Dalla A alla V di m/z: recenti aggiornamenti nella spettrometria di massa per lo sviluppo di vaccini / The A to V of m/z: recent updates in mass spectrometry for vaccine development

 Dalla A alla V di m/z: recenti aggiornamenti nella spettrometria di massa per lo sviluppo di vaccini / The A to V of m/z: recent updates in mass spectrometry for vaccine development

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Con l'avvicinarsi della conclusione della Settimana Mondiale dell'Immunizzazione e in vista della nostra prossima partecipazione al congresso annuale della Società Americana di Spettrometria di Massa sul cervello, abbiamo approfondito il ruolo sempre più importante che la spettrometria di massa (MS) sta assumendo nello sviluppo e nella somministrazione dei vaccini.

Dal suo utilizzo nella caratterizzazione degli antigeni, nella valutazione della risposta immunitaria e persino nell'individuazione di vaccini contraffatti, fino agli ultimi sviluppi tecnologici ed alle potenziali insidie ​​analitiche da evitare, trattiamo tutto ciò che è necessario sapere sullo stato attuale della spettrometria di massa in vaccinologia.

Il ruolo della sclerosi multipla nello sviluppo dei vaccini

Per gran parte della loro storia, i vaccini si sono basati sulla presentazione al sistema immunitario umano di particelle patogene autentiche e presenti in natura, come antigeni, tossine od il patogeno stesso, che sono state in qualche modo disattivate. Durante questo periodo, la spettrometria di massa (MS) ha svolto un ruolo limitato nello sviluppo dei vaccini. Tuttavia, con la possibilità di utilizzare la nuova generazione di antigeni ricombinanti, l'importanza di caratterizzare accuratamente gli antigeni patogeni da replicare – identificandone gli attributi critici di qualità (CQA) – e di quantificare e caratterizzare gli antigeni ricombinanti prodotti, è diventata fondamentale per il successo di una nuova classe di vaccini in fase di sviluppo.

Poiché la maggior parte degli antigeni selezionati per lo sviluppo di vaccini sono glicoproteine ​​complesse ad alto peso molecolare, essi rappresentano ottimi bersagli per l'analisi mediante spettrometria di massa (MS). Questa tecnica, spesso abbinata a diverse forme di cromatografia liquida (LC), è diventata un pilastro fondamentale in questo aspetto dello sviluppo dei vaccini. Utilizzando approcci basati sulla spettrometria di massa, i ricercatori possono caratterizzare gli antigeni, rivelandone la sequenza aminoacidica, il peso molecolare ed i modelli di modificazione post-traduzionale, più comunemente la glicosilazione. Per determinare la glicosilazione, la cromatografia liquida a interazione idrofila (HILIC), in combinazione con la spettrometria di massa in modalità ionica positiva e negativa, è il metodo più comunemente utilizzato, in quanto permette di stabilire il profilo glicanico di un antigene. Le tecnologie LC-MS/MS vengono utilizzate anche per determinare caratteristiche come i legami disolfuro, un fattore chiave nella formazione strutturale di un antigene. La LC-MS/MS viene inoltre impiegata per identificare le impurità, come le proteine ​​delle cellule ospiti, che devono essere rimosse dalla resa del prodotto antigenico di una linea cellulare utilizzata nel processo di bioproduzione.

Tutto ciò evidenzia la necessità di approcci alternativi per caratterizzare questi antigeni espressi. In un recente articolo di Scientific Reports, i ricercatori della Pfizer (New York, USA) hanno descritto lo sviluppo di un test di cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem in vitro (IVE-LC/MS/MS) in grado sia di caratterizzare le proteine ​​virali dell'emoagglutinina dell'influenza umana, sia di quantificarne l'espressione nelle cellule T HEK293 dopo la transfezione.

Individuare i vaccini contraffatti

Oltre al suo ruolo nella caratterizzazione degli antigeni, la spettrometria di massa (MS) si è recentemente dimostrata utile anche nelle fasi successive dello sviluppo dei vaccini, consentendo di distinguere i vaccini "falsi" da quelli autentici. I ricercatori dell'Università di Oxford (Regno Unito) hanno creato un metodo di spettrometria di massa innovativo, basato sull'apprendimento automatico, per autenticare i vaccini, che potrebbe offrire una soluzione alla minaccia per la salute pubblica rappresentata dalla diffusione dei vaccini contraffatti.

La crescente diffusione di vaccini di qualità inferiore e contraffatti è causata dal deterioramento dei vaccini autentici e dalla produzione di prodotti vaccinali deliberatamente falsificati. Nonostante le preoccupazioni in merito, attualmente non esistono infrastrutture globali coordinate o metodi di screening per monitorare le catene di approvvigionamento dei vaccini. Considerando ciò, il gruppo ha sviluppato un flusso di lavoro di spettrometria di massa a desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI-MS) che utilizza l'apprendimento automatico open-source e l'analisi statistica per individuare i vaccini contraffatti.

