Characterizing Irreversible Inhibitors Using Pioneer SPR Assays / Caratterizzazione degli inibitori irreversibili mediante saggi SPR Pioneer

Characterizing Irreversible Inhibitors Using Pioneer SPR Assays / Caratterizzazione degli inibitori irreversibili mediante saggi SPR Pioneer

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Figure : Amine-PEG4-desthiobiotin is coupled to an amine reaction biosensor to create a desthiobiotin sensor surface. The biotin-labeled target is then captured using streptavidin and immobilized onto the desthiobiotin sensor surface for analysis with covalent inhibitors. The target-inhibitor complex is then regenerated using an acetonitrile: NaOH mixture. The surface can then be re-immobilized with fresh target for multiple rounds of covalent inhibitor analysis. / L'ammina-PEG4-destiobiotina è accoppiata ad un biosensore di reazione dell'ammina per creare una superficie del sensore di destiobiotina. Il target marcato con biotina viene quindi catturato utilizzando streptavidina ed immobilizzato sulla superficie del sensore della destiobiotina per l'analisi con inibitori covalenti. Il complesso bersaglio-inibitore viene quindi rigenerato utilizzando un acetonitrile: una miscela di NaOH. La superficie può quindi essere nuovamente immobilizzata con un nuovo bersaglio per più cicli di analisi dell'inibitore covalente.

The majority of inhibitors characterized on biosensor platforms are under equilibrium binding conditions where the inhibitor-ligand complex formation is rapid and reversible. However, ~30% of the approved therapeutic enzyme inhibitors in the market function through covalent modification of the target. While toxicity, insufficient efficacy, clearance, and metabolite reactivity are commonly cited pitfalls for covalent inhibitors, approved therapeutics in this space show high selectivity and potency towards the binding target that drives overall therapeutic efficacy.

Analysis of covalent inhibitors in SPR can be challenging due to inactivation of the immobilized target by covalent inhibitor binding and the inability to reuse the surface for subsequent inhibitor analyses. Affinity capture methods such as His-tag capture immobilizations enable reversible target immobilizations that can be suitable for reversible inhibitor analysis, but these methods are often associated with drifting baselines, which can affect data analysis. A reversible streptavidin-biotin capture method can be adapted in Pioneer SPR systems that is suitable for irreversible inhibitor analysis (Figure).

In contrast to conventional interactions, covalent inhibitors operate under non-equilibrium kinetics and drive towards complete saturation of the target site if sufficient contact time is provided. Therefore, covalent inhibitors cannot be efficiently ranked using traditional IC50 measurements and instead require a consideration of the rate of inactivation of the target molecule. Here, a commitment to covalency (Cc) parameter is introduced which relates to the efficiency of the adduct (E-I) formation and its relationship to dissociation. Together, efficiency of adduct formation and the rate of protein | inhibitor association defines the biochemical potency of the inhibitor.

ITALIANO

La maggior parte degli inibitori caratterizzati su piattaforme di biosensori sono in condizioni di legame di equilibrio in cui la formazione del complesso inibitore-ligando è rapida e reversibile. Tuttavia, circa il 30% degli inibitori enzimatici terapeutici approvati nel mercato funzionano attraverso la modifica covalente del target. Mentre la tossicità, l'efficacia insufficiente, la clearance e la reattività dei metaboliti sono comunemente citate insidie ​​per gli inibitori covalenti, le terapie approvate in questo spazio mostrano un'elevata selettività e potenza verso il bersaglio vincolante che guida l'efficacia terapeutica complessiva.

L'analisi degli inibitori covalenti nell'SPR può essere difficile a causa dell'inattivazione del bersaglio immobilizzato mediante il legame dell'inibitore covalente e dell'incapacità di riutilizzare la superficie per le successive analisi degli inibitori. I metodi di cattura dell'affinità come le immobilizzazioni di cattura His-tag consentono immobilizzazioni target reversibili che possono essere adatte per l'analisi degli inibitori reversibili, ma questi metodi sono spesso associati a linee di base alla deriva, che possono influenzare l'analisi dei dati. Un metodo di cattura reversibile di streptavidina-biotina può essere adattato nei sistemi Pioneer SPR che è adatto per l'analisi degli inibitori irreversibili (Figura).

Contrariamente alle interazioni convenzionali, gli inibitori covalenti operano con cinetiche di non equilibrio e guidano verso la completa saturazione del sito bersaglio se viene fornito un tempo di contatto sufficiente. Pertanto, gli inibitori covalenti non possono essere classificati in modo efficiente utilizzando le tradizionali misurazioni IC50 e richiedono invece una considerazione del tasso di inattivazione della molecola bersaglio.   Qui viene introdotto un parametro di impegno per la covalenza (Cc) che si riferisce all'efficienza della formazione dell'addotto (E-I) e alla sua relazione con la dissociazione. Insieme, l'efficienza della formazione di addotti e il tasso di proteine ​​| l'associazione dell'inibitore definisce la potenza biochimica dell'inibitore.

Da:

https://offers.the-scientist.com/hubfs/TS_PPL_Sartorius_QC%20Octet_white%20paper/Octet-Label-Free-Detection-eBook-4007-en-L-Sartorius%20(1).pdf