Exploratory biomarker assays: key assay parameters to evaluate in the face of evolving biomarker context-of-use / Saggi esplorativi dei biomarcatori: parametri chiave del dosaggio da valutare di fronte all'evoluzione del contesto d'uso dei biomarcatori

Exploratory biomarker assays: key assay parameters to evaluate in the face of evolving biomarker context-of-use / Saggi esplorativi dei biomarcatori: parametri chiave del dosaggio da valutare di fronte all'evoluzione del contesto d'uso dei biomarcatori

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

The field of biomarkers has seen extensive growth enabled by multiple advanced technological tools at our disposal. Such tools have enabled quantitative and semi-quantitative measurement of protein analytes in soluble matrices such as blood (serum or plasma), urine and cerebrospinal fluid. Soluble biomarkers are routinely analyzed using ligand-binding assay (LBA) and LC–MS/MS-based approaches, however LBA-based biomarker assays will be the focus of this discussion. The field of LBA has evolved from plate-based ELISA to now multiple options for ultrasensitive platforms such as Simoa® and SMCxPro®. Despite assay validation guidelines for bioanalytical assays, inherent challenges of establishing biomarker assays make it an undertaking to follow a harmonized approach. One of the many challenges in biomarker assay development lies in the lack of true reference standard. Unlike pharmacokinetic (PK) assays, the calibrant material used for biomarker assays may not represent the endogenous analyte. Oftentimes, in biomarker assays, recombinant proteins with different physicochemical properties than the endogenous analyte are used instead. Additional challenges lie in inadequate and insufficient understanding of the biology of biomarker, such as presence and relevance of multiple isoforms, protein truncations, change in biomarker with disease state and lack of relevant samples during assay development.

Biomarker assay validation

Biomarker assays generally follow a fit-for-purpose validation (FFP) driven by the biomarker's context of use (COU). To state it simply, the level of assay validation is determined by the end use of the biomarker data. However, in the exciting and ever-evolving field of biomarker research, an initial set of data generated as part of a purely exploratory effort may inflate into a substantial interest beyond exploratory, thereby changing its COU. For example, data generated from a multiplex cytokine panel originally intended for biomarker discovery during early-stage clinical development may lead to identification of key biomarkers that become essential components of program-related decision making. Despite existence of assay development and validation guidance documents, due to the FFP validation practice for biomarkers, differences may exist across analysts either due to organizational practices or due to inherent challenges of developing a biomarker assay. Therefore, definition of what constitutes a COU-driven FFP validation may be left at the discretion of a technical expert. Often in biomarker assays, such practices may include lack of assay performance data collected using endogenous samples and sole reliance on standard curve performance and use of spiked quality control (QC) samples, both generated using purified recombinant or synthetic protein. In situations where an exploratory biomarker has progressed beyond exploratory and thereby has evolved in its COU, it may then become necessary to retrace the initial assay validation steps and re-establish parameters to define biomarker assay performance and qualification criteria. This process may not only be time consuming but, based on the initial level of validation performed (or lack thereof), may lead to unwanted surprises as well (e.g., discovery of assay cross-reactivity). A recommendation for exploratory biomarker assays that are on an FFP validation path is therefore to involve guided but versatile steps, even during the infantile interrogation of a biomarker.

Charting the path on biomarker assay method development

A close collaboration between the biomarker strategy-setting scientists and technology experts will allow the right questions to be asked at the onset of any assay development effort, thereby setting the right FFP validation criteria driven by the COU of the biomarker.

Regardless of intended application of biomarker data, one of the most important decisions in assay method development is critical reagent selection. Selection of critical reagents such as the calibrator material and reagent antibodies form a critical juncture for benchmarking assay quality. LBA biomarker assays are typically not absolute quantitation; however, they are relative quantitation to the calibrator material being utilized. Therefore, where possible effort must be made to select calibrator material that represents the endogenous form of the analyte. Also, reagent antibodies must be selected for their ability to not just bind calibrator material but also endogenous material. Similarly, appropriate technological solutions should be utilized to characterize calibrator material as well as assay-associated reagent antibodies. Such technological solutions include MS to understand glycosylation patterns, amino acid sequence, length and purity. Assay method development also involves determination of basic analytical performance such as LOD, LOQ, ULOQ and other factors such as QC selection and performance evaluation. We hereby propose some additional but minimal method feasibility experiments for even highly exploratory biomarkers. Our recommendations come into effect after critical reagent selection but before initiating FFP assay validation. These recommendations can be followed when utilizing off-the-shelf commercial biomarker LBA kits as well.

