The emerging world of single-molecule mass measurements / Il mondo emergente delle misure di massa a singola molecola

The emerging world of single-molecule mass measurements / Il mondo emergente delle misure di massa a singola molecola

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Neil Kelleher and coworkers used Orbitrap-based charge detection mass spectrometry (CDMS) to determine the distribution of proteins directly from human kidney tissue: top, a histological image of kidney tissue stained with hematoxylin and eosin; middle, a CDMS image of glutathione S-transferase A2 (red), transgelin-2 (green), and apolipoprotein A-1 (blue); bottom, a CDMS image of two proteoforms of heat shock protein β-1, one that is acetylated (purple) and one that is both acetylated and phosphorylated (green). / Neil Kelleher e colleghi hanno utilizzato la spettrometria di massa a rilevamento di carica basata su Orbitrap (CDMS) per determinare la distribuzione delle proteine direttamente dal tessuto renale umano: in alto, un'immagine istologica del tessuto renale colorato con ematossilina ed eosina; al centro, un'immagine CDMS di glutatione S-transferasi A2 (rosso), transgelina-2 (verde) e apolipoproteina A-1 (blu); in basso, un'immagine CDMS di due proteoforme della proteina da shock termico β-1, una acetilata (viola) e una acetilata e fosforilata (verde)

IN BRIEF

For large molecules and complex mixtures, conventional mass spectra can become too complicated to interpret. New technologies including various forms of charge-detection mass spectrometry, mass photometry, and nanoelectromechanical systems are allowing researchers to ditch the complexity and measure the mass of individual molecules, complexes, and particles.

t the University of Oxford, Justin Benesch studies assemblies made between proteins called molecular chaperones and the proteins they protect in cells. These assemblies slow the formation of amyloid fibers, elongated protein structures that are a major component of cataracts and are associated with neurodegenerative diseases. Such protein complexes and fibers exist not in single oligomeric states but as complex mixtures.

As a mass spectrometrist studying biological systems, Benesch has long relied on native mass spectrometry—an approach that lets him look at proteins and protein complexes in their native, rather than denatured, unfolded forms. But native MS can fall short.

“As you look at more complex species, you start to realize that native mass spectra can, in some circumstances, become essentially uninterpretable,” Benesch says. “The data are there, but the information can’t be extracted in a meaningful way.”

The problem, Benesch notes, is that everything in a mass spectrum is on a mass-to-charge ratio (m/z) axis; any given value of m can have multiple values of z. Peaks become entangled and overlap.

But what if there were methods that allowed researchers to look at mass by itself rather than m/z?

Such methods have become available in recent years. In fact, researchers now have several options for determining the mass of individual molecules. Two of these methods are versions of mass spectrometry in which the charge (z) is detected separately from m/z, hence the name charge detection MS (CDMS). Multiplying m/z by z allows the mass to be calculated. The other approaches are optical and nanoelectromechanical methods.

The optical microscopy technique known as mass photometry determines mass from changes in reflectivity at an interface. In nanoelectromechanical systems MS (NEMS-MS), the resonant vibrational frequencies of tiny silicon-based devices change in response to mass.

Some of these instruments are already commercially available; others are in development. Researchers are using the methods to answer a key question in gene therapy and better study large biomolecules and complexes.

Multiple flavors of CDMS

There are multiple types of CDMS. In CDMS based on linear ion traps, a few ions at a time enter a metal tube that’s fitted with electrodes at both ends. As the ions shuttle back and forth between the electrodes, they induce a charge on the tube that an amplifier detects. The ions’ oscillation frequency is used to determine their m/z via a common computer-driven mathematical procedure known as Fourier transform data analysis.

The charge is calculated from the amplitude of the Fourier transform signal and can be measured accurately enough to correctly assign the charge state with a low error rate.

“This is the key to high-mass-resolution CDMS measurements, and it requires that the charge be measured with a precision that is better than” two-tenths of the charge of an individual electron, says Martin F. Jarrold, a chemistry professor at Indiana University Bloomington and a leader in the field. “The challenge in CDMS now is reducing the time required to make the high-precision charge measurement to below 1 s.”

But analyzing only one or a handful of ions at a time means that conventional CDMS is slow. Each ion can be measured quickly, but many individual ions must be measured to build up a mass spectrum. Some researchers are working on ways to speed up the process.

John Hoyes, who’s behind the one-​person operation TrueMass, has designed a CDMS instrument that swaps the linear configuration for a figure-eight path. In that geometry, the ions don’t have to slow down to change direction at the end of a tube.

“The fact that my ions are flying in quite a large volume and always at full speed means that they have less likelihood to interact with each other,” Hoyes says. He can analyze more ions simultaneously than can be done with the linear design.

Hoyes built the TrueMass instrument in partnership with two companies: Fasmatech, a company that makes MS electrospray ionization sources, and Spectroswiss, which specializes in Fourier transform data analysis. The instrument is on its way to Perdita Barran’s lab at the University of Manchester.

“We will make this available to anyone who wants to use it,” Barran says. “That may help other people see whether they want to use it. And it will probably help explore the application space.”

Evan R. Williams, a chemistry professor at the University of California, Berkeley, is working to speed up CDMS analysis. “If this is going to be a practical technique, nobody wants to sit there and acquire data for 20, 30, 40 min,” Williams says. “Our goal is to get this down to the LC [liquid chromatography] timescale.”

