Processi di coltura per la produzione di anticorpi monoclonali / Culture Processes for Monoclonal Antibody Production
Processi di coltura per la produzione di anticorpi monoclonali / Culture Processes for Monoclonal Antibody Production
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Tecniche di produzione di anticorpi monoclonali
Ibridoma e visualizzazione dei fagi
La prima tecnologia di produzione per la produzione di anticorpi monoclonali stabili è stata sviluppata nel 1975 creando un ibridoma, che è una cellula ibrida stabile in grado di produrre un singolo tipo di anticorpo contro un certo epitopo trovato in un antigene. Nelle prime fasi, la costruzione di ibridomi è stata effettuata da modelli murini. Questa tecnologia si basava sull'estrazione di un pool di linfociti B attivati da milze animali immunizzate fondendoli con cellule di mieloma immortalizzate che non hanno la capacità di sintetizzare l'ipoxantina-guanina-fosforibosil transferasi, un enzima chiave trovato nella via di salvataggio, uno delle vie necessarie per la sintesi dei nucleotidi.
La selezione cellulare dell'ibridoma richiede che il pool di cellule prodotto dalla fusione sia arricchito in un mezzo selettivo con aminopterina, un composto in grado di inibire la sintesi de novo dei nucleotidi.
Le cellule del mieloma non hanno la via di salvataggio, che è responsabile della produzione di nucleotidi. Se le cellule del mieloma sono in contatto con l'aminopterina presente nel terreno selettivo, si avrà un'inibizione della sintesi de novo. Pertanto, le cellule del mieloma non saranno più vitali perché tutte le vie principali per la produzione di nucleotidi sono bloccate.
Al contrario, i linfociti B non fusi attivati sopravviveranno perché le loro vie di salvataggio funzionano bene e la produzione di nucleotidi continuerà anche se l'aminopterina ha bloccato la via de novo. Tuttavia, questi linfociti B non fusi attivati sono mortali e potrebbero replicarsi solo per un numero finito di volte. Poi, moriranno alla fine.
Le cellule, che sono in grado di replicarsi indefinitamente e sintetizzare nucleotidi attraverso la via di salvataggio, possono sopravvivere attraverso condizioni di selezione e queste cellule sono chiamate ibridomi. Le molecole di anticorpi murini, dopo un numero ridotto di infusioni, potrebbero stimolare la risposta anticorpale umana anti-topo dell'immunità umana.
Per la somministrazione di anticorpi simili alle molecole umane, sono state sviluppate nuove metodologie per produrre una minore quantità di anticorpi chimerici immunogenici (regioni variabili della fonte murina sono collegate a regioni costanti di anticorpi umani). Di conseguenza, la richiesta di alternative meno immunogeniche ha migliorato la sintesi di anticorpi umanizzati (solo le parti che interagiscono con gli epitopi dell'antigene sono di origine murina). I topi geneticamente modificati possono sintetizzare anticorpi completamente umani.
Lo sviluppo di librerie di visualizzazione fagica ha apportato grandi miglioramenti nella produzione di anticorpi monoclonali. Questo recente metodo studia le interazioni molecolari (proteina-DNA, proteina-peptide e proteina-proteina) e si basa principalmente sul clonaggio di geni codificanti la regione Fab amplificati dai linfociti B in vettori fagici. Successivamente, i batteri potrebbero essere trasformati con questi vettori per esprimere i geni eterologhi dai capsidi virali, che hanno proteine virali e proteine codificate dalla sequenza Fab presa da queste particolari cellule.
Dopo il completamento della libreria, l'affinità tra le proteine sintetizzate da varie regioni Fab potrebbe essere esaminata contro i particolari antigeni e la cellula trasformata con plasmidi che hanno quei geni può essere facilmente sequenziata. Questo metodo ha molti vantaggi come la possibilità di produrre un numero elevato di nuovi anticorpi e non richiede passaggi di immunizzazione degli animali.
Fattori di produzione culturale
La scelta della linea cellulare appropriata è una delle procedure più critiche nello sviluppo di anticorpi monoclonali. Le cellule di mammifero, che sono stabili e possono secernere la proteina richiesta con la conformazione appropriata in grandi quantità, sono i sistemi di espressione più comunemente scelti per la produzione di anticorpi monoclonali.
L'adattamento per la sintesi, l'elaborazione e la secrezione di molecole altamente complesse può essere considerato il principale vantaggio di un sistema di espressione nei mammiferi. Due ospiti cellulari sono principalmente utilizzati per sintetizzare anticorpi monoclonali; Cellule ovariche di criceto cinese (CHO) e cellule di mieloma murino (NS0) (sottoclone non secernente Ig, non sintetizzatore di catene leggere di NS-1).
Le modificazioni genetiche nelle cellule CHO hanno generato linee cellulari in grado di produrre una grande quantità di anticorpi monoclonali umanizzati. Queste linee cellulari possono secernere fino a 100 pg/cellula/giorno. I microrganismi adattati attraverso le tecnologie di manipolazione genetica hanno un grande potenziale nell'industria poiché queste cellule sono facili da manipolare ed alterare rispetto alle cellule animali. Queste cellule hanno anche sistemi di espressione distinti ed il metodo di produzione è facile da convalidare e riproducibile.
Nei terreni di coltura per le cellule di mammifero devono essere trovati contenuti di ingredienti complessi che vanno dagli amminoacidi agli oligoelementi. Pertanto, il siero viene utilizzato per fornire questi nutrienti alle cellule. Tuttavia, a causa dell'insorgenza della malattia che si è verificata attraverso prioni difettosi, come l'encefalite spongiforme bovina, dovrebbe essere eseguita la rimozione di qualsiasi componente animale del terreno di coltura, in particolare se il terreno sarà utilizzato per prodotti industriali biofarmaceutici.
