A new generation cultivation medium that ensures optimal culture conditions in challenging PSC applications / Un mezzo di coltura di nuova generazione che garantisce condizioni di coltura ottimali in difficili applicazioni PSC

 A new generation cultivation medium that ensures optimal culture conditions in challenging PSC applications / Un mezzo di coltura di nuova generazione che garantisce condizioni di coltura ottimali in difficili applicazioni PSC

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Introduction

Nowadays, human pluripotent stem cells (hPSCs) are often used in very challenging applications such as gene editing or cell sorting. Also after reprogramming, cells are put under stress by applying ultra-low density plating to generate new hPSC lines. The need of a stable and carefully composed medium environment becomes obvious to ensure survival and normal cell growth of hPSCs especially under stressful experimental conditions. Cells benefit from a constant nutrient and growth factor supply, a stable pH and low accumulation of degradation products, e.g. lactate or ammonium. Here, we developed a xeno-free, new generation hPSC cultivation medium which contains stabilized FGF-2 to guarantee steady exposure levels of growth factors and therefore improves not only efficient maintenance and expansion of hPSCs but also the possibility of safely using flexible feeding strategies. When combined with an additional, optimized support supplement, it allows improved cell survival and stable cell growth of hPSCs after gene editing, cell sorting or reprogramming. To evaluate the performance of the new generation medium, two hPSC lines were cultivated over 10 passages on Laminin521. Both cell lines maintained highly pluripotent and had a typical doubling time of 22-27 hours. They displayed a normal karyotype and could be efficiently differentiated into cells of all three germ layers. To assess the potential of the additional support supplement, human fibroblasts were reprogrammed and resulting hPSCs sorted based on TRA-1-60/SSEA4 expression using the MACSQuant® Tyto® and plated into a 96-well plate. Later on, 6 PSC clones were chosen from the 96-well plate and further expanded using the new generation medium. The analyses at passage 4 and 5 revealed that all clones were highly pluripotent, displayed a normal karyotype and readily differentiated into mesoderm, ectoderm and endoderm. 

Results

StemMACS™ PSC-Brew XF enables stable and efficient expansion 1 of highly pluripotent stem cells.

In order to evaluate the performance of StemMACSTM PSC-Brew XF, human we cultivated two hPSC lines over 10 passages as single-cells on Laminin521. Both cell lines had a typical doubling time of 22-27 hours and showed a homogeneous morphology during cultivation (A, B cell line 1). To confirm the quality of the cells, marker expression was checked at different passages using flow cytometry. Both cell lines displayed a high and persistent expression of pluripotency markers during the entire cultivation time: TRA-1-60 (98,6 – 99,7%), SSEA-4 (96,4 – 99,9%), SSEA-5 (95,5 – 99,4%), Oct-3/4 (98,5 – 99,9%) and Sox2 (94,5 – 99,4%) and showed only low expression of SSEA-1 (0,3 – 2%) (C, dot plots cell line 1 passage 10).

Cells cultivated in StemMACS PSC-Brew XF can be efficiently 2 differentiated and retain a normal genotype

To determine the differentiation capability of both cell lines after 10 passages of cultivation in StemMACS PSC-Brew XF, cells were differentiated using the StemMACSTM Trilineage Differentiation Kit. Quantitative flow cytometry analysis confirmed their ability to differentiate into CD140b+ vascular smooth muscle cells or CD144+ endothelial precursors (mesoderm) (overall differentiation efficiency: cell line 1 81,34%, cell line 2 80,06%), Sox17+CXCR4+ definitive endoderm cells (endoderm) (cell line 1 69,62%, cell line 2 94,36%) and Sox2+Pax6+ neuroectoderm cells (ectoderm) (cell line 1 79,87%, cell line 2 78,05%) (A). The genomic stability of the cells was analyzed by karyotyping and in more detail by iCS-digitalTM PSC 24-probes kit (Stem Genomics), a digital PCR which can detect more than 90% of recurrent numeric aberrations in hPSCs. Both methods revealed a stable genotype for both cell lines after 10 passages of cultivation (B, cell line 1, representative picture).