Williams wants to analyze as many ions as possible simultaneously. Multiple microfabricated devices in parallel would be one option, but the expensive electronics required for detection make such an approach impractical, he says. “It makes way more sense to pack in the maximum number of ions into the device that you can while still being able to track every single individual ion.” His group’s current instrument can monitor 10–30 ions simultaneously; the team is working to be able to monitor upward of 100 ions at a time.

“We’re decoupling the frequency measurement. People translate frequency to m/z, but that’s assuming a constant energy,” Williams says. He allows ions into the trap with the same m/z but slightly different energies. “The energies don’t have to be very different, because our frequency precision is very good,” Williams says. “Even a tiny change in energy allows us to split out those signals.”

The other type of CDMS is performed on Orbitrap mass spectrometers. The version from the instrument company Thermo Fisher Scientific—​direct mass technology (DMT) mode—was developed in collaboration with Neil Kelleher and coworkers at Northwestern University. No hardware changes to the Orbitrap are needed. The main differences are in the number of ions admitted into the trap and how the data are processed. In DMT mode, approximately 800 ions enter the trap at a time. For comparison, 3 million ions are typically let into the Orbitrap at a time for conventional mass spectra.

As in conventional Orbitrap MS, the m/z for each ion is determined by its frequency of motion along a central electrode. In addition, DMT mode sums the induced charge on the Orbitrap’s outer electrode, plotting what Thermo calls selective temporal overview of resonant ions (STORI) data, which track the lifetime of an individual ion. The slope of an ion’s STORI plot is proportional to the charge on that ion.

Other single-molecule mass measurements

Other options for single-molecule mass measurement don’t involve mass spectrometry at all. Instead, they use optical and nanomechanical methods.

Mass photometry is a microscopy method that was invented by the groups of Benesch and Philipp Kukura at Oxford. “Fundamentally, it’s a light microscope,” Kukura says. “It’s optimized to detect minuscule changes of the reflectivity of a surface.” The surface in question is the interface between glass and water.

When something, such as a protein, binds to the interface, it will scatter light. The microscope’s optics collect the scattered light along with reflected light, and the two interfere on a camera to form an image.

“If you optimize the optical path, you can maximize the phase difference between the scattered and the reflected light,” Kukura says. “Thereby you maximize the contrast using the interference between scattered and reflected light.”

The change in reflectivity is proportional to the mass of the molecule. To be detected by mass photometry, a molecule needs to be at least 30 kDa. To be fully resolved, species must differ in mass by at least 20 kDa. Although a 20 kDa difference is needed to resolve peaks, the instrument can detect mass shifts of as little as 1 kDa.

Mass photometry is not yet ready for measuring mass to the greatest accuracy—the error bars are too wide for that. “Even though the resolution for individual peaks at this stage is nowhere near what you can get in a mass spectrometer, you get just one peak per species. So you gain clarity in your spectrum that compensates for the lower resolution,” Benesch says. “For heterogeneous things, it’s often better to go with the method that gives you fewer peaks in the spectrum, even if they are individually at lower resolution.”

In concept, mass photometry is quite simple; getting it to work—not so much. “If you just go buy or build a microscope and try this, you see nothing,” Kukura says. “This is 15 years of pretty hardcore engineering and research to get these levels of sensitivity.”

NEMS-MS , a nanoelectromechanical method, uses tiny silicon-based resonators to measure the mass of individual molecules. Each resonator, which consists of a beam clamped at both ends, oscillates at a particular frequency. When a molecule, such as a protein, adsorbs to the beam, the oscillation frequency decreases. That frequency change is proportional to the mass of the molecule.

NEMS are particularly well suited for mass measurements of large molecules and assemblies. “NEMS are great because they have an unlimited upper mass range,” says Michael Roukes, a physicist at the California Institute of Technology and a leader in the field. “Any kind of ion optics–based mass spec essentially has a resolving power that decreases with the increasing mass of the species. NEMS are great because the resolving power increases with the analyte mass.”

What’s it good for?

Researchers are turning to single-​molecule mass measurements to answer questions that are difficult to answer with other methods.

One application is in gene therapy. Adeno-​​associated virus (AAV) capsids—the viruses’ protein shells—are used in gene therapy to deliver genetic material to cells. Researchers design the combination of capsid and cargo, so they know what the total mass should be. But the capsids don’t always find their cargo, so researchers don’t know if any given capsid is full, partially full, or empty. Single-molecule mass measurements provide a quick way to answer that question.

One reason that knowing whether capsids are empty or full is important is that AAVs can cause adverse reactions, so empty capsids should be minimized, says Bryan Troxell, formerly head of the analytical development team at the gene therapy firm StrideBio and now at AjaxBio, which provides consulting for preclinical gene therapy programs. Troxell has collaborated with Jarrold’s company, Megadalton Solutions, to analyze AAVs. Troxell would like to use CDMS in combination with cell biology experiments to study how the number of full, partially full, and empty capsids affects cellular response to gene therapy.

Jarrold is using CDMS to study other viruses in addition to AAVs. In the case of norovirus, he has seen unexpected capsid structures. The capsid protein assembles into tiles, which can have various numbers of capsid proteins. Sixty of those tiles form an icosahedron. For example, the T = 3 structure, which has three proteins in each tile, has 180 proteins in the final icosahedron.

Using CDMS, Jarrold and his coworkers have come across an unusual nonicosahedral particle. “It’s made by taking a T = 4 particle, cutting it down the middle, putting a ring of 10 hexagons in there, twisting one of the endcaps by about 18°, and putting it back together,” Jarrold says. “You’ve gone from something that was roughly spherical to something that’s elongated. Under some circumstances, this is the most prominent feature in the spectrum.”

