Una correzione genetica per un modello murino di Duchenne? / A Gene Fix for a Mouse Model of Duchenne?

 Una correzione genetica per un modello murino di Duchenne? / A Gene Fix for a Mouse Model of Duchenne? 

 Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Questa fotografia mostra come la terapia genica della microdistrofina AAV migliora la patologia distrofica nel muscolo scheletrico. (Blu) La colorazione tricromica Masson indica fibrosi; (rosso scuro) La colorazione Alizarin Red indica la calcificazione. /  This photograph shows how the AAV micro-dystrophin gene therapy ameliorates dystrophic pathology in skeletal muscle. (Blue) Masson trichrome staining indicates fibrosis; (dark red) Alizarin Red staining marks calcification.  [Hakim et al./ Terapia molecolare: metodi e sviluppo clinico ]

Un trattamento per la distrofia muscolare di Duchenne (DMD), effettuato attraverso la riparazione genetica, potrebbe essere all'orizzonte, secondo i ricercatori in un nuovo articolo pubblicato su Molecular Therapy—Methods & Clinical Development (" A Five-Repeat Micro-Dystrophin Gene Ameliorated Dystrophic Fenotipo nel modello grave DBA/2J-mdx della distrofia muscolare di Duchenne").

L'approccio terapeutico cerca di correggere i geni difettosi che portano a una carenza di distrofina, una proteina necessaria per la forza delle fibre muscolari.

I ricercatori affermano che il loro approccio al trattamento della DMD è nuovo, in particolare perché il trasferimento genico che descrivono, inteso a sostituire il codice danneggiato con una versione funzionale della distrofina, utilizza un vettore del virus adeno-associato (AAV) per trasportare i geni sostitutivi nelle cellule.

"Questo è il primo vettore AAV che ha utilizzato un nuovo promotore muscolo-specifico per guidare un cDNA di microdistrofina ottimizzato per i codoni che trasporta il dominio critico di legame dell'ossido nitrico sintasi neuronale (nNOS) per prevenire l'ischemia e l'affaticamento durante la contrazione muscolare", il leader dello studio Dongsheng Duan, Ph.D., Università del Missouri e Solid Biosciences, dice a GEN . "In passato sono stati tentati altri vettori di trasferimento genico (come il vettore adenovirale, il virus dell'herpes simplex ed il plasmide), ma in gran parte non hanno avuto successo a causa della complessità della malattia, delle sfide associate al parto e delle grandi dimensioni del gene nativo della distrofina….Sebbene in passato sia stato utilizzato anche l'AAV, nessuno dei precedenti vettori AAV ha le caratteristiche combinatorie sopra menzionate.

I ricercatori affermano che l'AAV è un veicolo fattibile di consegna genica grazie alla sua capacità di raggiungere il tessuto muscolare nei topi DBA/2J-mdx (un modello murino caratterizzato da sintomi simili alla DMD negli esseri umani). Ma, poiché l'AAV è di dimensioni abbastanza ridotte, è difficile comprimere tutto il materiale genetico necessario nel vettore. Nei modelli precedenti, i ricercatori hanno utilizzato versioni in miniatura del gene della distrofina nell'AAV, ma c'erano dei limiti a questo approccio ed il materiale genetico mancante in quel modello murino ne precludeva l'uso pratico. I nuovi modelli, guidati dal Dr. Duan, includono il dominio di legame nNOS precedentemente mancante, che consente il corretto apporto di sangue di fluire ai muscoli quando si contraggono. I microgeni che si adattano al vettore AAV sono un terzo delle dimensioni della normale distrofina.

Quindici settimane dopo l'iniezione con il vettore AAV carico di microdistrofina, tutti e 10 i topi trattati avevano livelli di proteina microdistrofina nei muscoli scheletrici e alcuni dei sintomi associati alla DMD erano significativamente ridotti. Tuttavia, non è stato possibile misurare con precisione il trattamento con micro-distrofina ed i suoi effetti sul cuore dei topi, a causa di problemi con la calcificazione del cuore nei topi di controllo.

"Per la stragrande maggioranza dei pazienti con DMD, non ci sono trattamenti sintomatici o modificanti la malattia soddisfacenti", afferma il dottor Duan. Osserva che il trattamento con glucocorticoidi è l'attuale standard di cura; sebbene questi trattamenti siano stati in grado di migliorare temporaneamente la forza muscolare, prolungare la deambulazione e rallentare la progressione della DMD, non affrontano la causa genetica alla base della DMD. Inoltre, osserva il dott. Duan, l'uso di glucocorticoidi è associato a noti eventi avversi, come un grave aumento di peso, crescita stentata, indebolimento della struttura ossea e disfunzioni metaboliche, tra gli altri.

Alcuni credono che per correggere un difetto genetico in modo permanente, una terapia genica deve essere a base di cellule staminali. Ma il dottor Duan afferma che mentre la correzione della mutazione genetica nelle cellule staminali muscolari consentirebbe alle cellule muscolari rigenerate di trasportare un gene corretto ed esprimere una proteina funzionale della distrofina, non è l'unica opzione per una correzione a vita. "Studi umani hanno dimostrato che l'iniezione intramuscolare una tantum di un vettore AAV può comportare l'espressione di una proteina terapeutica per molti anni (ad esempio, uno studio ha mostrato l'espressione del fattore IX per 10 anni in un paziente emofilico). In studi preclinici su modelli murini e canini, abbiamo anche osservato l'espressione persistente della microdistrofina pluriennale da vettori AAV. Nel caso dei topi, una singola iniezione può portare all'espressione della microdistrofina per tutta la durata della vita".

