14 suggerimenti per un'estrazione di RNA di successo / 14 Tips for a Successful RNA Extraction

14 suggerimenti per un'estrazione di RNA di successo / 14 Tips for a Successful RNA Extraction

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Anche il biologo molecolare più esperto ha urlato la sua imprecazione preferita durante un'estrazione di RNA. Per un non scienziato, può sembrare che questa povera persona lo stia perdendo, urlando contro un tubo innocente, pieno di liquido limpido e anonimo.

Ma per quegli scienziati che hanno sperimentato i molti guai dell'estrazione dell'RNA, è facile entrare in empatia. Gli sfoghi di rabbia (noti anche come RNAnger) sono un effetto collaterale naturale e comune del lavoro con l'RNA. Ed è comprensibile: la bassa resa di estrazione e l'RNA degradato possono capitare agli scienziati più esperti.

L'ottenimento di  RNA di alta qualità da tipi di campioni  è diventato una parte fondamentale di così tanti protocolli, tra cui il sequenziamento di nuova generazione (NGS), la PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR), il Northern blotting e la sintesi di cDNA, e molti scienziati lo eseguono di routine. L'RNA di bassa qualità può avere un impatto significativo sull'analisi a valle, con conseguente perdita di tempo e denaro.

Non deve essere così. Molti problemi di estrazione dell'RNA possono essere evitati e superati. Per potenziarti nel tuo viaggio verso la vittoria dell'estrazione dell'RNA, abbiamo 14 suggerimenti per prendere il tuo RNAnger e trasformarlo in RNAccumen.

Seleziona il kit di isolamento dell'RNA giusto

Esistono molti kit e reagenti per l'estrazione dell'RNA. Ma alcuni protocolli o formati potrebbero essere più adatti ai tuoi obiettivi. Fai  un'attenta ricerca su ciascun kit  o reagente e considera il tipo di campione da cui estrai l'RNA, la quantità iniziale di quel campione, il metodo di analisi a valle, la velocità effettiva richiesta e il tipo di RNA che stai analizzando.

Ad esempio, se hai bisogno di un metodo di purificazione ad alto rendimento per l'RNA totale, potresti prendere in considerazione i  kit scalabili MagMAX™  invece dell'estrazione di  TRIzol RNA. Ma se hai un numero limitato di campioni e desideri utilizzare un metodo standard per l'RNA di alta qualità, probabilmente sceglierai TRIzol ogni volta.

Prestare attenzione agli importi di input

Di più non è sempre meglio. La maggior parte dei  kit e dei reagenti di isolamento dell'RNA  fornisce un numero consigliato di materiale di partenza per un determinato tipo di campione. L'aggiunta di più di quanto raccomandato può inibire la lisi efficace o la separazione dell'RNA da altri componenti cellulari. Per i protocolli basati su colonne, è possibile sovraccaricare la capacità di associazione della colonna, il che può ridurre i rendimenti complessivi.

Tieni presente che il contenuto di RNA può variare in modo significativo nei diversi tessuti animali: le cellule cardiache e muscolari hanno meno RNA complessivo rispetto alle cellule della milza e del timo, che tendono ad essere ricche di acidi nucleici. Questi tessuti possono anche introdurre ulteriori fattori confondenti  che possono complicare l'estrazione e potrebbero essere necessarie modifiche al protocollo per estrarre RNA di alta qualità.

Creare un ambiente privo di RNAsi

RNasi? Mai sentito parlare di loro, giusto?

Sono il nemico numero uno della tua estrazione di RNA. Possono essere difficili da disattivare o eliminare. Le RNasi della famiglia delle RNasi A sono stabilizzate da numerosi legami disolfuro e possono mantenere l'attività,  anche dopo essere state denaturate. 

Per mitigare l'introduzione accidentale di RNasi durante l'estrazione dell'RNA, crea un santuario da banco privo di RNasi. Quest'area può essere una sezione della tua panca, delimitata con nastro adesivo separato da dove esegui le estrazioni di DNA o proteine. Conserva reagenti, materiali di consumo, pipette e guanti in quest'area dedicata al tuo lavoro di estrazione dell'RNA.