StemMACS PSC-Brew XF provides a carefully composed medium 3 environment with constant growth factor supply

To assess the potential of the medium in terms of nutrient and growth factor supply as well as for accumulation of degradation products, we cultivated cell line 1 for 5 days in StemMACS PSC-Brew XF and a competitor medium, and analyzed the medium supernatant between day 2 and day 5 of cultivation. Additionally, different feeding strategies were applied: every day media change (Standard, 2ml/well), every other day media change (EOD, 2ml/well) and an extended media change using only one medium change at day 2 (Extended, 4ml/well). Under all three feeding regimes StemMACS PSC-Brew XF maintained more steady glucose levels (A), while exhibiting comparably increasing lactate levels (B). Glutamine levels remained comparably stable for both media (C), while with StemMACS PSC-Brew XF the accumulation of toxic ammonia was significantly reduced (D). Both media exhibited comparable stability with regard to pH (E) and FGF-2 concentration (F)

StemMACS PSC-Brew XF in combination with StemMACS PSC-Support XF facilitates efficient cell survival under stressful 4 culture conditions

To demonstrate the synergistic effect of StemMACS PSC-Brew XF and the additional supplement StemMACSTM PSC-Support XF, human in challenging culture conditions, we reprogrammed human fibroblasts and sorted for TRA-1-60+ SSEA4+ cells using the MACSQuant Tyto. Sorted cells were plated into a 96- well plate and cultivated for 4 days using StemMACS PSC-Brew XF supplemented with StemMACS PSC-Support XF. Then, cells were maintained in StemMACS PSC-Brew XF only. After 10 days of culture, 6 clones were chosen and further expanded (A). Quality control of all clones at passage 4 showed a high expression of the pluripotency marker TRA-1-60, SSEA4, SSEA5, Oct3/4 and Sox2 with >96% and only low expression of the differentiation marker SSEA-1 (<3%) (B). Additionally, clones were checked for their differentiation potential and genomic stability at passage 5. All clones could successfully differentiate into endoderm: 78 – 98% Sox17+CXCR4+ definitive endoderm cells, ectoderm: 91 – 95% Sox2+Pax6+ neuroectoderm cells, and mesoderm: 80 – 90% overall differentiation efficiency of CD140b+ vascular smooth muscle cells or CD144+ endothelial precursors (C), no genetic abnormalities could be detected by using iCS-digital PSC 24-probes kit (D).

Conclusion

Here we developed a xeno-free, new generation PSC cultivation medium which:

 • supports stable and efficient expansion of highly pluripotent stem cells, 

• provides a constant nutrient and growth factor supply, a stable pH and low accumulation of toxic degradation products, 

• when combined with StemMACS PSC-Support XF, enables cell survival and stable cell growth of PSCs under stressful culture conditions.

ITALIANO

Introduzione

Al giorno d'oggi, le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) sono spesso utilizzate in applicazioni molto impegnative come l'editing genetico o lo smistamento cellulare. Inoltre, dopo la riprogrammazione, le cellule vengono sottoposte a stress applicando una placcatura a densità ultra bassa per generare nuove linee hPSC. La necessità di un ambiente medio stabile e accuratamente composto diventa evidente per garantire la sopravvivenza e la normale crescita cellulare delle hPSC, specialmente in condizioni sperimentali stressanti. Le cellule beneficiano di un apporto costante di nutrienti e fattori di crescita, un pH stabile ed un basso accumulo di prodotti di degradazione, ad es. lattato o ammonio. Qui, abbiamo sviluppato un mezzo di coltivazione hPSC di nuova generazione privo di xeno che contiene FGF-2 stabilizzato per garantire livelli di esposizione costanti ai fattori di crescita e quindi migliora non solo la manutenzione e l'espansione efficienti delle hPSC, ma anche la possibilità di utilizzare in sicurezza strategie di alimentazione flessibili. Se combinato con un supplemento di supporto ottimizzato aggiuntivo, consente una migliore sopravvivenza cellulare e una crescita cellulare stabile delle hPSC dopo l'editing genetico, lo smistamento o la riprogrammazione delle cellule. Per valutare le prestazioni del mezzo di nuova generazione sono state coltivate due linee hPSC su 10 passaggi su Laminin521. Entrambe le linee cellulari hanno mantenuto un'elevata pluripotenza e hanno avuto un tempo di raddoppio tipico di 22-27 ore. Hanno mostrato un cariotipo normale e potrebbero essere differenziati in modo efficiente in cellule di tutti e tre gli strati germinali. Per valutare il potenziale del supplemento di supporto aggiuntivo, i fibroblasti umani sono stati riprogrammati e le hPSC risultanti sono state ordinate in base all'espressione di TRA-1-60/SSEA4 utilizzando MACSQuant® Tyto® e placcate in una piastra da 96 pozzetti. Successivamente, 6 cloni PSC sono stati scelti dalla piastra a 96 pozzetti e ulteriormente ampliati utilizzando il mezzo di nuova generazione. Le analisi al passaggio 4 e 5 hanno rivelato che tutti i cloni erano altamente pluripotenti, mostravano un cariotipo normale e si differenziavano facilmente in mesoderma, ectoderma ed endoderma.