Minimal method feasibility recommendations

For highly exploratory biomarkers undergoing a COU-driven FFP validation, it is critical to examine three additional parameters as part of method feasibility: parallelism, repeatability and specificity. Parallelism in biomarker assays allows understanding of dilution–response relationship of endogenous samples to the calibrator concentration-response curve. Many publications have described how parallelism experiments should be run and what kind of data can be interpreted from these. Recently, there has been tremendous focus on defining the difference between dilutional linearity and parallelism. Just as biomarker assays are not PK assays, dilutional linearity is not parallelism. Where parallelism utilizes samples with endogenous analyte, dilutional linearity involves spiking sample matrix with known analyte and diluting into the standard curve range for recovery and linearity assessment. Dilutional linearity may be an important element of biomarker assay development when the analyte of interest exists in very low endogenous levels (such as certain cytokines) or any other situation where it is not possible to obtain endogenous samples to undertake parallelism experiments. Parallelism experiments provide multifaceted assay performance information including specificity, minimal required dilution (MRD) and LLOQ. Parallelism should be conducted using at least three to five individual samples and is one of the early set of key experiments to determine method feasibility. In situations where parallelism cannot be conducted due to lack of pertinent samples or parallelism fails during the course of evaluation, the assay may still be utilized based on the COU and utilized to generate data that is relative quantitation, provided assay can demonstrate repeatability.

Another key parameter for minimum method feasibility is therefore assay repeatability. Repeatability involves testing the same set of samples containing the endogenous analyte multiple times under similar testing conditions (such as same lab, operator and instrument) to obtain assay precision information. Repeatability experiments particularly become important when, as described above, for some reason parallelism cannot be demonstrated in an assay. Such assay repeatability experiments performed over a duration of time also provides information on assay-associated analytical variability. This analytical variability or assay noise is the extent to which an assigned nominal for an endogenous sample (such as an endogenous QC sample) can shift between multiple runs of same assay conditions. Data on assay-related variability or assay noise also enables a better understanding of what can be considered meaningful changes in biomarker levels. For example, in an assay, if the assigned nominal shifts ± 20% over multiple runs over a duration of period, it will give us confidence to interpret any changes beyond this ± 20% limit to be meaningful and attributable it to a biological event instead of an analytical observation.

The third key parameter to be determined during assay feasibility is assay specificity. Specificity is the ability to recognize the analyte of interest in the presence of other structurally similar molecules [. This parameter reiterates the need for a good understanding of the biomarker biology. Where possible, specificity experiments should also be performed early on and kept simple and relevant to the biomarker of interest. Specificity experiments are performed by spiking structurally close or variant forms of analyte of interest that may interfere with analyte detection (if physiologically relevant levels of such factors are known, then they should be tested at and above this level). Specificity experiments are key if close homologs of the analyte of interest are known to exist and, when generated early on, allows one to attribute the assay-related signal to the specific analyte of interest, thereby eliminating contributions or interference from such close homologs, resulting in generation of biologically relevant data.

Conclusion

An exciting set of data can transform interest in an early exploratory biomarker into a key consideration for program-related decision-making during clinical drug development. Therefore, following through these three essential parameters in parallelism, repeatability and specificity assessments are recommended for early exploratory biomarker assays. These three parameters should be evaluated along with routinely assessed analytical performance criteria. Testing these parameters for every exploratory assay may appear as resource constraining; however, there is superior advantage of garnering increased confidence in the assay early on. This would ensure that the right answers are provided to key questions raised during biomarker hypothesis generation. Incorporating these early assessments will also enable smooth transition of biomarker assays through their subsequent assay life cycle, such as clinical assay validation. Although FFP validation of biomarker assays are primarily driven by their COU, we must strive to gather parallelism, repeatability and specificity information during method feasibility, while allowing sufficient flexibility in this process so as to resourcefully support biological validation of the biomarker hypothesis.

