Tecnica NanoSeq migliorata per rilevare nuove mutazioni cellulari non divisibili / NanoSeq Technique Improved to Detect New Non-Dividing Cell Mutations

Tecnica NanoSeq migliorata per rilevare nuove mutazioni cellulari non divisibili / NanoSeq Technique Improved to Detect New Non-Dividing Cell Mutations

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa /  Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

I ricercatori dovrebbero ora essere in grado di studiare le mutazioni in qualsiasi tessuto umano grazie a una nuova svolta nel sequenziamento da parte di un gruppo di scienziati del Wellcome Sanger Institute. Il nuovo metodo consente di indagare in modo più accurato come si verificano i cambiamenti genetici nei tessuti umani.

Il sequenziamento dei nanorati è estremamente accurato e consente il rilevamento di nuove mutazioni nelle cellule che non si dividono, cosa che era difficile con le tecniche precedenti. Il metodo di sequenziamento, noto anche come NanoSeq, utilizza il sequenziamento duplex. Ciò comporta l'etichettatura molecolare casuale del DNA a doppio filamento per migliorare l'accuratezza e consentire una migliore rilevazione delle mutazioni.

Il sequenziamento duplex non è nuovo, ma precedenti iterazioni della tecnica hanno reso molto difficile rilevare mutazioni presenti solo in singole cellule o piccole sezioni di tessuto non in divisione. Le mutazioni si verificano nel tempo nelle nostre cellule non germinali (a una velocità di 15-40 all'anno) e queste sono spesso solo in singoli o piccoli gruppi di cellule. Sebbene molte di queste varianti siano innocue, alcune possono causare il cancro o altre malattie in seguito.

Questa nuova tecnica NanoSeq ha impiegato quattro anni per svilupparsi e ha comportato un attento perfezionamento delle tecniche di sequenziamento duplex attualmente utilizzate. Ad esempio, utilizzando enzimi più specifici per tagliare il DNA in modo più accurato e anche una migliore analisi bioinformatica dei dati di sequenziamento. Ha un tasso di errore inferiore a cinque errori per miliardo di paia di basi in singole molecole di DNA da popolazioni cellulari. Inoltre non richiede biopsie tissutali invasive e i campioni possono essere prelevati utilizzando tamponi cutanei o tissutali.

Robert Osborne, PhD, precedentemente basato al Sanger, e Inigo Martincorena, PhD, un leader del gruppo al Sanger hanno condotto lo studio di ricerca " Paesaggi di mutazione somatica alla risoluzione di una singola molecola ", che è pubblicato su Nature .

“Le mutazioni somatiche guidano lo sviluppo del cancro e possono contribuire all'invecchiamento ed ad altre malattie. Nonostante la loro importanza, la difficoltà di rilevare mutazioni presenti solo in singole cellule o piccoli cloni ha limitato la nostra conoscenza della mutagenesi somatica a una minoranza di tessuti. Qui, per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato il sequenziamento dei nanorati (NanoSeq), un protocollo di sequenziamento duplex con tassi di errore inferiori a cinque errori per miliardo di paia di basi in singole molecole di DNA da popolazioni cellulari. Questo tasso è di due ordini di grandezza inferiore ai tipici carichi di mutazione somatica, consentendo lo studio delle mutazioni somatiche in qualsiasi tessuto indipendentemente dalla clonalità ", scrivono i ricercatori.

“Abbiamo utilizzato questa sensibilità a singola molecola per studiare le mutazioni somatiche in cellule non in divisione in diversi tessuti, confrontando le cellule staminali con cellule differenziate e studiando la mutagenesi in assenza di divisione cellulare. Le cellule differenziate nel sangue e nel colon hanno mostrato carichi di mutazione e firme notevolmente simili alle cellule staminali corrispondenti, nonostante le cellule del sangue mature abbiano subito molte più divisioni.