Indossa i tuoi DPI

Sei una fonte primaria di RNasi. Il  sudore e l'olio della pelle  sono una ricca fonte di contaminazione da RNasi. Per questo motivo, indossare guanti per prevenire la contaminazione delle mani è di fondamentale importanza. E se ti capita di usare i guanti che indossi per toccare una superficie che potrebbe avere RNasi su di essa (ad esempio, la maniglia della porta, il tuo viso o altre superfici al di fuori della zona libera da RNAsi che hai creato sopra), assicurati di cambiare il tuo guanti. Puoi anche indossare il camice da laboratorio per assicurarti che nessun'altra parte della tua pelle entri in contatto con i tuoi campioni.

Utilizzare reagenti e materiali di consumo privi di RNAsi

In linea con il punto precedente, puoi anche acquistare prodotti per la pulizia, materiali di consumo e altri reagenti che possono aiutare a tenere a bada le RNasi, assicurando che non si avvicinino al tuo RNA. Le soluzioni di decontaminazione delle superfici possono aiutare a rimuovere le RNasi da vetreria, piani di lavoro e pipette.

Si può presumere che tutte le provette e i puntali delle pipette siano privi di RNasi, ma molti potrebbero aver avuto l'introduzione di RNasi durante la produzione. Assicurarsi che i materiali di consumo siano certificati come privi di RNasi e di utilizzare puntali con filtro per prevenire la contaminazione del puntale della pipetta o la contaminazione del campione incrociato.

Esegui un esperimento pilota

Potresti non renderti conto che un potenziale passaggio espone il tuo RNA alla contaminazione da RNasi o che il kit che intendi utilizzare non è adatto al tuo tipo di campione fino a quando non inizi l'estrazione di RNA. Per evitare di sprecare i tuoi campioni preziosi, esegui un esperimento pilota con campioni meno preziosi in modo da poter risolvere i nodi nel tuo protocollo di estrazione dell'RNA. Ciò può far risparmiare costose rilavorazioni o dover raccogliere nuovamente i campioni.

Stabilizza il tuo RNA

La natura biochimica dell'RNA lo rende  intrinsecamente instabile  e alcuni RNA hanno  un'emivita breve. Per assicurarti di non influenzare l'analisi a valle, ti consigliamo di interrompere rapidamente tutte le RNasi endogene il più rapidamente possibile dopo la raccolta del campione. Puoi farlo lisando le cellule usando  TRIzol  o tampone di lisi dal nostro  PureLink™ RNA Mini Kit  e congelando i campioni a -80° C per l'elaborazione successiva. È inoltre possibile estrarre l'RNA immediatamente dopo la risospensione nel buffer di lisi. In alternativa, i campioni di congelamento rapido in azoto liquido possono prevenire la degradazione dell'RNA dopo la raccolta del campione.

Se non vuoi affrontare le difficoltà dell'azoto liquido, puoi utilizzare i reagenti di stabilizzazione dell'RNA, come  RNAlater . Inattiva immediatamente le RNasi e ti dà la flessibilità di estrarre l'RNA quando hai tempo, senza doversi preoccupare della degradazione dell'RNA.

Aggiungi fasi di lisi meccanica o enzimatica

Campioni FFPE, campioni di  sangue e alcuni microbi sono notoriamente difficili da estrarre una quantità sufficiente di RNA di alta qualità e potrebbero richiedere passaggi aggiuntivi per garantire la lisi completa. Questi possono includere la lisi meccanica mediante battitura di perline o pretrattamento enzimatico mediante lisozima o proteinasi K. Come accennato in precedenza, la lisi incompleta può causare problemi a valle con i metodi di estrazione basati su colonna. Prima di estrarre l'RNA da un campione impegnativo, rivedere attentamente il protocollo per vedere se includono passaggi specifici del protocollo per campioni impegnativi.

