Innovative Spectroscopy Is Enhancing Protein Structure Determination / La spettroscopia innovativa migliora la determinazione della struttura proteica

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Proteins are central to many disciplines within the life sciences. Understanding how they are formed, how they function, their role in health and disease and importantly the ways in which they respond to therapies and pharmaceutical intervention are all key aspects.
Whilst proteins are essentially created from our genetic code, the picture is far more complicated, and they are not simply a 2D representation of a genetic template. Transcription and translation are part of the picture but beyond this there are modifications, secondary and tertiary structures, all of which are influenced by the environment surrounding the forming protein. The same is true of protein-based pharmaceuticals, changes in which could have significant impact on efficacy and safety. Therefore, being able to understand what forms of a protein are present in their natural conditions, even if present only at low levels, is important for analysts.

We spoke to Julien Bradley, CEO of RedShiftBio, about their technology, the problems in protein structure analysis it overcomes and the importance of being able to make accurate and representative measurements.

Karen Steward (KS): Can you tell us a bit about your technology and how its development came about?

Julien Bradley (JB): Microfluidic modulation spectroscopy (MMS) as found in the AQS3™pro from RedShiftBio was developed in response to an unmet need in the biopharmaceutical analytical testing space. It is well known that secondary structure can be deduced from classical spectroscopic techniques, such as circular dichroism (CD) and Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy techniques, along with several others such as Raman and nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. These techniques, particularly the more incumbent CD and FTIR suffer from several limitations that make them of little use to quantify a fully formulated biopharmaceutical. These limitations include concentration and incompatibility with formulation components.

RedShiftBio developed MMS as an advancement on the basic principles of infrared spectroscopy. The company beginnings were in laser and optical systems, where they focused on applications of the quantum cascade laser. Utilizing this technology to focus on the Amide I band of proteins, the technology brought about almost 100-fold sensitivity increase, facilitating the measurement of samples that otherwise could not be measured.

KS: What are the problems with existing solutions and how does your platform overcome them?

JB: Traditional spectrophotometers used to assess protein secondary structure have limitations in both concentration range and chemical compatibility. In addition, there are limited automated solutions available, with FTIR being particularly labor intensive. Biopharmaceutical drug products are often high in concentration, and consist of complex formulations with buffers, surfactants, antioxidants, and more being part of the final product. These complex formulations are not compatible with CD. FTIR presents its own limitations, background referencing can be challenging due to drift. With manual sample preparation, measuring a single sample can be labor intensive.

The AQS3™pro utilizes MMS, a technique that rapidly alternates sample and buffer through the detection zone. Combined with a quantum cascade laser, the system measures absorbance of a protein across the Amide I band with over 100 x greater sensitivity relative to traditional FTIR. In addition, automated background referencing removes background drift, providing high quality spectra. With the addition of the AQS3™delta software package, processing of raw data to the final results has been streamlined eliminating the complexities of traditional spectral processing.

KS: Why is the accurate measurement of protein secondary structure important?

JB: Change in protein structure is directly linked to change in efficacy. One of the major risks associated with biopharmaceutical products is the presence of protein aggregates, commonly caused by instability in the protein higher order structure (HOS). These aggregates are associated with multiple risk factors such as injection site swelling, anaphylaxis, and the production of anti-drug antibodies, reducing the efficacy of the drug. As a fundamental building block of protein HOS, changes in secondary structure can be an early warning sign of longer-term stability issues. Secondary structure can be affected by many stressors including oxidation, deamidation, shear stress, cavitation, pH changes and more. For this reason, monitoring of secondary structure through the entire development and manufacturing process is critical to ensuring quality drug products.

KS: Who do you see as being your end user? Could anyone operate the system?

JB: Knowing how critical secondary structure can be to the quality of a biopharmaceutical, the AQS3™pro can provide critical quality data throughout the entire process of discovery through development into manufacturing. With the addition of automated sample analysis, the platform can be a workhorse for even the most demanding labs. Key applications of the system include formulation development, process design and development, quality assurance and control, biosimilar development and more. The AQS3™pro provides critical assessment of structural similarity and comparability, providing a direct measure of protein stability.

KS: In what areas is it being taken up? Can you tell us about some interesting applications to which your technology is being applied?

JB: Although interest in the AQS3™pro has been shown all across the drug development pipeline, the most interesting applications have been focused around observing effects of excipients such as polysorbate80 on secondary structure, as well as monitoring the effect of purification stages including viral inactivation and protein A purification stages where significant pH shifts are required, in some cases for extended periods of time.