“Abbiamo quindi caratterizzato il panorama mutazionale dei neuroni post-mitotici e della muscolatura liscia policlonale, confermando che i neuroni accumulano mutazioni somatiche a una velocità costante per tutta la vita senza divisione cellulare, con velocità simili a quelle dei tessuti mitoticamente attivi.

"Insieme, i nostri risultati suggeriscono che i processi mutazionali indipendenti dalla divisione cellulare sono importanti contributori alla mutagenesi somatica".

Tecnicamente impegnativo

"Rilevare mutazioni somatiche che sono presenti solo in una o poche cellule è incredibilmente tecnicamente impegnativo", ha detto Osbourne, in un comunicato stampa. "Devi trovare un singolo cambio di lettera tra decine di milioni di lettere di DNA e metodi di sequenziamento precedenti semplicemente non erano abbastanza accurati. Poiché NanoSeq commette solo pochi errori per miliardo di lettere di DNA, ora siamo in grado di studiare accuratamente le mutazioni somatiche in qualsiasi tessuto ".

Il gruppo ha testato il proprio metodo per valutare i livelli di mutazioni nelle cellule staminali e nelle cellule non in divisione nel sangue, nei neuroni e nel colon. Hanno trovato livelli simili di mutazioni nelle cellule del sangue e del colon adulte differenziate rispetto alle cellule staminali negli stessi tessuti. Questo è stato sorprendente per le cellule del sangue poiché subiscono frequenti divisioni cellulari. Le cellule neuronali, al contrario, sembravano accumulare gradualmente mutazioni nel tempo.

“Si presume spesso che la divisione cellulare sia il fattore principale nel verificarsi di mutazioni somatiche, con un maggior numero di divisioni che creano un maggior numero di mutazioni. Ma la nostra analisi ha scoperto che le cellule del sangue che si erano divise molte volte più di altre presentavano gli stessi tassi e modelli di mutazione. Questo cambia il modo in cui pensiamo alla mutagenesi e suggerisce che altri meccanismi biologici oltre alla divisione cellulare sono fondamentali ", ha osservato Federico Abascal, PhD, ricercatore nel gruppo di Martincorena al Sanger e primo autore dell'articolo.

I ricercatori stanno ora pianificando di sviluppare e perfezionare ulteriormente la tecnica in più tipi di campioni di tessuto e cellule.

"L'applicazione di NanoSeq su piccola scala in questo studio ci ha già portato a riconsiderare ciò che pensavamo di sapere sulla mutagenesi, il che è eccitante", ha detto Martincorena. “NanoSeq renderà anche più facile, più economico e meno invasivo studiare la mutazione somatica su scala molto più ampia. Piuttosto che analizzare le biopsie di un piccolo numero di pazienti ed essere in grado di guardare solo le cellule staminali o il tessuto tumorale, ora possiamo studiare campioni di centinaia di pazienti e osservare le mutazioni somatiche in qualsiasi tessuto ".

Il gruppo ritiene che essere in grado di rilevare più accuratamente le mutazioni in singole molecole di DNA potrebbe trasformare la comprensione della mutagenesi somatica e consentire studi non invasivi su coorti su larga scala.

ENGLISH

Researchers should now be able to study mutations in any human tissue due to a novel sequencing breakthrough by a team of scientists at the Wellcome Sanger Institute. The novel method makes it possible to more accurately investigate how genetic changes occur in human tissues.

Nanorate sequencing is extremely accurate and allows detection of new mutations in non-dividing cells, something that was difficult with earlier techniques. The sequencing method, also known as NanoSeq, uses duplex sequencing. This involves random molecular tagging of double-stranded DNA to improve accuracy and allow better detection of mutations.

Duplex sequencing is not new, but earlier iterations of the technique made it very difficult to detect mutations only present in single cells or small sections of non-dividing tissue. Mutations occur over time in our non-germline cells (at a rate of 15–40 per year) and these are often only in single or small groups of cells. While many such variants are harmless, some may cause cancer or other diseases later on.