C'è ovviamente la preoccupazione che i virus inseriscano i loro carichi genetici in modo errato, stimolando alcune reazioni drammatiche e forse pericolose per la vita. "Finora, non ci sono prove concrete che suggeriscano l'integrazione del genoma AAV nelle cellule muscolari", spiega il dottor Duan. “È stato dimostrato che sia AAV wild-type che ricombinante esistono come molecole episomiche nei muscoli. La mutagenesi inserzionale è minima per un vettore AAV. Ciò è in netto contrasto con i vettori basati su retrovirus, che richiedono l'integrazione del genoma nel genoma ospite per esprimere proteine ​​terapeutiche".

ENGLISH

A treatment for Duchenne muscular dystrophy (DMD), carried out through genetic repair, may be on the horizon, according to researchers in a new paper published in Molecular Therapy—Methods & Clinical Development (“A Five-Repeat Micro-Dystrophin Gene Ameliorated Dystrophic Phenotype in the Severe DBA/2J-mdx Model of Duchenne Muscular Dystrophy”).

The treatment approach seeks to correct the faulty genes that lead to a deficiency of dystrophin, a protein that is necessary for muscle fiber strength.

The researchers say their approach to treat DMD is novel, specifically because the gene transfer they describe—meant to replace damaged code with a functional version of dystrophin—uses an adeno-associated virus (AAV) vector to shuttle the replacement genes into cells.

“This is the first AAV vector that utilized a novel muscle-specific promoter to drive a codon-optimized microdystrophin cDNA that carries the critical neuronal nitric oxide synthase (nNOS)-binding domain to prevent ischemia and fatigue during muscle contraction,” study leader Dongsheng Duan, Ph.D., University of Missouri and Solid Biosciences, tells GEN. “There have been other gene-transfer vectors attempted in the past (such as adenoviral vector, herpes simplex virus, and plasmid), but they have largely been unsuccessful due to the complexity of the disease, challenges associated with delivery, and the large size of the native dystrophin gene….While AAV has also been used in the past, none of the previous AAV vectors have the combinatoral features mentioned above.”

The researchers say AAV is a feasible gene-delivery vehicle because of its ability to reach muscle tissue in DBA/2J-mdx mice (a mouse model that is characterized by symptoms similar to DMD in humans). But, because AAV is fairly small in size, it is difficult to pack all of the necessary genetic material into the vector. In earlier models, researchers used miniature versions of the dystrophin gene in AAV, but there were limitations to this approach, and missing genetic material in that mouse model precluded its practical use. New models, spearheaded by Dr. Duan, include the previously missing nNOS-binding domain, allowing the proper supply of blood to flow to muscles when they contract. The microgenes that fit into the AAV vector are one-third the size of regular dystrophin.

Fifteen weeks following injection with the micro-dystrophin-laden AAV vector, all 10 of the mice that were treated had levels of microdystrophin protein in their skeletal muscles, and some of the symptoms associated with DMD were significantly reduced. Treatment with micro-dystrophin and its effects on the mice’s hearts, however, could not accurately be measured, because of issues with heart calcification in the control mice.

“For the vast majority of DMD patients, there are no satisfactory symptomatic or disease-modifying treatments,” Dr. Duan says. He notes that glucocorticoid treatment is the current standard of care; while these treatments have been able to temporarily improve muscle strength, prolong ambulation, and slow the progression of DMD, they do not address the underlying genetic cause of DMD. In addition, notes Dr. Duan, glucocorticoid use is associated with well-known adverse events, such as severe weight gain, stunted growth, weakening of bone structure, and metabolic dysfunctions, among others.

Some believe that to correct a genetic defect permanently, a gene therapy has to be stem-cell based. But Dr. Duan says that while correction of the gene mutation in muscle stem cells would allow regenerated muscle cells to carry a corrected gene and express a functional dystrophin protein, it is not the only option for a lifetime fix. “Human studies have shown that one-time intramuscular injection of an AAV vector can result in the expression of a therapeutic protein for many years (for example, a study showed Factor IX expression for 10 years in a hemophilia patient). In preclinical studies in murine and canine models, we have also observed persistent multiyear microdystrophin expression from AAV vectors. In the case of mice, a single injection can lead to microdystrophin expression throughout the lifespan.”

There is concern, of course, that viruses will insert their genetic payloads incorrectly, spurring some dramatic, and perhaps life-threatening, reactions. “So far, there is no concrete evidence suggesting AAV genome integration in muscle cell,” Dr. Duan explains. “Both wild-type and recombinant AAV have been shown to exist as episomal molecules in muscle. Insertional mutagenesis is minimal for an AAV vector. This is in sharp contrast to retrovirus-based vectors, which require integration of the genome in the host genome to express therapeutic proteins.”

Da:

https://www.genengnews.com/topics/translational-medicine/a-gene-fix-for-a-mouse-model-of-duchenne/