniezione, le condizioni di stato stazionario siano mantenute e non più del 5% del substrato iniettato sia esaurito prima della successiva iniezione.

Inoltre, è anche necessario un controllo in cui le soluzioni identiche di substrato utilizzate nei saggi enzimatici vengono iniettate nel tampone di reazione.

Per ottenere un diagramma di Michaelis-Menten da un esperimento ITC a iniezione multipla, è necessario misurare l'entalpia molare totale della reazione enzimatica (∆Happ).

Da:

https://f.hubspotusercontent40.net/hubfs/547446/Technology%20Networks/TN%20Editorial%20Calendar/Article/Malvern%20-%20Article%20Sponsorship/Sept%202020/Biopharma%20Analysis%20(BP)/WP%20-%20Enzyme%20Kinetics%20-%20Part%201%20-%20Principles.pdf?__hssc=8807082.1.1604191000975&__hstc=8807082.44b0f6eac84be5818378483b36bfad3b.1601170002551.1604024902336.1604191000975.10&__hsfp=1916092108&hsCtaTracking=2cacd283-d551-401f-9266-ad38c9fbde8c%7Cd940452d-612f-41a5-88f2-e90b580b90a1

https://f.hubspotusercontent40.net/hubfs/547446/Technology%20Networks/TN%20Editorial%20Calendar/Article/Malvern%20-%20Article%20Sponsorship/Sept%202020/Biopharma%20Analysis%20(BP)/TN%20-%20Enzyme%20Kinetics%20-%20Part%202%20-%20Methods.pdf?__hssc=8807082.1.1604191000975&__hstc=8807082.44b0f6eac84be5818378483b36bfad3b.1601170002551.1604024902336.1604191000975.10&__hsfp=1916092108&hsCtaTracking=175a21cf-5ce1-42be-ae4c-6820d7f1e775%7Cf3239491-8296-4f04-a551-d5f72a3fbf3b