Tecnologie di smistamento cellulare: approcci consolidati e nuovi / Cell Sorting Technologies: Established and Novel Approaches

Tecnologie di smistamento cellulare: approcci consolidati e nuovi / Cell Sorting Technologies: Established and Novel Approaches

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Tecnologia BACS. Le microbolle catturano le cellule bersaglio all'interno di un campione, che poi galleggiano in superficie per la rimozione. /  Tecnologia BACS. Le microbolle catturano le cellule bersaglio all'interno di un campione, che poi galleggiano in superficie per la rimozione. Immagine fornita da Akadeum.

Tradizionalmente, lo smistamento cellulare è stato utilizzato per lo sviluppo di saggi cellulari, come quelli coinvolti nella valutazione di potenziali farmaci candidati. Tuttavia, lo smistamento cellulare è stato sfruttato per molte altre applicazioni negli ultimi anni, guidato in gran parte dall'emergere di nuove tecnologie di smistamento. Questo articolo fornisce un rapido riepilogo dei metodi consolidati per l'ordinamento delle cellule prima di dare un'occhiata più da vicino ad alcune delle nuove alternative adottate dai ricercatori.

L'uso delle tecnologie di smistamento cellulare è esploso

Secondo Brandon H. McNaughton, Ph.D., amministratore delegato e co-fondatore di Akadeum, la comunità scientifica si trova in un momento storico unico in cui c'è una convergenza del progresso tecnologico e l'utilizzo del sistema immunitario per studiare, diagnosticare e persino curare la malattia. "Per questo motivo, l'uso delle tecnologie di smistamento cellulare è esploso, raddoppiando all'incirca negli ultimi cinque anni", riferisce. “È importante sottolineare che lo smistamento cellulare ha creato l'accesso a tipi cellulari specifici, come i linfociti B e i linfociti T prelevati direttamente dal tessuto o dal sangue, che è fondamentale per lo studio della biologia fondamentale, la produzione di anticorpi e l'esecuzione del sequenziamento unicellulare, nonché per molte altre applicazioni che sono fondamentali per migliorare la salute umana”.

Mandana Farhadi, Senior Product Manager per WOLF Cell Sorter presso NanoCellect, è d'accordo, aggiungendo che nuovi campi di ricerca come l'immuno-oncologia e la terapia cellulare hanno accresciuto la domanda di cellule selezionate. "Per soddisfare le mutevoli esigenze dei ricercatori, i selezionatori cellulari hanno dovuto evolversi", afferma. “Ad esempio, l'emergere di metodi multi-omici ha posto l'accento sull'importanza della preparazione del campione. Gli strumenti più recenti in arrivo sul mercato sono progettati per facilitare i flussi di lavoro moderni in cui i metodi tradizionali di smistamento cellulare potrebbero avere dei limiti". In definitiva, essere in grado di purificare in modo affidabile popolazioni cellulari vitali per obiettivi di ricerca o sviluppo mirati aiuta la produzione di trattamenti efficaci per condizioni che vanno dalle malattie rare e infettive fino alla neurodegenerazione ed al cancro.

Gli approcci consolidati rimangono popolari

Le tecnologie di smistamento cellulare consolidate, compreso lo smistamento cellulare ad attivazione magnetica (MACS), rimangono popolari tra i ricercatori. Angie Goldfain, Senior Product Manager di Thermo Fisher Scientific, commenta che, durante lo smistamento cellulare convenzionale, le cellule vengono colorate con anticorpi marcati con fluoroforo e dirette in un unico file oltre uno o più laser in un punto di interrogazione prima di essere incapsulate in goccioline liquide. "Applicando una carica elettrica a ciascuna gocciolina in base ai segnali rilevati, lo smistamento cellulare convenzionale consente a diversi tipi di cellule di essere deviati in tubi o piastre di microtitolazione per la raccolta", afferma. MACS utilizza invece anticorpi coniugati a sfere magnetiche per etichettare i marcatori cellulari, consentendo l'isolamento di specifici tipi cellulari dalla soluzione.

Nonostante il loro uso diffuso, questi metodi di lunga data e molto popolari sono riconosciuti per presentare alcune sfide. "I selezionatori cellulari convenzionali funzionano ad alta pressione che potrebbe causare danni cellulari, con conseguente perdita di funzione, diminuzione della vitalità o riduzione della crescita clonale dopo lo smistamento", avverte Farhadi. "Sebbene il MACS eviti l'uso di fluidica pressurizzata, è limitato dalla selezione di un solo marcatore alla volta e richiede innumerevoli cicli di lavaggio e centrifugazione, il che significa che non è un metodo efficace per selezionare cellule con più marcatori o eseguire più smistamento della popolazione”. McNaughton sottolinea che, inoltre, entrambe le tecnologie possono avere difficoltà a smistare efficacemente campioni contenenti un numero elevato di cellule o grandi volumi fluidici, il che è sempre più necessario per applicazioni come la terapia cellulare.