Utilizzando un sistema VITEK MS di bioMérieux (Marcy-l'Étoile, Francia) ed il software AnalyzerPro XD di SpectralWorks (Runcorn, Regno Unito) per l'analisi dei dati, i ricercatori hanno testato il flusso di lavoro utilizzando quattro diversi vaccini disponibili in commercio, tra cui quelli contro l'influenza, l'epatite B e la meningite, ed una serie di composizioni vaccinali contraffatte note. Hanno quindi utilizzato l'apprendimento automatico ed ulteriori analisi statistiche per modellare i dati e prevedere le caratteristiche m/z, dimostrando infine di disporre di un modello affidabile in grado di distinguere i vaccini autentici da quelli contraffatti.

"Per quanto ne sappiamo, questa è la prima volta che la spettrometria di massa MALDI-MS è stata utilizzata con successo per identificare e distinguere i vaccini dai surrogati contraffatti utilizzando un approccio di apprendimento automatico per l'analisi dei dati", scrivono. Dato che il metodo si basa su apparecchiature di spettrometria di massa clinica già diffuse a livello globale, sperano che il loro lavoro ci avvicini alla soluzione dell'urgente necessità di uno screening più efficace della catena di approvvigionamento dei vaccini.

Monitoraggio delle risposte ai vaccini

Inoltre, la spettrometria di massa (MS) è stata utilizzata per analizzare le risposte individuali ai vaccini. Ad esempio, uno studio del 2025 ha sfruttato un innovativo flusso di lavoro LC-MS/MS basato su nanoparticelle per valutare i cambiamenti proteomici in risposta ai vaccini a mRNA contro il COVID-19.

Fin dalla loro somministrazione durante la pandemia di COVID-19, la ricerca ha dimostrato che le risposte immunitarie a questi vaccini variano da individuo ad individuo, il che può comportare un'efficacia vaccinale variabile. Per studiare come gli individui rispondono ai vaccini nel contesto del COVID-19, i ricercatori di Seer Inc. (California, USA) hanno studiato una coorte di 12 volontari dopo la somministrazione di due dosi del vaccino mRNA anti-COVID-19 di Pfizer-BioNTech.

Hanno combinato un innovativo flusso di lavoro LC-MS/MS basato su nanoparticelle con l'etichettatura di massa tandem per valutare i cambiamenti proteomici, quantificando oltre 3000 proteine ​​e fornendo la "visione più approfondita del proteoma plasmatico correlato al vaccino COVID-19" finora ottenuta. Hanno identificato 69 proteine ​​regolate in modo dose-dipendente in risposta alla vaccinazione e 74 proteine ​​che sono regolate specificamente nei partecipanti che hanno contratto il COVID-19 dopo la vaccinazione.

I risultati forniscono preziose informazioni sulla variabilità individuale nella risposta alla vaccinazione contro il COVID-19, sottolineando l'importanza della profilazione proteomica globale per comprendere la risposta al vaccino, nonché il potenziale utilizzo della LC-MS/MS a tale scopo.

Ecco alcune cose a cui prestare attenzione…

I progressi nelle tecnologie di spettrometria di massa hanno ampliato le capacità di questa tecnica, consentendo di ottenere informazioni dettagliate sulla struttura proteica e dati sulla sequenza amminoacidica di potenziali antigeni bersaglio e prodotti vaccinali.

Fortunatamente, questo aumento dei dati è stato accompagnato da software sempre più efficaci per la loro interpretazione. Tuttavia, i modelli accademici spesso non soddisfano i requisiti per una validazione universale, pertanto si utilizzano strumenti commerciali per garantire che i risultati siano ampiamente applicabili e ripetibili in altri laboratori. Anche in questo caso, però, si riscontrano dei problemi. Strumenti diversi sono soggetti a errori diversi: etichettatura errata delle modificazioni post-traduzionali negli antigeni o confusione tra coppie di amminoacidi e coppie con proprietà simili negli anticorpi.

Questo serve a ricordare che, sebbene le tecniche di spettrometria di massa stiano progredendo rapidamente e le nuove tecnologie consentano analisi più veloci per favorire lo sviluppo dei vaccini, un'attenta analisi manuale è ancora talvolta necessaria per convalidare i risultati e garantire che gli artefatti in silico non vengano utilizzati nella ricerca come dati di fatto.