Jarrold and coworkers are using CDMS to see even larger structures, such as a T = 7, with 420 proteins. But they’re having difficulty confirming those structures with cryo-electron microscopy (cryo-EM), a common structural biology method. “There’s no doubt that these are features in the mass spectra. They’re sharp peaks. They’ve got the right masses for particular combinations of hexagons and pentagons, which is what you would expect in viral capsid assembly,” Jarrold says. “But they’re being missed in the cryo-EM measurements.”

The norovirus capsid protein usually assembles into the T = 3 structure, which has 180 copies of the protein. Using charge detection mass spectrometry, Martin F. Jarrold and coworkers found additional, unexpected assemblies, such as the T = 7 structure, which has 420 copies of the protein. They also see capsids with 480, 600, and 700 capsid proteins; they don’t know the structures of those assemblies. / La proteina del capside del norovirus di solito si assembla nella struttura T = 3, che ha 180 copie della proteina. Usando la spettrometria di massa a rilevamento di carica, Martin F. Jarrold e colleghi hanno trovato gruppi aggiuntivi ed inaspettati, come la struttura T = 7, che ha 420 copie della proteina. Vedono anche capsidi con 480, 600 e 700 proteine del capside; non conoscono le strutture di quelle assemblee.

Mass photometry can be used for screening samples before performing other structural biology methods, such as cryo-EM, Kukura says. Researchers can see immediately whether a complex is assembled properly or aggregated into clumps. Without knowing whether a sample is in the expected form, researchers can misinterpret their results or waste time with unusable data. “Here, you immediately see whether you have a homogeneous sample or not,” Kukura says.

Single-molecule mass measurements can also be useful for structures smaller than viruses but whose size or complexity is nonetheless challenging for conventional MS.

“For protein-based therapeutics, we like to look at a molecule at the peptide level, the subunit level, and the intact level,” says Thomas Powers, a senior principal scientist in analytical R&D at the drug company Pfizer. “The challenge we have as things get larger and larger is that conventional mass spectrometers are unable to look at the intact molecule.” In addition, Powers says, CDMS is a valuable tool for characterizing heterogeneous protein therapeutics that have modifications such as attached sugar molecules.

Kelleher and coworkers use Orbitrap-​based CDMS to image proteins directly from tissues. For example, they’ve imaged the distribution of proteoforms (distinct versions of a particular protein) in samples of kidney tissue. They’re able to detect proteoforms as large as 100 kDa directly from tissue.

“I think proteoform imaging has a chance to disrupt histology, but we’re a long way from that,” Kelleher says. “We have to prove ourselves with more clinical research.”

Much of Kelleher’s lab is focused on top-down proteomics, which involves analysis of intact, rather than digested, proteins. In this targeted approach, he takes known disease-related genes and finds as many proteoforms as he can for each gene. The group is mapping all the proteoforms from more than 100 genes.

Kelleher wants to use Orbitrap-​based CDMS, which he calls individual-ion MS, as the underpinning for a proteoform equivalent of the Human Genome Project. “I want to do clinical proteoform research so I can continue proving the value of proteoform measurement to understand human biology,” he says. “I aim to unlock a Human Proteoform Project for the benefit of all.”

Kelleher is using Orbitrap-based CDMS to greatly improve throughput, a key bottleneck in single-cell proteomics. To do this, he spreads cells onto a microscope slide and analyzes about 10,000 ions from a cell in a few seconds. From thousands of cells, he can assign about 1,000 proteoforms, not all of which he has been able to identify. He reported the work last week at a single-​cell proteomics meeting in Boston.

Albert J. R. Heck’s lab at Utrecht University undertook a head-to-head comparison of Orbitrap-based CDMS and mass photometry for analyzing ribosomes, the large molecular machines that synthesize proteins in cells (iScience 2021, DOI: 10.1016/j.isci.2021.103211). The advantage of mass photometry is that the measurement can be performed in nearly physiological conditions. The advantage of CDMS is that it has better mass resolution. But both methods were able to determine the masses of ribosomal particles within 1% accuracy.

Michael Marty, a mass spectrometrist at the University of Arizona, uses Orbitrap-based CDMS to study complex membrane mimics. He makes nanodisks that consist of two protein belts with a lipid bilayer in the middle. As he put more types of lipids in an individual nanodisk, native MS became less able to resolve the spectra. In his first foray into CDMS, he used natural lipid membranes in the nanodisks and was able to readily measure their masses. Now his team is moving beyond nanodisks to look at species such as low-density and high-density lipoproteins, which are much more complex.

Another application of single-molecule mass measurement is in the food industry. For example, David L. Schroeder, senior principal scientist in analytical R&D at Kraft Heinz, has worked with Megadalton Solutions to use CDMS to analyze complex carbohydrates in food. “Accurate and precise complex carbohydrate analytical tools are important to enable Kraft Heinz to deliver new nutritional benefits with flavor and taste to delight consumers,” Schroeder writes in an email. “Historically, complex carbohydrates were difficult to measure, especially direct mass determination.”

Single-particle mass measurements need not be limited to biological materials. The mass and size of polymeric nanoparticles, for example, can affect their properties. Williams, at UC Berkeley, used CDMS to characterize polystyrene nanoparticles used as calibration standards for transmission electron microscopy (TEM) (ACS Nano 2023, DOI: 10.1021/acsnano.3c00539). The nanoparticles have a narrow size distribution, with a mass of about 360 MDa and a diameter of 100–101 nm. The size distribution measured by CDMS agreed well with the size distribution acquired via TEM.