ITALIANO

Il campo dei biomarcatori ha visto un'ampia crescita consentita da molteplici strumenti tecnologici avanzati a nostra disposizione. Tali strumenti hanno consentito la misurazione quantitativa e semiquantitativa di analiti proteici in matrici solubili come sangue (siero o plasma), urina e liquido cerebrospinale. I biomarcatori solubili vengono analizzati di routine utilizzando il saggio di legame del ligando (LBA) e approcci basati su LC-MS / MS, tuttavia i saggi di biomarcatori basati su LBA saranno al centro di questa discussione. Il campo dell'LBA si è evoluto da ELISA su piastra a opzioni multiple per piattaforme ultrasensibili come Simoa® e SMCxPro®. Nonostante le linee guida per la convalida dei saggi per i saggi bioanalitici, le sfide inerenti alla creazione di saggi di biomarcatori rendono impegnativo seguire un approccio armonizzato. Una delle tante sfide nello sviluppo del saggio di biomarcatori risiede nella mancanza di un vero standard di riferimento. A differenza dei test farmacocinetici (PK), il materiale calibrante utilizzato per i test dei biomarcatori potrebbe non rappresentare l'analita endogeno. Spesso, nei saggi di biomarcatori, vengono utilizzate proteine ​​ricombinanti con proprietà fisico-chimiche diverse rispetto all'analita endogeno. Ulteriori sfide risiedono nella comprensione inadeguata e insufficiente della biologia del biomarcatore, come la presenza e la rilevanza di più isoforme, troncamenti di proteine, cambiamento nel biomarcatore con stato di malattia e mancanza di campioni rilevanti durante lo sviluppo del test.

Validazione del saggio di biomarker

I saggi sui biomarcatori generalmente seguono una convalida adatta allo scopo (FFP) guidata dal contesto d'uso (COU) del biomarcatore. Per dirlo semplicemente, il livello di convalida del dosaggio è determinato dall'uso finale dei dati del biomarcatore. Tuttavia, nel campo emozionante e in continua evoluzione della ricerca sui biomarcatori, una serie iniziale di dati generati come parte di uno sforzo puramente esplorativo può aumentare in un interesse sostanziale oltre l'esplorazione, cambiando così il suo COU. Ad esempio, i dati generati da un pannello di citochine multiplex originariamente destinato alla scoperta di biomarcatori durante lo sviluppo clinico nella fase iniziale possono portare all'identificazione di biomarcatori chiave che diventano componenti essenziali del processo decisionale relativo al programma. Nonostante l'esistenza di documenti di orientamento per lo sviluppo del test e la convalida, a causa della pratica di convalida FFP per i biomarcatori, possono esistere differenze tra gli analisti a causa delle pratiche organizzative o delle sfide inerenti allo sviluppo di un test del biomarcatore. Pertanto, la definizione di ciò che costituisce una convalida FFP basata su COU può essere lasciata alla discrezione di un esperto tecnico. Spesso nei test con biomarcatori, tali pratiche possono includere la mancanza di dati sulle prestazioni del test raccolti utilizzando campioni endogeni ed il solo affidamento sulle prestazioni della curva standard e l'uso di campioni di controllo di qualità (QC) a spillo, entrambi generati utilizzando proteine ​​ricombinanti o sintetiche purificate. In situazioni in cui un biomarcatore esplorativo è andato oltre l'esplorazione e quindi si è evoluto nella sua COU, potrebbe essere necessario ripercorrere le fasi iniziali di convalida del test e ristabilire i parametri per definire le prestazioni del test del biomarcatore ed i criteri di qualificazione. Questo processo potrebbe non solo richiedere molto tempo ma, in base al livello iniziale di convalida eseguito (o alla sua mancanza), potrebbe anche portare a sorprese indesiderate (ad esempio, scoperta della reattività crociata del test). Una raccomandazione per i saggi esplorativi di biomarcatori che si trovano su un percorso di convalida FFP è quindi quella di coinvolgere passaggi guidati ma versatili, anche durante l'interrogatorio infantile di un biomarcatore.