La preparazione di un mezzo appropriato può essere molto costosa e richiedere molto tempo. Le condizioni della coltura cellulare di mammifero per la produzione di anticorpi monoclonali sono nettamente definite; pH 7,15, temperatura 37 °C e livello di O 2 disciolto al 30-60%.
Il livello di CO 2 dovrebbe essere osservato per imitare i criteri fisiologici (31-54 mmHg). Le condizioni di crescita possono influenzare direttamente la crescita delle cellule ed i livelli di produzione.
ENGLISH
Monoclonal antibodies first arose from hybridomas, which are hybrid cells generated through the fusion of antibody-producing lymphocytes with tumor cells. Monoclonal antibodies are currently produced from the cultivation of these hybridomas. Recent research uses a range of engineered microorganisms and cells to produce monoclonal antibodies at commercial scales.
Monoclonal antibody production techniques
Hybridoma and phage display
The first production technology for stable monoclonal antibody production was developed in 1975 by creating a hybridoma, which is a stable hybrid cell able to produce a single antibody type against a certain epitope found in an antigen. In the early stages, the construction of hybridomas was made from murine models. This technology was based on taking out a pool of activated B lymphocytes from immunized animal spleens fusing them with immortalized myeloma cells that do not have the ability to synthesize hypoxanthine-guanine-phosphoribosyl transferase, a key enzyme found in the salvage pathway, one of the pathways needed for the synthesis of nucleotides.
The hybridoma cell selection requires the pool of cells being produced from the fusion, to be enriched in a selective media with aminopterin, a compound that can inhibit the de novo synthesis of nucleotides.
Myeloma cells do not have the salvage pathway, which is responsible for the production of nucleotides. If myeloma cells are in contact with aminopterin found in the selective medium, there will be inhibition of de novo synthesis. Therefore, myeloma cells will be not viable anymore because all main pathways for the production of nucleotides are blocked.
On the contrary, activated non-fused B lymphocytes will survive because their salvage pathways are working fine and nucleotide production will be continued even if aminopterin has blocked the de novo pathway. Yet, these activated non-fused B lymphocytes are mortal and they could replicate for only a finite number of times. Then, they will die at the end.
Cells, which are able to replicate indefinitely and synthesize nucleotides via the salvage pathway, can survive via selection conditions, and these cells are called the hybridomas. Murine antibody molecules, following a small number of infusions, could stimulate the human anti-mouse antibody response of the human immunity.
For the delivery of antibodies that are similar to human molecules, new methodologies have been evolved to produce a smaller amount of immunogenic chimeric antibodies (variable regions of the murine source are linked to constant regions of human antibodies). As a result, the requirement for less immunogenic alternatives enhanced the synthesis of humanized antibodies (just the parts that interact with antigen epitopes are from mouse origin). Genetically modified mice can synthesize fully human antibodies.
The development of phage display libraries has made great improvements in the production of monoclonal antibodies. This recent method investigates molecular interactions (protein-DNA, protein-peptide, and protein-protein) and is mainly based on cloning Fab-region-coding genes amplified from B lymphocytes into phage vectors. Following this, the bacteria could be transformed with these vectors for expressing the heterologous genes from viral capsids, which have viral proteins and proteins encoded by the Fab sequence taken by these particular cells.
After the completion of the library, the affinity between proteins synthesized from various Fab regions could be examined against the particular antigens and the cell transformed with plasmids that have those genes can be easily sequenced. This method has many advantages such as the potential to produce a high number of new antibodies and no requirement of animal immunizations steps.
Culture production factors
The choice of the appropriate cell line is one of the most critical procedures in developing monoclonal antibodies. The mammalian cells, which are stable and can secrete the required protein with the appropriate conformation at great amounts, are the most commonly chosen expression systems for the production of monoclonal antibodies.
Adaptation for the synthesis, processing and secretion of highly complex molecules can be considered the main advantage of a mammalian expression system. Two cell hosts are predominantly utilized to synthesize monoclonal antibodies; Chinese hamster ovary (CHO) cells and murine myeloma (NS0) cells (non-Ig secreting, non-light chain-synthesizing subclone of NS-1).
Genetic modifications in CHO cells have generated cell lines that are able to produce a great amount of humanized monoclonal antibodies. These cell lines can secrete up to 100 pg/cell/day. Microorganisms adapted through genetic manipulation technologies have great potential in industry since these cells are easy to manipulate and alter in comparison with animal cells. These cells also have distinct expression systems, and the production method is easy to validate and reproducible.
Complex ingredient contents which range from amino acids to trace elements must be found in the cultivation media for mammalian cells. Therefore, the serum is used to provide these nutrients to the cells. Yet, owing to the disease emergence that occurred through defective prions, such as bovine spongiform encephalitis, removal of any animal components of culture medium should be performed, particularly if the medium will be utilized for biopharmaceutical industrial products.
Preparation of an appropriate medium can be very expensive and time-consuming. The conditions of mammalian cell culture for monoclonal antibody production are sharply defined; pH 7.15, temperature 37 °C, and dissolved O2 level at 30–60%.
The level of CO2 should be observed to imitate the physiological criteria (31-54 mmHg). Growing conditions can directly affect the growth of cells and production levels.
Da:
https://www.azolifesciences.com/article/Culture-Processes-for-Monoclonal-Antibody-Production.aspx?utm_source=azonetwork_newsletter&utm_medium=email&utm_campaign=antibodies_newsletter_5_january_2022
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