L'inserimento più sicuro di grandi quantità di DNA sposta la medicina genetica verso la scalabilità / Safer Large DNA Insertion Moves Genetic Medicine Toward Scalability

 L'inserimento più sicuro di grandi quantità di DNA sposta la medicina genetica verso la scalabilità / Safer Large DNA Insertion Moves Genetic Medicine Toward Scalability

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

INSTALL progetta donatori di DNA non tossici per promuovere inserimenti genici di grandi dimensioni per terapie indipendenti dalle mutazioni.

Dopo essere diventato il  primo paziente al mondo trattato con una terapia di editing genetico su misura, il piccolo KJ Muldoon è ora sano e libero dall'accumulo di ammoniaca tossica causato dalla sua rara malattia metabolica genetica, che inizialmente presentava un tasso di mortalità del 50% durante l'infanzia. La sua storia mette in luce il potenziale rivoluzionario dell'editing genetico, ma sottolinea anche una sfida importante per il settore: estendere queste terapie ad una più ampia popolazione di pazienti.   

Il disturbo del ciclo dell'urea di KJ derivava da una singola mutazione patogena che poteva essere trattata con precisione. Tuttavia, molte malattie genetiche derivano da numerose mutazioni sparse in un gene, rendendo le correzioni personalizzate troppo dispendiose in termini di risorse per essere implementate su larga scala. 

Ben Kleinstiver, PhD,  ricercatore associato presso il Massachusetts General Hospital (MGH)  e coautore dello studio  del NEJM che descrive il caso di KJ , ha dichiarato  a GEN  che l'inserimento di grandi sequenze di DNA in posizioni programmabili nel genoma è estremamente promettente come  farmaco generalizzabile, in grado di curare i pazienti  indipendentemente dalle mutazioni patogene sottostanti.  Il suo gruppo ha recentemente compiuto un ulteriore passo avanti nel rendere gli inserimenti di grandi geni più sicuri per le applicazioni terapeutiche. 

Nel nuovo studio pubblicato su  Nature  intitolato " Immune evasive DNA donors and recombinase license kilobase-scale writing " , Kleinstiver e colleghi, in collaborazione con Full Circles Therapeutics, hanno sviluppato un donatore di DNA circolare a singolo filamento (ssDNA) che consente l'integrazione su scala kilobase pur rimanendo non tossico per le cellule. 

La tecnologia, denominata  INSTALL (Integration Through Nucleus-Synthesized Template Addition of Large Lengths), fornisce un'alternativa ai donatori di DNA a doppio filamento (dsDNA) che evocano attivamente risposte immunitarie dannose, ma sono necessari per il riconoscimento da parte della vasta gamma di enzimi di editing genomico, tra cui le ricombinasi. In particolare, INSTALL mantiene la compatibilità con la ricombinasi legando una breve regione di dsDNA, la cui lunghezza può passare inosservata al sensore del DNA citosolico ed attivatore del sistema immunitario, cGas. 

I risultati dello studio INSTALL hanno mostrato un inserimento non virale riuscito e sicuro di grandi carichi genetici nel fegato dei topi quando somministrati tramite nanoparticelle lipidiche (LNP). Al contrario, i topi hanno manifestato reazioni immunitarie fatali quando hanno ricevuto molecole di dsDNA convenzionali. 

Alla domanda sulle origini della tecnologia, Connor Tou, PhD, ricercatore post-dottorato nel laboratorio Kleinstiver ed autore principale dello studio, ricorda di aver osservato come l'ostacolo dell'immunità innata del DNA al donatore sembrasse essere meno importante negli sforzi per ampliare l'inserimento genico, nonostante l'emergere di nuove tecnologie di ricombinasi e trasposasi. 

"Sapevamo che l'ssDNA poteva eludere i principali sensori immunitari nel citosol, ma era fondamentalmente incompatibile con le ricombinasi", ha detto Tou a GEN. "Il momento di rivelazione è arrivato quando ci siamo resi conto che la natura aveva già sviluppato una potenziale soluzione: molti fagi e batteri usano naturalmente l'ssDNA circolare per l'inserimento. Dovevamo solo ricreare quei meccanismi nelle cellule di mammifero". 