But the researchers were also able to see characteristics that TEM missed. The nanoparticles sometimes form dimers. Because Williams ionizes the nanoparticles from a dilute solution in tiny solvent droplets, the likelihood of more than one nanoparticle being in a single droplet is about one in a million, he says. “We’re seeing dimers, so those dimers have to have come from solution.”

So far, researchers using single-​molecule mass measurements have focused on large molecules and complexes and on heterogeneous mixtures because those are the circumstances in which conventional MS methods fall short. But Heck thinks that there’s reason to consider using the methods for smaller species as well.

“We are forgetting the other advantage—​a million times more sensitive detection,” he says. “I don’t think we know yet how to use that optimally.”

Commercial options

For people who want to do single-​molecule mass measurements in their own labs, the commercial options remain limited, but more products are on the horizon.

For conventional CDMS, Megadalton Solutions, founded by Jarrold, Benjamin Draper, and David Clemmer, another chemistry professor at Indiana University, offers CDMS as a service. Megadalton decided that it didn’t make sense to try to get into the business of selling instruments, so it worked with Indiana University to license the CDMS intellectual property portfolio to the instrument maker Waters.

“If we were going to make instruments, we would also need to have service people, and setting up a network of service people seemed too large a job for us,” Jarrold says. “We were looking for a partner, and Waters was a natural partner.”

Megadalton, in turn, acquired a license to continue providing CDMS services. Waters is developing a commercial CDMS instrument and hopes to have one ready for beta testing in the next few months, according to Davy Petit, who’s in charge of the biologics portfolio at Waters. The company does not yet know when a commercial product will be ready, he says.

Hoyes’s company, TrueMass, is in a similar situation. The company’s sole instrument is being set up in Barran’s facility at the University of Manchester, where researchers will be able to try it out as beta testers. It’s unclear when TrueMass might have an instrument available for sale.

Orbitrap-based CDMS is commercially available as Thermo’s DMT mode, which is exclusively available for the Q Exactive ultrahigh mass range instrument. At this point, Thermo doesn’t have specific plans to expand the availability of the DMT mode to other Orbitrap platforms, according to Amanda Lee, a product marketing manager at the firm.

In addition to Thermo’s DMT mode, two open-source computer programs—from Heck’s group and Marty’s group—are available for analyzing Orbitrap CDMS data. The availability of open-source versions “really lowers the barrier of entry for people who want to try this,” Marty says.

Mass photometers are commercially available from Refeyn, a company started by Daniel Cole, Gavin Young, Kukura, and Benesch in 2018. The company has sold more than 250 instruments so far, according to Matthias Langhorst, the company’s chief product officer. Customers are divided roughly equally between academia and industry, he says.

Jarrold thinks CDMS has the potential to completely change MS of complex mixtures. “A spectrum that would be horrendously complicated because you’ve got all these different overlapping m/z charge states now becomes completely solved,” he says. Instead of overlapping charge distributions, each species has a single peak. “If you can measure that single peak with very high resolution, then you can separate it out from all the other peaks. This becomes very enabling.”

ITALIANO

IN BREVE

Per molecole grandi e miscele complesse, gli spettri di massa convenzionali possono diventare troppo complicati da interpretare. Nuove tecnologie, tra cui varie forme di spettrometria di massa a rilevamento di carica, fotometria di massa e sistemi nanoelettromeccanici, stanno consentendo ai ricercatori di abbandonare la complessità e misurare la massa di singole molecole, complessi e particelle. 

All'Università di Oxford, Justin Benesch studia gli assemblaggi realizzati tra le proteine chiamate chaperoni molecolari e le proteine che proteggono nelle cellule. Questi assemblaggi rallentano la formazione di fibre amiloidi, strutture proteiche allungate che sono una componente importante della cataratta e sono associate a malattie neurodegenerative. Tali complessi proteici e fibre non esistono in singoli stati oligomerici ma come miscele complesse.

In qualità di spettrometrista di massa che studia i sistemi biologici, Benesch si è a lungo affidato alla spettrometria di massa nativa, un approccio che gli consente di esaminare le proteine ed i complessi proteici nelle loro forme native, piuttosto che denaturate e dispiegate. Ma la SM nativa può non essere all'altezza.

"Quando si osservano specie più complesse, si inizia a rendersi conto che gli spettri di massa nativi possono, in alcune circostanze, diventare essenzialmente non interpretabili", afferma Benesch. "I dati ci sono, ma le informazioni non possono essere estratte in modo significativo."

Il problema, osserva Benesch, è che tutto in uno spettro di massa si trova su un asse del rapporto massa-carica (m/z); ogni dato valore di m può avere più valori di z. I picchi si aggrovigliano e si sovrappongono.

Ma cosa accadrebbe se esistessero metodi che consentissero ai ricercatori di osservare la massa da sola anziché m/z?

Tali metodi sono diventati disponibili negli ultimi anni. In effetti, i ricercatori ora hanno diverse opzioni per determinare la massa delle singole molecole. Due di questi metodi sono versioni della spettrometria di massa in cui la carica (z) viene rilevata separatamente da m/z, da qui il nome di rilevamento della carica MS (CDMS). Moltiplicando m/z per z consente di calcolare la massa. Gli altri approcci sono metodi ottici e nanoelettromeccanici.