In conjunction with Janssen, the AQS3™pro was used to monitor a viral inactivation step for a drug substance, where a shift to pH 3.5 resulted in observable changes in β-sheet content. Interestingly, the data showed that over an extended period of about 15-18 hours, the secondary structure composition returned to that of the starting material, providing evidence of stability under these extreme conditions.

KS: What areas still pose challenges? Are there aspects in which you would like to expand in the future?

JB: While today we are focused on protein secondary structure, we could potentially leverage MMS for other molecule types in future (mRNA for example).

ITALIANO

Le proteine ​​sono fondamentali per molte discipline all'interno delle scienze della vita. Comprendere come si formano, come funzionano, il loro ruolo nella salute e nella malattia e, soprattutto, il modo in cui rispondono alle terapie e all'intervento farmaceutico sono tutti aspetti chiave.

Mentre le proteine ​​sono essenzialmente create dal nostro codice genetico, il quadro è molto più complicato e non sono semplicemente una rappresentazione 2D di un modello genetico. La trascrizione e la traduzione fanno parte del quadro, ma oltre a ciò ci sono modifiche, strutture secondarie e terziarie, tutte influenzate dall'ambiente circostante la proteina formatrice. Lo stesso vale per i prodotti farmaceutici a base di proteine, i cui cambiamenti potrebbero avere un impatto significativo sull'efficacia e la sicurezza. Pertanto, essere in grado di capire quali forme di una proteina sono presenti nelle loro condizioni naturali, anche se presenti solo a bassi livelli, è importante per gli analisti.

Abbiamo parlato con Julien Bradley, CEO di RedShiftBio, della loro tecnologia, dei problemi nell'analisi della struttura proteica che supera e dell'importanza di poter effettuare misurazioni accurate e rappresentative.

Karen Steward (KS): Puoi parlarci un po' della tua tecnologia e di come è nato il suo sviluppo?

Julien Bradley (JB): la spettroscopia di modulazione microfluidica (MMS) presente nell'AQS3 ™ pro di RedShiftBio è stata sviluppata in risposta a un'esigenza insoddisfatta nello spazio di analisi analitica biofarmaceutica. È noto che la struttura secondaria può essere dedotta dalle tecniche spettroscopiche classiche, come dicroismo circolare (CD) e tecniche di spettroscopia a infrarossi con trasformata di Fourier (FTIR), insieme a molti altri come Raman e spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR). Queste tecniche, in particolare il CD e FTIR più storico, soffrono di numerosi limiti che li rendono di scarsa utilità per quantificare un biofarmaco completamente formulato. Queste limitazioni includono concentrazione e incompatibilità con i componenti di formulazione.

RedShiftBio ha sviluppato l'MMS come avanzamento dei principi di base della spettroscopia infrarossa. Gli inizi dell'azienda furono nei sistemi laser e ottici, dove si concentrarono sulle applicazioni del laser a cascata quantica. Utilizzando questa tecnologia per concentrarsi sulla banda di proteine ​​Amide I, la tecnologia ha comportato un aumento della sensibilità di quasi 100 volte, facilitando la misurazione di campioni che altrimenti non avrebbero potuto essere misurati.

KS: Quali sono i problemi con le soluzioni esistenti e in che modo la tua piattaforma li supera?

JB: gli spettrofotometri tradizionali utilizzati per valutare la struttura secondaria delle proteine ​​presentano limiti sia nel range di concentrazione che nella compatibilità chimica. Inoltre, sono disponibili soluzioni automatizzate limitate, con FTIR particolarmente laborioso. I prodotti farmaceutici biofarmaceutici sono spesso ad alta concentrazione e consistono in formulazioni complesse con tamponi, tensioattivi, antiossidanti e altri che fanno parte del prodotto finale. Queste formulazioni complesse non sono compatibili con il CD. FTIR presenta i propri limiti, i riferimenti in background possono essere difficili a causa della deriva. Con la preparazione manuale del campione, la misurazione di un singolo campione può richiedere molto lavoro.