Mantieni le cose fredde

L'instabilità dell'RNA rende fondamentale mantenere i campioni freddi durante l'elaborazione. Se hai già riscontrato problemi con le RNasi, considera di mantenere le soluzioni di estrazione fredde, di eseguire l'estrazione in una cella frigorifera o di utilizzare una centrifuga prerefrigerata per le fasi di centrifugazione.

Rimuovere la contaminazione del DNA

La maggior parte dei kit e dei reagenti di isolamento dell'RNA svolge un lavoro efficace nella rimozione del DNA genomico o plasmidico contaminante. Ma alcuni metodi di quantificazione a valle, come  NanoDrop , o applicazioni, come qRT-PCR, possono rilevare quantità anche minuscole di DNA e complicare l'analisi.

Per correggere questo problema, molti metodi di purificazione basati su colonna includono la DNasi I, come  PureLink™ DNase Set , che può essere utilizzato per il trattamento in colonna. Puoi anche usare la DNasi I per la digestione post-estrazione.

Quantificare l'RNA ed eseguire il controllo di qualità

Esistono diversi metodi per eseguire il controllo di qualità sull'RNA purificato e ottenere quantificazioni accurate. È possibile utilizzare l'assorbanza UV a lunghezze d'onda di 260 nm (per gli acidi nucleici), 280 nm (per le proteine ​​contaminanti) e 230 nm (per altri contaminanti come l'isotiocianato di guanidina). La purezza dell'RNA può essere stimata osservando il rapporto tra A260/A280 (obiettivo compreso tra 1,8 e 2,2) e A260/A230 (obiettivo >1,7).

I fluorometri, come il  Qubit Fluorometer,  possono anche quantificare l'RNA e sono più sensibili dei metodi basati sull'assorbanza UV. I metodi basati sulla microfluidica sono utili anche per quantificare l'RNA e determinare la qualità. I campioni vengono etichettati con un colorante fluorescente e sottoposti a elettroforesi attraverso una matrice di gel. Diverse specie di RNA migrano attraverso la matrice in funzione delle dimensioni e l'integrità dell'RNA può essere stimata osservando una traccia completa di fluorescenza. Il metodo può rilevare contaminanti del DNA o prodotti di degradazione dell'RNA e formularli in un numero di integrità dell'RNA (RIN) su una scala da 1 a 10, con 10 che indica la migliore integrità dell'RNA.

Conserva il tuo RNA purificato

Molti kit basati su colonne o microsfere forniscono tamponi di eluizione privi di RNasi che possono proteggere l'integrità dell'RNA a lungo termine. Per l'estrazione di TRIzol RNA, è possibile risospendere i pellet essiccati in acqua priva di RNasi o altre soluzioni di conservazione speciali. Dopo la quantificazione, aliquotare l'RNA in provette monouso in modo da ridurre al minimo i cicli di congelamento-scongelamento (che possono portare alla degradazione) o la contaminazione accidentale dell'RNasi. Se prevedi di utilizzare il tuo RNA a breve termine, conservalo a -20°C. In caso contrario, conservalo a -80°C per una conservazione a lungo termine.

Automatizza la tua estrazione

Diversi kit di estrazione dell'RNA disponibili (inclusi i kit MagMAX menzionati in precedenza) possono essere utilizzati con sistemi di estrazione e purificazione automatizzati, come  KingFisher™ . L'automazione aiuta a evitare uno dei principali problemi con l'estrazione dell'RNA: la contaminazione da RNasi dal contatto umano. Consente inoltre una purificazione dell'RNA riproducibile e riduce del 75% il tempo di intervento manuale rispetto alla preparazione manuale del campione.

ENGLISH

Even the most experienced molecular biologist has screamed their favorite expletive during an RNA extraction. To a non-scientist, it can look like this poor person is losing it, yelling at an innocent tube, filled with clear, nondescript liquid.