Risultati

StemMACS™ PSC-Brew XF consente un'espansione stabile ed efficiente 1 di cellule staminali altamente pluripotenti.

Per valutare le prestazioni di StemMACSTM PSC-Brew XF, nell'uomo abbiamo coltivato due linee hPSC su 10 passaggi come cellule singole su Laminin521. Entrambe le linee cellulari avevano un tempo di raddoppio tipico di 22-27 ore e mostravano una morfologia omogenea durante la coltivazione (linea cellulare A, B 1). Per confermare la qualità delle cellule, l'espressione del marcatore è stata verificata in diversi passaggi mediante citometria a flusso. Entrambe le linee cellulari hanno mostrato un'espressione elevata e persistente di marcatori di pluripotenza durante l'intero tempo di coltivazione: TRA-1-60 (98,6 – 99,7%), SSEA-4 (96,4 – 99,9%), SSEA- 5 (95,5 – 99,4%), Oct-3/4 (98,5 – 99,9%) e Sox2 (94,5 – 99,4%) e ha mostrato solo una bassa espressione di SSEA-1 (0 ,3 – 2%) (C, dot plot linea cellulare 1 passaggio 10).

Le cellule coltivate in StemMACS PSC-Brew XF possono essere differenziate in modo efficiente 2 e mantenere un genotipo normale

Per determinare la capacità di differenziazione di entrambe le linee cellulari dopo 10 passaggi di coltivazione in StemMACS PSC-Brew XF, le cellule sono state differenziate utilizzando lo StemMACSTM Trilineage Differentiation Kit. L'analisi quantitativa della citometria a flusso ha confermato la loro capacità di differenziarsi in cellule muscolari lisce vascolari CD140b+ o in precursori endoteliali CD144+ (mesoderma) (efficienza di differenziazione complessiva: linea cellulare 1 81,34%, linea cellulare 2 80,06%), cellule endodermiche definitive Sox17+CXCR4+ (endoderma) (linea cellulare 1 69,62%, linea cellulare 2 94,36%) e cellule del neuroectoderma Sox2+Pax6+ (ectoderma) (linea cellulare 1 79,87%, linea cellulare 2 78,05%) (A). La stabilità genomica delle cellule è stata analizzata mediante cariotipizzazione e più in dettaglio con iCS-digitalTM PSC 24-probes kit (Stem Genomics), una PCR digitale in grado di rilevare oltre il 90% delle aberrazioni numeriche ricorrenti nelle hPSC. Entrambi i metodi hanno rivelato un genotipo stabile per entrambe le linee cellulari dopo 10 passaggi di coltivazione (B, linea cellulare 1, immagine rappresentativa).