Diventare non virali 

L'affidamento delle ricombinasi ai donatori di dsDNA ha tradizionalmente favorito sistemi di veicolazione virali, come i virus adeno-associati (AAV), che si dirigono direttamente al nucleo ed evitano il rilevamento immunitario citosolico. Tuttavia, i vettori AAV sono limitati dagli elevati costi di produzione, dalla limitata capacità di carico e dall'impossibilità di ridose a causa dell'immunità acquisita al vettore, alimentando l'interesse per approcci di veicolazione non virali per l'inserimento di geni di grandi dimensioni.

INSTALL rappresenta la prima dimostrazione di inserimento di sequenze di grandi dimensioni non virali e non tossiche in cellule primarie umane e di topi utilizzando LNP. Tuttavia, meno dell'1% delle cellule epatiche di topo ha mostrato un'integrazione di DNA riuscita . Sebbene bassi livelli di correzione possano essere benefici per alcune patologie, la maggior parte dei disturbi richiede efficienze ad una o due cifre per essere utile ai pazienti.

John Finn, PhD, CSO presso Basecamp Research, afferma che lo studio rappresenta un "grande passo avanti" nell'affrontare il problema chiave della tossicità del dsDNA nella medicina genetica. Tuttavia, non prevede che gli AAV saranno superati nel prossimo futuro. Le sfide a valle, come l'efficace distribuzione al nucleo delle cellule non in divisione, rimangono un collo di bottiglia per la traduzione. 

"Quasi tutte le cellule del nostro corpo che ci interessano, comprese quelle del cervello, del fegato e dei muscoli, sono per lo più inattive", ha detto Finn a GEN.  "Finché questo problema non sarà risolto, non prevedo un grande impatto clinico". 

Basecamp Research è stata un attore attivo nell'utilizzo dell'intelligenza artificiale per potenziare le tecnologie di editing genetico. All'inizio di quest'anno, l'azienda ha presentato la  famiglia EDEN di modelli di intelligenza artificiale  addestrati su 9,7 trilioni di token di dati evolutivi per consentire la progettazione di ricombinasi programmabili per l'inserimento di grandi geni. 

Kleinstiver concorda sul fatto che il miglioramento del tasso di efficienza sia una direzione chiave per il futuro del lavoro. Sebbene lo studio utilizzi LNP standard progettati per il trasporto di mRNA, il veicolo può essere ottimizzato per trasportare il nuovo donatore circolare di ssDNA.  Sottolinea inoltre che un ambito poco esplorato è l'ingegnerizzazione della componente di acido nucleico delle ricombinasi per nuove funzionalità. L'efficienza di integrazione può essere ulteriormente migliorata aggiungendo modifiche chimiche che favoriscano il trasporto al nucleo del breve oligonucleotide legato al DNA circolare a singolo filamento, tra gli altri approcci. 

Tou riconosce che lo studio fornisce una prova di concetto iniziale  e che sono necessari ulteriori studi prima che l'approccio possa raggiungere la clinica. 

"Siamo ottimisti sul fatto che i sistemi INSTALL di prossima generazione, uniti alla continua progettazione delle proteine ​​ricombinanti, avranno utilità traslazionale per l'editing del genoma indipendente dalle mutazioni ed altre applicazioni", afferma. 

ENGLISH

INSTALL designs non-toxic DNA donors to advance large gene insertions for mutation-agnostic therapies

After becoming the world’s first patient treated with a bespoke base editing therapy, baby KJ Muldoon is now healthy and free from the toxic ammonia buildup caused by his rare genetic metabolic disorder that initially presented a 50% mortality rate in infancy. While his story highlights the life-changing potential of gene editing, it also underscores a major challenge for the field: expanding these therapies to benefit broader patient populations.  

KJ’s urea cycle disorder stemmed from a single disease-causing mutation that could be precisely targeted. However, many genetic disorders arise from numerous mutations scattered across a gene, making individualized corrections far too resource-intensive to scale. 

Ben Kleinstiver, PhD, associate investigator at Massachusetts General Hospital (MGH) and co-author of the NEJM study describing KJ’s case, told GEN that insertion of large DNA sequences at programmable locations in the genome holds tremendous promise as a generalizable medicine that could treat patients regardless of their underlying disease-causing mutations. His team has recently taken one step closer to making large gene insertions safer for therapeutic applications. 