But to those scientists who have experienced the many woes of RNA extraction, it’s easy to empathize. Outpourings of anger (also known as RNAnger) are a natural and common side effect of working with RNA. And it’s understandable: Low extraction yield and degraded RNA can happen to the most senior scientists.

Obtaining high-quality RNA from sample types has become a fundamental part of so many protocols, including next-generation sequencing (NGS), quantitative real-time PCR (qRT-PCR), northern blotting, and cDNA synthesis, and many scientists perform it routinely. Low-quality RNA can significantly impact downstream analysis, leading to lost time and money.

It doesn’t have to be this way. Many RNA extraction issues can be avoided and conquered. To empower you on your journey to RNA extraction victory, we have 14 tips to take your RNAnger and transform it into RNAccumen.

Select the Right RNA Isolation Kit

There are a lot of kits and reagents out there for RNA extraction. But certain protocols or formats may be better suited for your goals. Do careful research on each kit or reagent and consider the type of sample you’ll be extracting RNA from, the starting amount of that sample, your downstream analysis method, required throughput, and the type of RNA you’re analyzing.

For example, if you need a high-throughput purification method for total RNA, then you may want to consider the scalable MagMAX™ kits instead of TRIzol RNA extraction. But if you have a small number of samples and want to use a gold-standard method for high-quality RNA, you’ll likely pick TRIzol every time.

Pay Attention to Input Amounts

More isn’t always better. Most RNA isolation kits and reagents provide a recommended number of starting material for a given sample type. Adding more than is recommended can inhibit effective lysis or separation of RNA from other cellular components. For column-based protocols, you may overload the binding capacity of the column, which can reduce overall yields.

Be aware that the RNA contents can vary significantly in different animal tissues: Heart and muscle cells have less overall RNA than spleen and thymus cells, which tend to be nucleic-acid rich. These tissues can also introduce additional confounding factors that may complicate extraction and protocol modifications may be needed to extract high-quality RNA.

Create an RNAse-Free Environment

RNases? Never heard of ‘em, right?

They are the number one enemy of your RNA extraction. They can be tough to inactivate or get rid of. RNases in the RNase A family are stabilized by several disulfide bonds and can retain activity, even after being denatured.

To mitigate the accidental introduction of RNases during your RNA extraction, create an RNase-free benchtop sanctum. This area can be a section of your bench, marked off with tape that is separate from where you do DNA or protein extractions. Keep reagents, consumables, pipettes, and gloves in this area that are dedicated to your RNA extraction work.

Wear Your PPE

You are a prime source of RNases. Your perspiration and skin oil is a rich source for RNase contamination. For that reason, wearing gloves to prevent contamination from your hands is critically important. And if you happen to use the gloves you’re wearing to touch a surface that could have RNases on it (i.e., doorknob, your face, or other surfaces outside of the RNAse-free zone you created above), be sure to change your gloves. You can also wear your lab coat to make sure that no other part of your skin comes in contact with your samples.

Use RNAse-Free Reagents and Consumables

Aligned with the above point, you can also purchase cleaning products, consumables, and other reagents that can help keep the RNases at bay, ensuring that they don’t come anywhere near your RNA. Surface decontamination solutions can help remove RNases from glassware, benchtops, and pipettes.

You may assume that all tubes and pipette tips are RNase-free out of the box, but many may have had RNases introduced during manufacturing. Be sure that your consumables are certified as RNase-free and that you use filter tips to prevent contamination from your pipette tip or cross-sample contamination.

Run a Pilot Experiment

You may not realize that a potential step exposes your RNA to RNase contamination or that the kit you’re planning to use isn’t suitable for your sample type until you start your RNA extraction. To prevent you from squandering your valuable samples, run a pilot experiment with less valuable samples so that you can work out the kinks in your RNA extraction protocol. This can save on costly rework or having to re-collect samples.