La tecnica di microscopia ottica nota come fotometria di massa determina la massa dai cambiamenti nella riflettività ad un'interfaccia. Nei sistemi nanoelettromeccanici MS (NEMS-MS), le frequenze vibrazionali di risonanza di minuscoli dispositivi a base di silicio cambiano in risposta alla massa.

Alcuni di questi strumenti sono già disponibili in commercio; altri sono in fase di sviluppo. I ricercatori stanno usando i metodi per rispondere a una domanda chiave nella terapia genica e studiare meglio grandi biomolecole e complessi.

Varietà di CDMS

Esistono diversi tipi di CDMS. Nel CDMS basato su trappole ioniche lineari, pochi ioni alla volta entrano in un tubo metallico dotato di elettrodi su entrambe le estremità. Quando gli ioni si spostano avanti e indietro tra gli elettrodi, inducono una carica sul tubo che viene rilevata da un amplificatore. La frequenza di oscillazione degli ioni viene utilizzata per determinare il loro m/z tramite una comune procedura matematica guidata dal computer nota come analisi dei dati della trasformata di Fourier.

La carica viene calcolata dall'ampiezza del segnale della trasformata di Fourier e può essere misurata con sufficiente precisione per assegnare correttamente lo stato di carica con un basso tasso di errore.

"Questa è la chiave per le misurazioni CDMS ad alta risoluzione di massa e richiede che la carica sia misurata con una precisione migliore di" due decimi della carica di un singolo elettrone, afferma Martin F. Jarrold, professore di chimica presso l'Indiana University Bloomington e leader nel settore. "La sfida in CDMS ora è ridurre il tempo necessario per effettuare la misurazione della carica ad alta precisione al di sotto di 1 s."

Ma analizzare solo uno o una manciata di ioni alla volta significa che il CDMS convenzionale è lento. Ogni ione può essere misurato rapidamente, ma molti singoli ioni devono essere misurati per costruire uno spettro di massa. Alcuni ricercatori stanno lavorando su modi per accelerare il processo.

John Hoyes, che è dietro l'operazione con una sola persona TrueMass, ha progettato uno strumento CDMS che scambia la configurazione lineare con un percorso a otto. In quella geometria, gli ioni non devono rallentare per cambiare direzione all'estremità di un tubo.

"Il fatto che i miei ioni volino in un volume piuttosto elevato e sempre alla massima velocità significa che hanno meno probabilità di interagire tra loro", afferma Hoyes. Può analizzare più ioni contemporaneamente di quanto si possa fare con il progetto lineare.

Hoyes ha costruito lo strumento TrueMass in collaborazione con due società: Fasmatech, un'azienda che produce sorgenti di ionizzazione elettrospray MS, e Spectroswiss, specializzata nell'analisi dei dati della trasformata di Fourier. Lo strumento è in viaggio verso il laboratorio di Perdita Barran all'Università di Manchester.

"Lo renderemo disponibile a chiunque voglia usarlo", afferma Barran. “Questo può aiutare altre persone a vedere se vogliono usarlo. E probabilmente aiuterà ad esplorare lo spazio delle applicazioni".

Evan R. Williams, professore di chimica all'Università della California, Berkeley, sta lavorando per accelerare l'analisi del CDMS. "Se questa sarà una tecnica pratica, nessuno vuole sedersi lì e acquisire dati per 20, 30, 40 minuti", afferma Williams. "Il nostro obiettivo è quello di ottenere questo fino alla scala temporale LC [cromatografia liquida]."

Williams vuole analizzare il maggior numero possibile di ioni contemporaneamente. Più dispositivi microfabbricati in parallelo sarebbero un'opzione, ma la costosa elettronica richiesta per il rilevamento rende un tale approccio impraticabile, afferma. "Ha molto più senso inserire nel dispositivo il numero massimo di ioni possibile pur essendo in grado di tracciare ogni singolo ione." L'attuale strumento del suo gruppo può monitorare simultaneamente 10-30 ioni; il gruppo sta lavorando per essere in grado di monitorare fino a 100 ioni alla volta.

“Stiamo disaccoppiando la misurazione della frequenza. Le persone traducono la frequenza in m/z, ma questo presuppone un'energia costante", afferma Williams. Permette agli ioni di entrare nella trappola con la stessa m/z ma energie leggermente diverse. "Le energie non devono essere molto diverse, perché la nostra precisione di frequenza è molto buona", afferma Williams. "Anche un piccolo cambiamento di energia ci consente di suddividere quei segnali".

L'altro tipo di CDMS viene eseguito su spettrometri di massa Orbitrap. La versione della società di strumenti Thermo Fisher Scientific, la modalità Direct Mass Technology (DMT), è stata sviluppata in collaborazione con Neil Kelleher e colleghi della Northwestern University. Non sono necessarie modifiche hardware all'Orbitrap. Le principali differenze risiedono nel numero di ioni ammessi nella trappola e nel modo in cui i dati vengono elaborati. In modalità DMT, circa 800 ioni entrano nella trappola alla volta. Per fare un confronto, 3 milioni di ioni vengono tipicamente fatti entrare nell'Orbitrap alla volta per gli spettri di massa convenzionali.

Come nell'Orbitrap MS convenzionale, m/z per ogni ione è determinato dalla sua frequenza di movimento lungo un elettrodo centrale. Inoltre, la modalità DMT somma la carica indotta sull'elettrodo esterno dell'Orbitrap, tracciando ciò che Thermo chiama dati STORI (Selective Temporal Overview of Resonant ions), che tracciano la durata di un singolo ione. La pendenza del grafico STORI di uno ione è proporzionale alla carica su quello ione.