Tracciare il percorso nello sviluppo del metodo di dosaggio dei biomarcatori

Una stretta collaborazione tra gli scienziati che definiscono la strategia dei biomarcatori e gli esperti di tecnologia consentirà di porre le domande giuste all'inizio di qualsiasi sforzo di sviluppo del saggio, stabilendo così i giusti criteri di convalida FFP guidati dal COU del biomarcatore.

Indipendentemente dall'applicazione prevista dei dati sui biomarcatori, una delle decisioni più importanti nello sviluppo del metodo di analisi è la selezione critica dei reagenti. La selezione di reagenti critici come il materiale del calibratore e gli anticorpi reagenti costituisce un punto critico per il benchmarking della qualità del dosaggio. Le analisi dei biomarcatori LBA in genere non sono una quantificazione assoluta; tuttavia, sono una quantificazione relativa al materiale del calibratore utilizzato. Pertanto, ove possibile, è necessario fare uno sforzo per selezionare il materiale del calibratore che rappresenta la forma endogena dell'analita. Inoltre, gli anticorpi reagenti devono essere selezionati per la loro capacità di legarsi non solo al materiale del calibratore ma anche al materiale endogeno. Allo stesso modo, è necessario utilizzare soluzioni tecnologiche appropriate per caratterizzare il materiale del calibratore nonché gli anticorpi reagenti associati al dosaggio. Tali soluzioni tecnologiche includono la SM per comprendere i modelli di glicosilazione, la sequenza degli amminoacidi, la lunghezza e la purezza. Lo sviluppo del metodo di analisi implica anche la determinazione delle prestazioni analitiche di base come LOD, LOQ, ULOQ ed altri fattori come la selezione del controllo di qualità e la valutazione delle prestazioni. Con la presente proponiamo alcuni esperimenti di fattibilità dei metodi aggiuntivi ma minimi per biomarcatori anche altamente esplorativi. Le nostre raccomandazioni entrano in vigore dopo la selezione critica del reagente ma prima di iniziare la convalida del dosaggio FFP. Queste raccomandazioni possono essere seguite anche quando si utilizzano kit LBA di biomarcatori commerciali pronti all'uso.

Raccomandazioni di fattibilità del metodo minimo

Per i biomarcatori altamente esplorativi sottoposti a una convalida FFP guidata da COU, è fondamentale esaminare tre parametri aggiuntivi come parte della fattibilità del metodo: parallelismo, ripetibilità e specificità. Il parallelismo nei dosaggi dei biomarcatori consente di comprendere la relazione di diluizione-risposta dei campioni endogeni con la curva di concentrazione-risposta del calibratore. Molte pubblicazioni hanno descritto come dovrebbero essere eseguiti gli esperimenti di parallelismo e che tipo di dati possono essere interpretati da questi. Recentemente, c'è stata un'enorme attenzione sulla definizione della differenza tra linearità di diluizione e parallelismo. Così come le analisi dei biomarcatori non sono analisi PK, la linearità della diluizione non è parallelismo. Laddove il parallelismo utilizza campioni con analita endogeno, la linearità di diluizione implica l'aggiunta di una matrice del campione con analita noto e la diluizione nell'intervallo della curva standard per il recupero e la valutazione della linearità. La linearità diluzionale può essere un elemento importante dello sviluppo del saggio di biomarcatori quando l'analita di interesse esiste a livelli endogeni molto bassi (come alcune citochine) o in qualsiasi altra situazione in cui non è possibile ottenere campioni endogeni per intraprendere esperimenti di parallelismo. Gli esperimenti di parallelismo forniscono informazioni sulle prestazioni del test multiforme tra cui specificità, diluizione minima richiesta (MRD) e LLOQ. Il parallelismo dovrebbe essere condotto utilizzando almeno da tre a cinque campioni individuali ed è uno dei primi set di esperimenti chiave per determinare la fattibilità del metodo. In situazioni in cui il parallelismo non può essere condotto a causa della mancanza di campioni pertinenti o del parallelismo che non riesce durante il corso della valutazione, il dosaggio può ancora essere utilizzato in base alla COU ed utilizzato per generare dati che rappresentano la quantificazione relativa, a condizione che il dosaggio possa dimostrare la ripetibilità.