StemMACS PSC-Brew XF fornisce un ambiente medio 3 accuratamente composto con una fornitura costante di fattori di crescita

Per valutare il potenziale del mezzo in termini di fornitura di nutrienti e fattori di crescita, nonché per l'accumulo di prodotti di degradazione, abbiamo coltivato la linea cellulare 1 per 5 giorni in StemMACS PSC-Brew XF e un mezzo concorrente ed abbiamo analizzato il supernatante del mezzo tra un giorno e l'altro 2 e giorno 5 di coltivazione. Inoltre, sono state applicate diverse strategie di alimentazione: cambio del materiale ogni giorno (Standard, 2 ml/pozzetto), cambio del materiale a giorni alterni (EOD, 2 ml/pozzetto) e cambio del materiale esteso utilizzando un solo cambio del mezzo al giorno 2 (esteso, 4 ml/pozzetto) bene). In tutti e tre i regimi di alimentazione, StemMACS PSC-Brew XF ha mantenuto livelli di glucosio più stabili (A), mentre mostra livelli di lattato in aumento comparabile (B). I livelli di glutammina sono rimasti relativamente stabili per entrambi i mezzi (C), mentre con StemMACS PSC-Brew XF l'accumulo di ammoniaca tossica è stato significativamente ridotto (D). Entrambi i mezzi hanno mostrato una stabilità comparabile per quanto riguarda pH (E) e concentrazione di FGF-2 (F)

StemMACS PSC-Brew XF in combinazione con StemMACS PSC-Support XF facilita la sopravvivenza cellulare efficiente in condizioni di coltura stressanti 

Per dimostrare l'effetto sinergico di StemMACS PSC-Brew XF e del supplemento aggiuntivo StemMACSTM PSC-Support XF, umano in condizioni di coltura difficili, abbiamo riprogrammato i fibroblasti umani e selezionato per le cellule TRA-1-60+ SSEA4+ utilizzando MACSQuant Tyto. Le cellule ordinate sono state piastrate in una piastra da 96 pozzetti e coltivate per 4 giorni utilizzando StemMACS PSC-Brew XF integrato con StemMACS PSC-Support XF. Quindi, le cellule sono state mantenute solo in StemMACS PSC-Brew XF. Dopo 10 giorni di coltura, sono stati scelti 6 cloni e ulteriormente ampliati (A). Il controllo di qualità di tutti i cloni al passaggio 4 ha mostrato un'elevata espressione del marcatore di pluripotenza TRA-1-60, SSEA4, SSEA5, Oct3/4 e Sox2 con >96% e solo una bassa espressione del marcatore di differenziazione SSEA-1 (<3% ) (B). Inoltre, i cloni sono stati controllati per il loro potenziale di differenziazione e stabilità genomica al passaggio 5. Tutti i cloni potevano differenziarsi con successo in endoderma: 78 – 98% Sox17+CXCR4+ cellule endoderma definitivo, ectoderma: 91 – 95% Sox2+Pax6+ neuroectoderma cellule e mesoderma: 80 – 90% di efficienza di differenziazione complessiva delle cellule muscolari lisce vascolari CD140b+ o dei precursori endoteliali CD144+ (C), non è stato possibile rilevare alcuna anomalia genetica utilizzando il kit iCS-digital PSC 24-probes (D).

Conclusione

Qui abbiamo sviluppato un mezzo di coltivazione PSC di nuova generazione senza xeno che:

 • supporta l'espansione stabile ed efficiente di cellule staminali altamente pluripotenti,

• fornisce un apporto costante di nutrienti e fattori di crescita, un pH stabile ed un basso accumulo di prodotti di degradazione tossici,

• se combinato con StemMACS PSC-Support XF, consente la sopravvivenza cellulare e la crescita cellulare stabile delle PSC in condizioni di coltura stressanti.

Da:

https://www.miltenyibiotec.com/_Resources/Persistent/ef9bdf60b0a17a7143b00dae4365426aee52740d/RD-Poster_Kurtz_ISSCR_2021_WEB.pdf?utm_campaign=RMN%20%E2%80%93%20Third%20party&utm_medium=email&_hsmi=208287710&_hsenc=p2ANqtz--63aGhNchBXjHMd-KT4xcWhqIVGT9wcwm8hVRjK16FEwzc5oFT6HOAf9aIMGxG0-541RuCgfltH2zNe5L8p4EPMHxnSqYeaOkm7F9GL4QJsNdSt9M&utm_content=208287710&utm_source=hs_email