Nuove tecnologie di smistamento cellulare affrontano problemi comuni

Sono stati sviluppati diversi approcci per affrontare i limiti delle tecnologie di smistamento cellulare esistenti. Questi promettono vantaggi, tra cui uno smistamento più delicato, più veloce e più sicuro, nonché la capacità di rilevare più marcatori per campione rispetto all'utilizzo delle tecniche convenzionali.

Ordinamento cellulare attivato dal galleggiamento (BACS™)

Lo smistamento cellulare attivato dal galleggiamento, noto anche come BACS, è un metodo che utilizza particelle a bassa densità (microbolle) per la separazione cellulare basata sulla flottazione. McNaughton spiega che funzionalizzando le microbolle con anticorpi per i marcatori di superficie cellulare, BACS fornisce un mezzo incredibilmente delicato di isolamento cellulare. "Una volta attaccate alle cellule bersaglio, le microbolle galleggiano in superficie mentre le altre cellule cadono in un pellet", dice. “In alternativa, BACS può essere utilizzato per la selezione negativa, dove precipitano le cellule desiderate. In entrambi i casi, poiché BACS si basa sulla galleggiabilità, non ci sono limiti alla dimensione del campione e non ci sono requisiti per l'acquisto di attrezzature dedicate". BACS è stato recentemente  citato in Cell Reports per purificare le cellule B murine, che sono state successivamente utilizzate per rivelare un ruolo per il recettore nucleare orfano NUR77 durante le prime risposte immunitarie umorali.

Ordinamento cellulare basato sulla microfluidica

Invece di utilizzare fluidica ad alta pressione per lo smistamento delle celle, il selezionatore di cellule WOLF di NanoCellect è incentrato su cartucce microfluidiche. Farhadi osserva che ciò fornisce uno smistamento delicato in un ambiente sterile, senza rischi di generazione di aerosol o trasferimento di campioni, ed elimina anche la necessità di eseguire una lunga manutenzione quotidiana. "Il selezionatore di cellule WOLF è una piattaforma da banco adatta per un'ampia gamma di applicazioni", afferma. “Ad esempio, le cellule possono essere isolate per studi di genomica senza subire stress da taglio e cambiamenti associati nell'espressione genica, o linee cellulari sviluppate da tipi cellulari fragili come le cellule staminali pluripotenti indotte. Il WOLF si adatta facilmente anche all'interno di un armadio di biosicurezza, rendendolo ideale per la ricerca sulle malattie infettive". Gli usi pubblicati del WOLF includono la modellazione di biologia delle cellule neuronali umane, in cui è essenziale preservare la vitalità delle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo prima di differenziarle in neuroni e determinare in che modo diverse popolazioni cellulari acquisiscono preferenzialmente metaboliti distinti all'interno del microambiente tumorale. 

Ordinamento delle cellule spettrali

L'ordinamento delle cellule spettrali segue gli stessi principi di base dell'ordinamento cellulare convenzionale, ma differisce nel modo in cui vengono rilevati i segnali fluorescenti. Invece di utilizzare rivelatori individuali che misurano ciascuno un intervallo di lunghezze d'onda corrispondente ai massimi di emissione di un dato fluoroforo, la citometria a flusso spettrale misura l'intero spettro di emissione di ogni fluoroforo attraverso un array di rivelatori, consentendo di combinare fluorofori con massimi di emissione simili nello stesso pannello . "Il selezionatore di cellule spettrali Invitrogen Bigfoot può essere configurato con un massimo di 9 laser e 60 rilevatori", riferisce Goldfain. “Inoltre viene fornito con un'elettronica Field Programmable Gate Array progettata su misura per unmixing o compensazione spettrale in tempo reale. Altre caratteristiche che supportano le moderne applicazioni di smistamento cellulare includono un involucro di biosicurezza integrato ed un sistema di gestione dell'aerosol, insieme a capacità di smistamento di provette a più vie e piastre di microtitolazione, che rendono il Bigfoot fino a 10 volte più veloce dei tradizionali selezionatori di cellule.

Qualunque sia l'applicazione scelta, è inevitabile che sia disponibile una tecnologia di smistamento cellulare che soddisfi le tue esigenze. E, se hai domande specifiche, i produttori sono sempre felici di offrire una guida.

ENGLISH

Traditionally, cell sorting has been used for developing cell-based assays, such as those involved in evaluating potential drug candidates. However, cell sorting has been harnessed for many other applications in recent years, driven largely by the emergence of novel sorting technologies. This article provides a quick recap of established methods for sorting cells before taking a closer look at some of the newer alternatives being adopted by researchers.

The use of cell sorting technologies has exploded

According to Brandon H. McNaughton, Ph.D., Chief Executive Officer, and Co-founder of Akadeum, the scientific community is at a unique moment in history where there is a convergence of technology advancement and the utilization of the immune system to study, diagnose, and even treat disease. “Because of this, the use of cell sorting technologies has exploded, roughly doubling over the last five years,” he reports. “Importantly, cell sorting has created access to specific cell types—like B cells and T cells that are taken directly from tissue or blood—which is critical for studying fundamental biology, producing antibodies, and performing single-cell sequencing, as well as for many other applications that are foundational to improving human health.”

