La struttura Cryo-EM rivela il complesso processo di editing Prime in più stati / Cryo-EM Structure Reveals Prime Editing Complex in Multiple States
La struttura Cryo-EM rivela il complesso processo di editing Prime in più stati / Cryo-EM Structure Reveals Prime Editing Complex in Multiple States
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Alcuni ricercatori nel campo dell’editing genomico hanno rivolto la loro attenzione allo sviluppo di strumenti che non siano ostacolati dai limiti del sistema CRISPR-Cas9, come la discutibile precisione ed altri problemi di sicurezza.
Uno strumento sviluppato di recente è il prime editing system, un complesso molecolare costituito da due componenti: il prime editor che combina una proteina SpCas9 ed una trascrittasi inversa, e il prime editing guide RNA (pegRNA), un RNA guida modificato che identifica la sequenza target all'interno del DNA e codifica la modifica desiderata.
Il prime editing è già stato implementato con successo in cellule viventi di piante, pesci zebra e topi. Tuttavia, a causa della mancanza di informazioni strutturali, il meccanismo molecolare della trascrizione inversa guidata da pegRNA da parte dell'editor principale rimane poco compreso.
Ora, utilizzando la microscopia crioelettronica, i ricercatori dell’Università di Tokyo hanno determinato la struttura spaziale del complesso del DNA bersaglio SpCas9–M-MLV RTΔRNaseH–pegRNA–in più stati.
Questo lavoro è pubblicato su Nature nel documento “ Basi strutturali per la trascrizione inversa guidata da pegRNA da parte del primo editore”. "
"Abbiamo riscontrato che il complesso dell'editor principale era instabile in condizioni sperimentali", ha spiegato Yutaro Shuto, PhD, del dipartimento di scienze biologiche dell'Università di Tokyo. “Quindi è stato molto impegnativo ottimizzare le condizioni affinché il complesso rimanesse stabile. Per molto tempo abbiamo potuto determinare solo la struttura di Cas9”.
L'analisi funzionale basata su queste strutture ha anche rivelato come un editor principale potrebbe ottenere la trascrizione inversa senza tagliare entrambi i filamenti della doppia elica. Chiarire questi meccanismi molecolari contribuisce notevolmente alla progettazione di strumenti di editing genetico sufficientemente accurati per i trattamenti di terapia genica.
I ricercatori sono riusciti a determinare la struttura tridimensionale del complesso dell'editor principale in più stati durante la trascrizione inversa sul DNA bersaglio. Le strutture hanno rivelato che la trascrittasi inversa si legava al complesso RNA-DNA che si formava lungo la parte della proteina Cas9 associata alla scissione del DNA, la scissione di un singolo filamento della doppia elica.
Durante l'esecuzione della trascrizione inversa, la trascrittasi inversa ha mantenuto la sua posizione rispetto alla proteina Cas9. Le analisi strutturali e biochimiche hanno inoltre indicato che la trascrittasi inversa potrebbe portare ad ulteriori inserimenti indesiderati.
Più specificamente, gli autori hanno scritto: “La struttura di terminazione, insieme alla nostra analisi funzionale, rivela che M-MLV RT estende la trascrizione inversa oltre il sito previsto, risultando in incorporazioni derivate dall’impalcatura che causano modifiche indesiderate nei loci target. Inoltre, i confronti strutturali tra gli stati di pre-inizio, inizio ed allungamento mostrano che M-MLV RT rimane in una posizione coerente rispetto a SpCas9 durante la trascrizione inversa, mentre l’eteroduplex del DNA sintetizzato dal pegRNA si accumula lungo la superficie di SpCas9.
"La nostra strategia di determinazione della struttura in questo studio può essere applicata anche a redattori principali composti da una diversa proteina Cas9 e trascrittasi inversa", ha spiegato Shuto. “Vogliamo utilizzare le informazioni strutturali appena ottenute per portare allo sviluppo di migliori redattori principali”.
ENGLISH
Some researchers in the genome editing field have turned their attention to the development of tools that are not hindered by the limitations of the CRISPR-Cas9 system, such as questionable accuracy and other safety concerns.
One recently developed tool is the prime editing system, a molecule complex consisting of two components: the prime editor which combines a SpCas9 protein and a reverse transcriptase, and the prime editing guide RNA (pegRNA)—a modified guide RNA that identifies the target sequence within the DNA and encodes the desired edit.
Prime editing has already been successfully implemented in living cells of plants, zebrafish, and mice. However, due to a lack of structural information, the molecular mechanism of pegRNA-guided reverse transcription by the prime editor remains poorly understood.
Now, using cryo-electron microscopy, researchers at the University of Tokyo determined the spatial structure of the SpCas9–M-MLV RTΔRNaseH–pegRNA–target DNA complex in multiple states.
This work is published in Nature in the paper, “Structural basis for pegRNA-guided reverse transcription by the prime editor.”
“We found the prime editor complex to be unstable under experimental conditions,” explained Yutaro Shuto, PhD, from the department of biological sciences at the University of Tokyo. “So, it was very challenging to optimize the conditions for the complex to stay stable. For a long time, we could only determine the structure of Cas9.”
Functional analysis based on these structures also revealed how a prime editor could achieve reverse transcription without cutting both strands of the double helix. Clarifying these molecular mechanisms contributes greatly to designing gene-editing tools accurate enough for gene therapy treatments.
The researchers succeeded in determining the three-dimensional structure of the prime editor complex in multiple states during reverse transcription on the target DNA. The structures revealed that the reverse transcriptase bound to the RNA–DNA complex that formed along the part of the Cas9 protein associated with DNA cleavage, the splitting of a single strand of the double helix.
While performing the reverse transcription, the reverse transcriptase maintained its position relative to the Cas9 protein. The structural and biochemical analyses also indicated that the reverse transcriptase could lead to additional, undesired insertions.
More specifically, the authors wrote, “The termination structure, along with our functional analysis, reveals that M-MLV RT extends reverse transcription beyond the expected site, resulting in scaffold-derived incorporations that cause undesired edits at the target loci. Furthermore, structural comparisons among the pre-initiation, initiation, and elongation states show that M-MLV RT remains in a consistent position relative to SpCas9 during reverse transcription, whereas the pegRNA–synthesized DNA heteroduplex builds up along the surface of SpCas9.”
“Our structure determination strategy in this study can also be applied to prime editors composed of a different Cas9 protein and reverse transcriptase,” explained Shuto. “We want to utilize the newly obtained structural information to lead to the development of improved prime editors.”
Da:
https://www.genengnews.com/topics/genome-editing/cryo-em-structure-reveals-prime-editing-complex-in-multiple-states/?fbclid=IwZXh0bgNhZW0CMTEAAR2QIDGHktzVl3eFu4hOAZSkqnVq757aT-ieaOT9umUT7jeKIfz8wIzxS8I_aem_AdpJKtpTIPM_dZlSCnhpGtmYgD8nA6ZaNRH_cJWEAyeD9q6bS2x6MFM9Ev0RvxfVGpUptFZvDs2i9Cggmrr-XhyX
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