Altre misure di massa di una singola molecola

Altre opzioni per la misurazione della massa di una singola molecola non implicano affatto la spettrometria di massa. Invece, usano metodi ottici e nanomeccanici.

La fotometria di massa è un metodo di microscopia inventato dai gruppi di Benesch e Philipp Kukura a Oxford. "Fondamentalmente, è un microscopio ottico", afferma Kukura. "È ottimizzato per rilevare minuscoli cambiamenti della riflettività di una superficie." La superficie in questione è l'interfaccia tra il vetro e l'acqua.

Quando qualcosa, come una proteina, si lega all'interfaccia, diffonderà luce. L'ottica del microscopio raccoglie la luce diffusa insieme alla luce riflessa, e le due interferiscono su una fotocamera per formare un'immagine.

"Se ottimizzi il percorso ottico, puoi massimizzare la differenza di fase tra la luce diffusa e quella riflessa", afferma Kukura. "In tal modo massimizzi il contrasto utilizzando l'interferenza tra luce diffusa e riflessa."

La variazione di riflettività è proporzionale alla massa della molecola. Per essere rilevata dalla fotometria di massa, una molecola deve essere di almeno 30 kDa. Per essere completamente risolte, le specie devono differire in massa di almeno 20 kDa. Sebbene sia necessaria una differenza di 20 kDa per risolvere i picchi, lo strumento è in grado di rilevare spostamenti di massa di appena 1 kDa.

La fotometria di massa non è ancora pronta per misurare la massa con la massima precisione: le barre di errore sono troppo ampie per questo. “Anche se la risoluzione per i singoli picchi in questa fase non è neanche lontanamente vicina a quella che si può ottenere in uno spettrometro di massa, si ottiene solo un picco per specie. Quindi ottieni chiarezza nel tuo spettro che compensa la risoluzione inferiore ", afferma Benesch. "Per cose eterogenee, spesso è meglio utilizzare il metodo che offre meno picchi nello spettro, anche se sono singolarmente ad una risoluzione inferiore."

Concettualmente, la fotometria di massa è abbastanza semplice; farlo funzionare, non così tanto. "Se vai a comprare o costruisci un microscopio e lo provi, non vedi nulla", dice Kukura. "Sono 15 anni di ingegneria e ricerca piuttosto hardcore per ottenere questi livelli di sensibilità."

NEMS-MS, un metodo nanoelettromeccanico, utilizza minuscoli risonatori a base di silicio per misurare la massa delle singole molecole. Ogni risonatore, che consiste in un raggio bloccato su entrambe le estremità, oscilla ad una frequenza particolare. Quando una molecola, come una proteina, si adsorbe al raggio, la frequenza di oscillazione diminuisce. Tale variazione di frequenza è proporzionale alla massa della molecola.

I NEMS sono particolarmente adatti per misurazioni di massa di grandi molecole e assiemi. "I NEMS sono fantastici perché hanno una gamma di massa superiore illimitata", afferma Michael Roukes, fisico presso il California Institute of Technology e leader nel settore. “Qualsiasi tipo di spettrometria di massa basata sull'ottica ionica ha essenzialmente un potere risolutivo che diminuisce con l'aumentare della massa della specie. I NEMS sono ottimi perché il potere risolutivo aumenta con la massa dell'analita».

A cosa serve?

I ricercatori si stanno rivolgendo alle misurazioni della massa di singole molecole per rispondere a domande a cui è difficile rispondere con altri metodi.

Un'applicazione è nella terapia genica. I capsidi del virus adeno-associato (AAV), i gusci proteici dei virus, vengono utilizzati nella terapia genica per fornire materiale genetico alle cellule. I ricercatori progettano la combinazione di capside e carico, in modo da sapere quale dovrebbe essere la massa totale. Ma i capsidi non sempre trovano il loro carico, quindi i ricercatori non sanno se un determinato capside sia pieno, parzialmente pieno o vuoto. Le misurazioni della massa di una singola molecola forniscono un modo rapido per rispondere a questa domanda.

Uno dei motivi per cui è importante sapere se i capsidi sono vuoti o pieni è che gli AAV possono causare reazioni avverse, quindi i capsidi vuoti dovrebbero essere ridotti al minimo, afferma Bryan Troxell, ex capo del team di sviluppo analitico presso la società di terapia genica StrideBio e ora presso AjaxBio, che fornisce consulenza per programmi di terapia genica preclinica. Troxell ha collaborato con la società di Jarrold, Megadalton Solutions, per analizzare gli AAV. Troxell vorrebbe utilizzare il CDMS in combinazione con esperimenti di biologia cellulare per studiare come il numero di capsidi pieni, parzialmente pieni e vuoti influisce sulla risposta cellulare alla terapia genica.

Jarrold sta usando CDMS per studiare altri virus oltre agli AAV. Nel caso del norovirus, ha visto strutture capsidiche inaspettate. La proteina del capside si assembla in tessere, che possono avere vari numeri di proteine del capside. Sessanta di quelle tessere formano un icosaedro. Ad esempio, la struttura T = 3, che ha tre proteine in ciascuna piastrella, ha 180 proteine nell'icosaedro finale.

Usando CDMS, Jarrold ed i suoi colleghi si sono imbattuti in un'insolita particella nonicosaedrica. "Si ottiene prendendo una particella T = 4, tagliandola al centro, inserendovi un anello di 10 esagoni, ruotando una delle estremità di circa 18° e rimettendola insieme", afferma Jarrold. “Sei passato da qualcosa che era approssimativamente sferico a qualcosa che è allungato. In alcune circostanze, questa è la caratteristica più importante nello spettro”.