This new NanoSeq technique took four years to develop and involved a careful refining of currently used duplex sequencing techniques. For example, using more specific enzymes to cut DNA more accurately and also better bioinformatics analysis of the sequencing data. It has an error rate of less than five errors per billion base pairs in single DNA molecules from cell populations. It also does not require invasive tissue biopsies and samples can be taken using skin or tissue swabs.

Robert Osborne, PhD, previously based at the Sanger, and Inigo Martincorena, PhD, a group leader at the Sanger led the research study “Somatic mutation landscapes at single-molecule resolution,” which is published in Nature.

“Somatic mutations drive the development of cancer and may contribute to aging and other diseases. Despite their importance, the difficulty of detecting mutations that are only present in single cells or small clones has limited our knowledge of somatic mutagenesis to a minority of tissues. Here, to overcome these limitations, we developed nanorate sequencing (NanoSeq), a duplex sequencing protocol with error rates of less than five errors per billion base pairs in single DNA molecules from cell populations. This rate is two orders of magnitude lower than typical somatic mutation loads, enabling the study of somatic mutations in any tissue independently of clonality,” write the investigators.

“We used this single-molecule sensitivity to study somatic mutations in non-dividing cells across several tissues, comparing stem cells to differentiated cells and studying mutagenesis in the absence of cell division. Differentiated cells in blood and colon displayed remarkably similar mutation loads and signatures to their corresponding stem cells, despite mature blood cells having undergone considerably more divisions.

“We then characterized the mutational landscape of post-mitotic neurons and polyclonal smooth muscle, confirming that neurons accumulate somatic mutations at a constant rate throughout life without cell division, with similar rates to mitotically active tissues.

“Together, our results suggest that mutational processes that are independent of cell division are important contributors to somatic mutagenesis.”

Technically challenging

“Detecting somatic mutations that are only present in one or a few cells is incredibly technically challenging,” said Osbourne, in a press statement. “You have to find a single letter change among tens of millions of DNA letters and previous sequencing methods were simply not accurate enough. Because NanoSeq makes only a few errors per billion DNA letters, we are now able to accurately study somatic mutations in any tissue.”

The team tested their method to evaluate levels of mutations in stem cells and non-dividing cells in the blood, neurons, and colon. They found similar levels of mutations in adult, differentiated blood and colon cells compared with stem cells in the same tissues. This was surprising for blood cells as they undergo frequent cell division. Neuronal cells, in contrast, seemed to gradually accumulate mutations over time.

“It is often assumed that cell division is the main factor in the occurrence of somatic mutations, with a greater number of divisions creating a greater number of mutations. But our analysis found that blood cells that had divided many times more than others featured the same rates and patterns of mutation. This changes how we think about mutagenesis and suggests that other biological mechanisms besides cell division are key,” noted Federico Abascal, PhD, a researcher in Martincorena’s group at the Sanger and the first author of the paper.

The researchers are now planning to develop and refine the technique further in more types of tissue and cell samples.

“The application of NanoSeq on a small scale in this study has already led us to reconsider what we thought we knew about mutagenesis, which is exciting,” said Martincorena. “NanoSeq will also make it easier, cheaper and less invasive to study somatic mutation on a much larger scale. Rather than analyzing biopsies from small numbers of patients and only being able to look at stem cells or tumor tissue, now we can study samples from hundreds of patients and observe somatic mutations in any tissue.”

The team believes that being able to more accurately detect mutations in single DNA molecules could transform the understanding of somatic mutagenesis and allow non-invasive studies on large-scale cohorts.

Da:

https://www.genengnews.com/news/nanoseq-technique-improved-to-detect-new-non-dividing-cell-mutations/?fbclid=IwAR134IsgsADWNtt9XAKr3Ie5jaLEBF_u7ZtJB_C2gSJhpwo7qsjQP1nU89U