Stabilize Your RNA

The biochemical nature of RNA makes it inherently unstable and some RNAs have short half-lives. To make sure you aren’t biasing your downstream analysis, you’ll want to quickly disrupt all endogenous RNases as quickly as possible after sample collection. You can do this by lysing cells using TRIzol or lysis buffer from our PureLink™ RNA Mini Kit and freezing samples at -80° C for later processing. You can also extract RNA immediately after resuspension in lysis buffer. Alternatively, flash freezing samples in liquid nitrogen can prevent RNA degradation after sample collection.

If you don’t want to deal with the difficulties of liquid nitrogen, you can use RNA stabilization reagents, such as RNAlater. It inactivates RNases immediately and gives you the flexibility to extract RNA when you have time, without having to worry about RNA degradation.

Add Mechanical or Enzymatic Lysis Steps

FFPE samples, blood samples, and certain microbes are notoriously challenging to extract a sufficient amount of high-quality RNA from and may require additional steps to ensure complete lysis. These can include mechanical lysis using bead-beating or enzymatic pre-treatment using lysozyme or proteinase K. As mentioned earlier, incomplete lysis may cause downstream issues with column-based extraction methods. Before extracting RNA from a challenging sample, carefully review the protocol to see if they include specific protocol steps for challenging samples.

Keep Things Cold

The instability of RNA makes it critical to keep samples cold throughout processing. If you’ve encountered issues with RNases before, consider keeping extraction solutions cold, doing the extraction in a cold room, or using a pre-chilled centrifuge for centrifugation steps.

Remove DNA Contamination

Most RNA isolation kits and reagents do an effective job of removing contaminating genomic or plasmid DNA. But certain downstream quantification methods, such as NanoDrop, or applications, such as qRT-PCR, can detect even minuscule amounts of DNA and complicate analysis.

To rectify this, many column-based purification methods include DNase I, like PureLink™ DNase Set, which can be used for on-column treatment. You can also use DNase I for post-extraction digestion.

Quantify RNA and Run Quality Control

There are several methods for running quality control on your purified RNA and getting accurate quantifications. You can use UV absorbance at wavelengths 260nm (for nucleic acids), 280nm (for contaminating protein), and 230nm (for other contaminants like guanidine isothiocyanate). RNA purity can be estimated by looking at the ratio of A260 / A280 (aim for between 1.8 and 2.2) and A260 / A230 (aim for >1.7).

Fluorometers, such as the Qubit Fluorometer, can also quantify RNA and are more sensitive than UV absorbance-based methods. Microfluidics-based methods are also helpful in quantifying RNA and determining quality. Samples are labeled with a fluorescent dye and electrophoresed through a gel matrix. Different RNA species migrate through the matrix as a function of size and RNA integrity can be estimated by looking at a full trace of fluorescence. The method can detect DNA contaminants or RNA degradation products and formulate them into an RNA Integrity Number (RIN) on a scale of 1 to 10, with 10 indicating the best RNA integrity.

Store Your Purified RNA

Many column- or bead-based kits provide RNase-free elution buffers that can protect the integrity of RNA long-term. For TRIzol RNA extraction, you can resuspend dried pellets in RNase-free water or other special storage solutions. After quantification, aliquot your RNA into single-use tubes so that you can minimize freeze-thaw cycles (which can lead to degradation) or accidental RNase contamination. If you plan to use your RNA in the short term, store it at -20° C. Otherwise, store it at -80° C for longer-term storage.

Automate Your Extraction

Several RNA extraction kits available (including the MagMAX kits mentioned earlier) can be used with automated extraction and purification systems, such as the KingFisher™. Automation helps to avoid one of the major issues with RNA extraction – RNase contamination from human contact. It also enables reproducible RNA purification and reduces the amount of hands-on time by 75%, compared to manual sample preparation.

Da:

https://www.thermofisher.com/blog/life-in-the-lab/14-tips-for-a-successful-rna-extraction/?cid=bid_sap_rst_r01_co_cp1434_pjt8107_col116634_0so_fbk_da_awa_rt_s18_FB02&fbclid=IwAR1P34sZpYHaG16a0eBlaePXZVUdQyUsq5PxS7lmTomzQarkbr92Y5465XI