Jarrold e colleghi stanno usando CDMS per vedere strutture ancora più grandi, come un T = 7, con 420 proteine. Ma hanno difficoltà a confermare quelle strutture con la microscopia crioelettronica (cryo-EM), un metodo di biologia strutturale comune. “Non c'è dubbio che queste sono caratteristiche negli spettri di massa. Sono picchi taglienti. Hanno le masse giuste per particolari combinazioni di esagoni e pentagoni, che è quello che ti aspetteresti nell'assemblaggio del capside virale", dice Jarrold. "Ma mancano nelle misurazioni crio-EM."

La fotometria di massa può essere utilizzata per lo screening di campioni prima di eseguire altri metodi di biologia strutturale, come la crio-EM, afferma Kukura. I ricercatori possono vedere immediatamente se un complesso è assemblato correttamente o aggregato in gruppi. Senza sapere se un campione è nella forma prevista, i ricercatori possono interpretare male i loro risultati o perdere tempo con dati inutilizzabili. "Qui, vedi immediatamente se hai un campione omogeneo o meno", dice Kukura.

Le misurazioni della massa di una singola molecola possono anche essere utili per strutture più piccole dei virus, ma la cui dimensione o complessità è comunque impegnativa per la SM convenzionale.

"Per le terapie a base di proteine, ci piace guardare una molecola a livello di peptide, a livello di subunità ed a livello intatto", afferma Thomas Powers, uno scienziato principale senior in R&S analitico presso la società farmaceutica Pfizer. “La sfida che abbiamo quando le cose diventano sempre più grandi è che gli spettrometri di massa convenzionali non sono in grado di osservare la molecola intatta”. Inoltre, afferma Powers, il CDMS è uno strumento prezioso per caratterizzare terapie proteiche eterogenee che presentano modifiche come le molecole di zucchero attaccate.

Kelleher e colleghi usano il CDMS basato su Orbitrap per visualizzare le proteine direttamente dai tessuti. Ad esempio, hanno ripreso la distribuzione delle proteoforme (versioni distinte di una particolare proteina) in campioni di tessuto renale. Sono in grado di rilevare proteoforme grandi fino a 100 kDa direttamente dal tessuto.

"Penso che l'imaging proteoforme abbia la possibilità di interrompere l'istologia, ma siamo molto lontani da questo", afferma Kelleher. "Dobbiamo metterci alla prova con più ricerca clinica".

Gran parte del laboratorio di Kelleher si concentra sulla proteomica top-down, che prevede l'analisi di proteine ​​intatte, piuttosto che digerite. In questo approccio mirato, prende noti geni correlati alla malattia e trova quante più proteoforme possibile per ciascun gene. Il gruppo sta mappando tutte le proteoforme di oltre 100 geni.

Kelleher vuole utilizzare il CDMS basato su Orbitrap, che chiama MS a ioni individuali, come base per un equivalente proteoforme del Progetto Genoma Umano. "Voglio fare ricerca clinica sulla proteoforma in modo da poter continuare a dimostrare il valore della misurazione della proteoforma per comprendere la biologia umana", afferma. "Miro a sbloccare un Progetto Proteoforme Umano a beneficio di tutti."

Kelleher sta utilizzando CDMS basato su Orbitrap per migliorare notevolmente il throughput, un collo di bottiglia chiave nella proteomica a cella singola. Per fare ciò, sparge le cellule su un vetrino da microscopio e analizza circa 10.000 ioni da una cellula in pochi secondi. Da migliaia di cellule, può assegnare circa 1.000 proteoforme, non tutte che è stato in grado di identificare. Ha riferito del lavoro la scorsa settimana a un incontro di proteomica a cellula singola a Boston.

Il laboratorio di Albert J. R. Heck dell'Università di Utrecht ha intrapreso un confronto diretto tra CDMS basato su Orbitrap e fotometria di massa per analizzare i ribosomi, le grandi macchine molecolari che sintetizzano le proteine nelle cellule (iScience 2021, DOI: 10.1016/j.isci.2021.103211) . Il vantaggio della fotometria di massa è che la misurazione può essere eseguita in condizioni quasi fisiologiche. Il vantaggio di CDMS è che ha una migliore risoluzione di massa. Ma entrambi i metodi sono stati in grado di determinare le masse delle particelle ribosomiali con una precisione dell'1%.

Michael Marty, uno spettrometrista di massa presso l'Università dell'Arizona, utilizza CDMS basato su Orbitrap per studiare complesse mimiche di membrana. Realizza nanodischi costituiti da due cinture proteiche con un doppio strato lipidico nel mezzo. Quando ha inserito più tipi di lipidi in un singolo nanodisco, la SM nativa è diventata meno in grado di risolvere gli spettri. Nella sua prima incursione nel CDMS, ha utilizzato membrane lipidiche naturali nei nanodischi ed è stato in grado di misurare prontamente le loro masse. Ora il suo gruppo si sta spostando oltre i nanodischi per esaminare specie come le lipoproteine a bassa ed ad alta densità, che sono molto più complesse.

Un'altra applicazione della misurazione della massa di una singola molecola è nell'industria alimentare. Ad esempio, David L. Schroeder, senior principal scientist in R&S analitico presso Kraft Heinz, ha collaborato con Megadalton Solutions per utilizzare il CDMS per analizzare i carboidrati complessi negli alimenti. "Strumenti di analisi dei carboidrati complessi accurati e precisi sono importanti per consentire a Kraft Heinz di offrire nuovi benefici nutrizionali con sapore e gusto per deliziare i consumatori", scrive Schroeder in una e-mail. "Storicamente, i carboidrati complessi erano difficili da misurare, in particolare la determinazione diretta della massa".