Un altro parametro chiave per la fattibilità minima del metodo è quindi la ripetibilità del dosaggio. La ripetibilità implica il test della stessa serie di campioni contenenti l'analita endogeno più volte in condizioni di test simili (come lo stesso laboratorio, operatore e strumento) per ottenere informazioni sulla precisione del dosaggio. Gli esperimenti di ripetibilità diventano particolarmente importanti quando, come descritto sopra, per qualche motivo il parallelismo non può essere dimostrato in un saggio. Tali esperimenti di ripetibilità del dosaggio eseguiti per un periodo di tempo forniscono anche informazioni sulla variabilità analitica associata al dosaggio. Questa variabilità analitica o rumore del test è la misura in cui un valore nominale assegnato per un campione endogeno (come un campione QC endogeno) può spostarsi tra più analisi delle stesse condizioni del test. I dati sulla variabilità correlata al dosaggio o sul rumore del dosaggio consentono inoltre una migliore comprensione di ciò che può essere considerato un cambiamento significativo nei livelli dei biomarcatori. Ad esempio, in un test, se il valore nominale assegnato si sposta di ± 20% su più analisi per un periodo di tempo, ci darà la certezza di interpretare eventuali modifiche oltre questo limite di ± 20% come significative e attribuibili invece a un evento biologico di un'osservazione analitica.

Il terzo parametro chiave da determinare durante la fattibilità del dosaggio è la specificità del dosaggio. La specificità è la capacità di riconoscere l'analita di interesse in presenza di altre molecole strutturalmente simili. Questo parametro ribadisce la necessità di una buona comprensione della biologia dei biomarcatori. Ove possibile, anche gli esperimenti di specificità dovrebbero essere eseguiti all'inizio e mantenuti semplici e pertinenti per il biomarcatore di interesse. Gli esperimenti di specificità vengono eseguiti aggiungendo forme di analita di interesse strutturalmente vicine o varianti che possono interferire con il rilevamento dell'analita (se sono noti livelli fisiologicamente rilevanti di tali fattori, devono essere testati a questo livello e oltre). Gli esperimenti di specificità sono fondamentali se è nota l'esistenza di omologhi stretti dell'analita di interesse e, se generati all'inizio, consentono di attribuire il segnale correlato al dosaggio all'analita specifico di interesse, eliminando così contributi o interferenze da tali omologhi vicini, risultando nella generazione di dati biologicamente rilevanti.

Conclusione

Una serie entusiasmante di dati può trasformare l'interesse per un biomarcatore esplorativo precoce in una considerazione chiave per il processo decisionale relativo al programma durante lo sviluppo clinico del farmaco. Pertanto, seguendo questi tre parametri essenziali nel parallelismo, le valutazioni di ripetibilità e specificità sono raccomandate per i primi saggi di biomarcatori esplorativi. Questi tre parametri dovrebbero essere valutati insieme ai criteri di performance analitica valutati di routine. Il test di questi parametri per ogni analisi esplorativa può sembrare una limitazione delle risorse; tuttavia, vi è un vantaggio superiore nell'acquisire una maggiore fiducia nell'analisi nella fase iniziale. Ciò garantirebbe che le risposte giuste siano fornite alle domande chiave sollevate durante la generazione di ipotesi di biomarcatori. L'incorporazione di queste prime valutazioni consentirà anche una transizione graduale dei test dei biomarcatori attraverso il loro successivo ciclo di vita del test, come la convalida del test clinico. Sebbene la convalida FFP dei saggi dei biomarcatori sia principalmente guidata dal loro COU, dobbiamo sforzarci di raccogliere informazioni sul parallelismo, ripetibilità e specificità durante la fattibilità del metodo, consentendo al contempo una flessibilità sufficiente in questo processo in modo da supportare con risorse la convalida biologica dell'ipotesi del biomarcatore.

Da:

https://www.future-science.com/doi/10.4155/bio-2019-0223?__hstc=78901003.71c9d29221247064a81ec754f77a5c45.1604177660081.1604177660081.1604177660081.1&__hssc=78901003.10.1604177660081&__hsfp=1916092108&