AQS3 ™ pro utilizza MMS, una tecnica che alterna rapidamente campione e buffer attraverso la zona di rilevamento. Combinato con un laser a cascata quantica, il sistema misura l'assorbanza di una proteina attraverso la banda Amide I con una sensibilità di oltre 100 volte maggiore rispetto al FTIR tradizionale. Inoltre, il riferimento automatico in background rimuove la deriva dello sfondo, fornendo spettri di alta qualità. Con l'aggiunta del pacchetto software delta AQS3 ™, l'elaborazione dei dati grezzi ai risultati finali è stata semplificata eliminando le complessità dell'elaborazione spettrale tradizionale.

KS: Perché è importante la misurazione accurata della struttura secondaria delle proteine?

JB: il cambiamento nella struttura proteica è direttamente collegato al cambiamento di efficacia. Uno dei maggiori rischi associati ai prodotti biofarmaceutici è la presenza di aggregati proteici, comunemente causati dall'instabilità nella struttura di ordine superiore delle proteine ​​(HOS). Questi aggregati sono associati a molteplici fattori di rischio come gonfiore nel sito di iniezione, anafilassi e produzione di anticorpi anti-farmaco, riducendo l'efficacia del farmaco. Come elemento fondamentale della proteina HOS, i cambiamenti nella struttura secondaria possono essere un segnale di avvertimento precoce di problemi di stabilità a più lungo termine. La struttura secondaria può essere influenzata da molti fattori di stress tra cui ossidazione, deamidazione, sollecitazione a taglio, cavitazione, variazioni del pH e altro. Per questo motivo, il monitoraggio della struttura secondaria durante l'intero processo di sviluppo e produzione è fondamentale per garantire prodotti farmaceutici di qualità.

KS: Chi vedi come il tuo utente finale? Qualcuno potrebbe far funzionare il sistema?

JB: Sapendo quanto può essere critica la struttura secondaria per la qualità di un biofarmaco, AQS3 ™ pro può fornire dati di qualità critica durante l'intero processo di scoperta attraverso lo sviluppo nella produzione. Con l'aggiunta dell'analisi automatizzata del campione, la piattaforma può essere un cavallo di battaglia anche per i laboratori più esigenti. Le principali applicazioni del sistema includono lo sviluppo della formulazione, la progettazione e lo sviluppo dei processi, la garanzia e il controllo della qualità, lo sviluppo biosimilare e altro ancora. AQS3 ™ pro fornisce una valutazione critica della somiglianza strutturale e della comparabilità, fornendo una misura diretta della stabilità delle proteine.

KS: In quali settori è stato ripreso? Puoi parlarci di alcune interessanti applicazioni a cui viene applicata la tua tecnologia?

JB: Sebbene l'interesse per AQS3 ™ pro sia stato mostrato in tutta la STRUTTURA di sviluppo del farmaco, le applicazioni più interessanti sono state focalizzate sull'osservazione degli effetti di eccipienti come il polisorbato80 sulla struttura secondaria, nonché sul monitoraggio dell'effetto delle fasi di purificazione, compresa l'inattivazione virale e fasi di purificazione della proteina A in cui sono richiesti significativi spostamenti del pH, in alcuni casi per lunghi periodi di tempo.

Insieme a Janssen, AQS3 ™ pro è stato utilizzato per monitorare una fase di inattivazione virale di una sostanza farmaceutica, in cui uno spostamento a pH 3,5 ha comportato cambiamenti osservabili nel contenuto di fogli β. È interessante notare che i dati hanno mostrato che per un periodo prolungato di circa 15-18 ore, la composizione della struttura secondaria è tornata a quella del materiale di partenza, fornendo prove di stabilità in queste condizioni estreme.

KS: Quali aree rappresentano ancora delle sfide? Ci sono aspetti in cui vorresti espanderti in futuro?

JB: Mentre oggi ci concentriamo sulla struttura secondaria delle proteine, potremmo potenzialmente sfruttare l'MMS per altri tipi di molecole in futuro (ad esempio mRNA).

Da:

https://www.technologynetworks.com/proteomics/blog/innovative-spectroscopy-is-enhancing-protein-structure-determination-333844?utm_campaign=NEWSLETTER_TN_Proteomics&utm_source=hs_email&utm_medium=email&utm_content=87133643&_hsenc=p2ANqtz-9YiudQfIu1DdM6coPUFbyMmANaln_UTZ5K39tesbVlOmi9R5oPm9EWzPO14UV4BXaabdGm35IJROy4HVrn75DRRFzcWipPeNAU1lnmYukHLq9VnZ4&_hsmi=87133643