Le misurazioni della massa di una singola particella non devono essere limitate ai materiali biologici. La massa e le dimensioni delle nanoparticelle polimeriche, ad esempio, possono influire sulle loro proprietà. Williams, presso la UC Berkeley, ha utilizzato il CDMS per caratterizzare le nanoparticelle di polistirene utilizzate come standard di calibrazione per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) (ACS Nano 2023, DOI: 10.1021/acsnano.3c00539). Le nanoparticelle hanno una distribuzione dimensionale ristretta, con una massa di circa 360 MDa e un diametro di 100-101 nm. La distribuzione delle dimensioni misurata da CDMS concordava bene con la distribuzione delle dimensioni acquisita tramite TEM.

Ma i ricercatori sono stati anche in grado di vedere le caratteristiche che TEM ha mancato. Le nanoparticelle a volte formano dimeri. Poiché Williams ionizza le nanoparticelle da una soluzione diluita in minuscole goccioline di solvente, la probabilità che più di una nanoparticella sia presente in una singola gocciolina è di circa una su un milione, afferma. "Stiamo vedendo dimeri, quindi quei dimeri devono provenire dalla soluzione."

Finora, i ricercatori che hanno utilizzato le misurazioni della massa di una singola molecola si sono concentrati su grandi molecole e complessi e su miscele eterogenee perché queste sono le circostanze in cui i metodi MS convenzionali falliscono. Ma Heck pensa che ci sia motivo di considerare l'utilizzo dei metodi anche per le specie più piccole.

"Stiamo dimenticando l'altro vantaggio: un rilevamento un milione di volte più sensibile", afferma. "Non credo che sappiamo ancora come usarlo in modo ottimale."

Opzioni commerciali

Per le persone che desiderano effettuare misurazioni della massa di una singola molecola nei propri laboratori, le opzioni commerciali rimangono limitate, ma altri prodotti sono all'orizzonte.

Per i CDMS convenzionali, Megadalton Solutions, fondata da Jarrold, Benjamin Draper e David Clemmer, un altro professore di chimica all'Università dell'Indiana, offre CDMS come servizio. Megadalton ha deciso che non aveva senso cercare di entrare nel business della vendita di strumenti, quindi ha collaborato con l'Università dell'Indiana per concedere in licenza il portafoglio di proprietà intellettuale di CDMS al produttore di strumenti Waters.

"Se avessimo intenzione di realizzare strumenti, avremmo anche bisogno di personale di servizio e la creazione di una rete di personale di servizio sembrava un lavoro troppo impegnativo per noi", afferma Jarrold. "Stavamo cercando un partner e Waters era un partner naturale".

Megadalton, a sua volta, ha acquisito una licenza per continuare a fornire servizi CDMS. Waters sta sviluppando uno strumento CDMS commerciale e spera di averne uno pronto per il beta test nei prossimi mesi, secondo Davy Petit, responsabile del portafoglio di prodotti biologici presso Waters. L'azienda non sa ancora quando sarà pronto un prodotto commerciale, dice.

L'azienda di Hoyes, TrueMass, si trova in una situazione simile. L'unico strumento dell'azienda è in fase di installazione presso la struttura di Barran presso l'Università di Manchester, dove i ricercatori potranno provarlo come beta tester. Non è chiaro quando TrueMass potrebbe avere uno strumento disponibile per la vendita.

Il CDMS basato su Orbitrap è disponibile in commercio come modalità DMT di Thermo, che è disponibile esclusivamente per lo strumento Q Exactive ad altissima massa. A questo punto, Thermo non ha piani specifici per espandere la disponibilità della modalità DMT ad altre piattaforme Orbitrap, secondo Amanda Lee, product marketing manager dell'azienda.

Oltre alla modalità DMT di Thermo, sono disponibili due programmi per computer open source, del gruppo di Heck e del gruppo di Marty, per analizzare i dati CDMS di Orbitrap. La disponibilità di versioni open source "abbassa davvero la barriera di accesso per le persone che vogliono provarlo", afferma Marty.

I fotometri di massa sono disponibili in commercio da Refeyn, un'azienda fondata da Daniel Cole, Gavin Young, Kukura e Benesch nel 2018. L'azienda ha venduto finora più di 250 strumenti, secondo Matthias Langhorst, Chief Product Officer dell'azienda. I clienti sono divisi più o meno equamente tra il mondo accademico e l'industria, afferma.

Jarrold pensa che CDMS abbia il potenziale per cambiare completamente la SM di miscele complesse. "Uno spettro che sarebbe terribilmente complicato perché hai tutti questi diversi stati di carica m/z sovrapposti ora diventa completamente risolto", dice. Invece di sovrapporre le distribuzioni di carica, ogni specie ha un singolo picco. “Se riesci a misurare quel singolo picco con una risoluzione molto elevata, puoi separarlo da tutti gli altri picchi. Questo diventa molto abilitante.

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https://cen.acs.org/analytical-chemistry/mass-spectrometry/emerging-world-single-molecule-mass/101/i18?utm_source=Facebook&utm_medium=Social&utm_campaign=CEN&fbclid=IwAR0bSkFMP1RIXYd3mxbAelABnd6olqjhD-BBQ9t-iEO2nU5O6V-euOg8s4A#