Mandana Farhadi, Senior Product Manager for the WOLF Cell Sorter at NanoCellect, agrees, adding that novel research fields such as immune-oncology and cell therapy have heightened demand for sorted cells. “To accommodate researchers’ changing requirements, cell sorters have had to evolve,” she says. “For example, the emergence of multi-omics methods has put an emphasis on the importance of sample preparation. Newer instruments coming on to the market are designed to facilitate modern workflows where traditional cell sorting methods might have limitations.” Ultimately, being able to reliably purify viable cell populations for targeted research or development goals aids the production of effective treatments for conditions spanning rare and infectious diseases through to neurodegeneration and cancer.

Established approaches remain popular

Established cell sorting technologies, including magnetic-activated cell sorting (MACS), remain popular among researchers. Angie Goldfain, Senior Product Manager at Thermo Fisher Scientific, comments that, during conventional cell sorting, cells are stained with fluorophore-labeled antibodies and directed in single file past one or more lasers at an interrogation point before being encapsulated in liquid droplets. “By applying an electric charge to each droplet based on the detected signals, conventional cell sorting allows different cell types to be deflected into tubes or micro-titer plates for collection,” she says. MACS instead uses antibodies conjugated to magnetic beads for labeling cellular markers, enabling specific cell types to be isolated from solution.

Despite their widespread use, these long-standing and highly popular methods are recognized to present certain challenges. “Conventional cell sorters operate at high pressure that could cause cellular damage, resulting in loss-of-function, decreased viability, or reduced clonal outgrowth after sorting,” cautions Farhadi. “While MACS avoids the use of pressurized fluidics, it is limited by the selection of only one marker at a time—and necessitates countless rounds of washing and centrifugation—meaning it is not an effective method to select cells with multiple markers or perform multi-population sorting.” McNaughton points out that, in addition, both technologies can struggle to effectively sort samples containing high number of cells or large fluidic volumes, which is increasingly necessary for applications like cell therapy.

Novel cell sorting technologies address common problems

Several approaches have been developed to address the limitations of existing cell sorting technologies. These promise benefits including gentler, faster, safer sorting, as well as the capacity to detect more markers per sample compared to using conventional techniques.

Buoyancy Activated Cell Sorting (BACS™)

Buoyancy activated cell sorting, also known as BACS, is a method that uses low-density particles (microbubbles) for flotation-based cell separation. McNaughton explains that by functionalizing the microbubbles with antibodies for cell surface markers, BACS provides an incredibly gentle means of cell isolation. “Once attached to the target cells, the microbubbles float to the surface while the other cells drop into a pellet,” he says. “Alternatively, BACS can be used for negative selection, where the desired cells precipitate. In either case, because BACS relies on buoyancy, there are no limits on sample size and no requirement to purchase dedicated equipment.” BACS was recently cited in Cell Reports for purifying murine B cells, which were subsequently used to reveal a role for the orphan nuclear receptor NUR77 during early humoral immune responses.

Microfluidic-based cell sorting

Rather than using high pressure fluidics for sorting cells, NanoCellect’s WOLF cell sorter is centered on microfluidic cartridges. Farhadi notes that this provides gentle sorting in a sterile environment, with no risk of aerosol generation or sample carryover, and also eliminates the need to perform time-consuming daily maintenance. “The WOLF cell sorter is a benchtop platform that is suitable for a broad range of applications,” she says. “For example, cells can be isolated for genomics studies without experiencing shear stress and associated changes in gene expression, or cell lines developed from fragile cell types such as induced pluripotent stem cells. The WOLF also fits easily inside a biosafety cabinet, making it ideal for infectious disease research.” Published uses of the WOLF include modeling of human neuronal cell biology, where preserving the viability of human induced pluripotent stem cells before differentiating them into neurons is essential, and determining how diverse cell populations preferentially acquire distinct metabolites within the tumor microenvironment. 

Spectral cell sorting

Spectral cell sorting follows the same basic principles as conventional cell sorting, but differs in how the fluorescent signals are detected. Instead of using individual detectors that each measure a wavelength range corresponding to the emission maxima of a given fluorophore, spectral flow cytometry measures the full emission spectrum of every fluorophore across a detector array, allowing fluorophores with similar emission maxima to be combined in the same panel. “The Invitrogen Bigfoot Spectral Cell Sorter can be configured with up to 9 lasers and 60 detectors,” reports Goldfain. “It also comes with custom-designed Field Programmable Gate Array electronics for real-time spectral unmixing or compensation. Other features that support modern-day cell sorting applications include an integrated biosafety enclosure and aerosol management system, along with multi-way tube and micro-titer plate sorting capabilities, which make the Bigfoot up to 10 times faster than traditional cell sorters.”

Whatever your chosen application, there is bound to be a cell sorting technology available that meets your needs. And, if you have specific questions, manufacturers are always happy to offer guidance.

Da:

https://www.biocompare.com/Editorial-Articles/587114-Cell-Sorting-Technologies-Established-and-Novel-Approaches/