In the new study published in Nature titled, “Immune evasive DNA donors and recombinase license kilobase-scale writing,” Kleinstiver and colleagues, in collaboration with Full Circles Therapeutics, have developed a circular single stranded DNA donor (ssDNA) that enables kilobase-scale integration while remaining non-toxic to cells. 

The technology, named integration through nucleus-synthesized template addition of large lengths (INSTALL), provides an alternative to double-stranded DNA (dsDNA) donors that actively evoke harmful immune responses, yet are required for recognition by the diverse suite of genome editing enzymes, including recombinases. Notably, INSTALL maintains recombinase compatibility by attaching a short region of dsDNA, whose length can go undetected by the cytosolic DNA sensor and immune system activator, cGas. 

INSTALL results showed successful and safe non-viral insertion of large genetic payloads in the livers of mice when delivered by lipid nanoparticles (LNPs). In contrast, mice experienced fatal immune reactions when receiving conventional dsDNA molecules. 

When asked about the origins of the technology, Connor Tou, PhD, postdoctoral fellow in the Kleinstiver lab and lead author of the study, recalls observing how the hurdle of DNA innate immunity to the donor seemed to be less of a focus in efforts to scale gene insertion, despite the emergence of new recombinase and transposase technologies. 

“We knew ssDNA could evade key immune sensors in the cytosol, but it was fundamentally incompatible with recombinases,” Tou told GEN. “The ‘aha’ moment came when we realized nature had already developed a potential solution: many phages and bacteria naturally use circular ssDNA for insertion. We just had to recreate those mechanisms in mammalian cells.” 

Going non-viral 

The reliance of recombinases on dsDNA donors has traditionally favored viral delivery systems, such as adeno-associated viruses (AAVs), which traffic directly to the nucleus and avoid cytosolic immune sensing. However, AAV vectors are limited by high manufacturing costs, restricted cargo capacity, and the inability to redose due to acquired vector immunity, driving interest in non-viral delivery approaches for large gene insertion.

INSTALL represents the first demonstration of non-viral and non-toxic large sequence insertion in primary human cells and mice using LNPs. However, less than 1% of mouse liver cells showed successful DNA integration. Although low levels of correction could be beneficial for some diseases, most disorders require single or double digit efficiencies to benefit patients

John Finn, PhD, CSO at Basecamp Research, affirms that the study is a “big advance” when addressing the key issue of dsDNA toxicity in genetic medicines. Yet, he does not anticipate AAVs to be overthrown in the near-term future. Downstream challenges, such as effective delivery to the nucleus of non-dividing cells, remain a bottleneck for translation. 

“Almost every single cell we care about in our bodies, including brain, liver, and muscle cells, are mostly non-dividing,” Finn told GEN. “Until that’s been solved, I don’t see a big impact in the clinic.” 

Basecamp Research has been an active player leveraging AI to augment gene editing technologies. Earlier this year, the company unveiled the EDEN family of AI models trained on 9.7 trillion tokens of evolutionary data to enable the design of programmable recombinases for large gene insertion. 

Kleinstiver concurs that improving the efficiency rate is a key future direction of the work. While the study uses standard LNPs designed for delivering mRNA, the vehicle can be optimized for carrying the new circular ssDNA donor. He also highlights that an under-explored space is engineering the nucleic acid component of recombinases for new functionalities. Integration efficiency may be further improved by adding chemical modifications that assist delivery to the nucleus to the short oligo annealed to the circular single stranded DNA, among other approaches. 

Tou acknowledges that the study provides an initial proof-of-concept with further work needed before the approach can reach the clinic. 

“We’re optimistic that next-generation INSTALL systems, combined with continued engineering of recombinase proteins, will have translational utility for mutation-agnostic genome editing and other applications,” he says. 

Da:

https://www.genengnews.com/topics/genome-editing/safer-large-dna-insertion-moves-genetic-medicine-toward-scalability/?_hsenc=p2ANqtz-985li_yV-S_kVhDOL3gtUhduyPOPr3OCmG21A7wRpMGOk6S8kx9C1gv0HKL2bT8Y0jeoVcwA90-ipnL5g_Hlam9ixCs3u_UtSdaDD1gTJS7ZG2ALY&_hsmi=408424532