ENGLISH

As World Immunization Week nears its conclusion, and with our upcoming attendance at the annual meeting of the American Society of Mass Spectrometry on the brain, we have explored the expanding role that mass spectrometry (MS) is playing in the development and administration of vaccines.

From its use in the characterization of antigens, assessment of immune response and even the detection of fake vaccines, to its latest technological developments and the potential pitfalls in analysis to watch out for, we cover all you need to know about the current state of play of MS in vaccinology.

The role of MS in vaccine development

For most of their history, vaccines have relied on presenting the human immune system with authentic, naturally occurring pathogenic particles such as antigens, toxins or the pathogen itself, which have been deactivated in some way. Throughout this era, MS played a limited role in vaccine development. However, as the next generation of recombinant antigens became possible, the importance of thoroughly characterizing the pathogenic antigens to be replicated – identifying their critical quality attributes (CQAs) – and quantifying and characterizing the recombinant antigens produced, became tantamount to the success of a new class of vaccines in development.

As most antigens selected for use in vaccine development are high-molecular-weight, complex glycoproteins, they are good targets for analysis with MS, and the technique, frequently coupled with different forms of liquid chromatography (LC), has risen to become a vital pillar in this aspect of vaccine development. Using MS-based approaches, researchers can characterize antigens, revealing their amino-acid sequence, molecular weight and patterns of post-translational modification, most commonly glycosylation. To determine glycosylation, hydrophilic‐interaction liquid chromatography (HILIC) – in combination with both positive and negative ion mode MS – is the most routinely used method as it establishes the glycan profile of an antigen. LC-MS/MS technologies are also used to determine characteristics like disulfide-bond linkages, a key factor in the structural formation of an antigen. LC-MS/MS is also deployed to identify impurities, such as host cell proteins, that must be removed from the antigen product yield of a cell line used in the bioproduction process.

Increasing vaccine complexity drives innovation in MS technology

As our understanding of immunology and capabilities in protein synthesis have improved, novel vaccine antigens have become increasingly complex, making their subsequent characterization increasingly challenging. This is well evidenced by a recent vaccine, Shingrix®, which is a highly complex recombinant glycoprotein E (RgE)-based vaccine against herpes zoster (HZ) approved for use by the FDA in 2017 and the European Commission in 2018.

The success of this vaccine has made it a subject of interest for further vaccine development, but the comprehensive characterization of its CQAs has proven challenging. This is due to the extensive post-translational modification of RgE with both phosphorylation and N- and O-linked glycans, the latter of which has no established universal enzymatic digestion protocol, unlike its N-linked counterpart. A further confound is added by the ever-challenging detection of host-cell proteins, which often exceed MS dynamic limits due to their wide-ranging concentrations.

To address these challenges researchers from Thermo Fisher Scientific (MA, USA), the Chinese Academy of Sciences and the Chinese National Institutes for Food and Drug Control (both Beijing, China) have developed a novel LC-MS workflow with which to comprehensively characterize HZ vaccines. Their workflow brings together nano-flow LC, high-flow LC, native separation techniques, high-resolution MS and an array of ion activation methods. Ultra high-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UHPLC-MS) analyses were employed in their study for analyzing intact proteins as well as determining molecular weight, sequence integrity and disulfide bond formation under native and denatured conditions.

The most recent evolution in vaccine development has been the emergence of nucleic acid-based vaccines, spurred on by the race to develop the COVID-19 vaccine. In these vaccines, sections of DNA, or more commonly mRNA, that code for a viral or bacterial antigen, are packaged into lipid nanoparticles or virus-like particles that then transfect the recipient’s cells with their genetic payload, enabling them to produce the antigen in vivo.

Here, again, MS-based techniques have had to adapt to a new environment. Instead of characterizing the vaccine directly, there is a requirement for analysis of the antigen expressed within the transfected cells, often in an in vitro setting during vaccine development. In this realm, flow cytometry currently reigns supreme. However, flow cytometric approaches rely on the use of antigen-specific antibodies raised in animals: a time consuming and resource intensive process. In the perennial development of vaccines for highly mutable conditions like flu, rapid and significant changes in strain could mean that there is not enough time to produce new antibodies specific to the new antigen of interest.

This all points to a need for alternative avenues with which to characterize these expressed antigens. In a recent Scientific Reports article, researchers from Pfizer (NY, USA) reported the development of an in-vitro expression liquid chromatography tandem mass spectrometry (IVE-LC/MS/MS) assay capable of both characterizing human influenza hemagglutinin viral proteins and quantitating their expression in HEK293 T cells following transfection.

Detecting fake vaccines

As well as its role in antigen characterization, MS has recently proven useful further down the vaccine development pipeline, discerning ‘fake’ vaccines from real ones. Researchers from the University of Oxford (UK) have created a first-of-its-kind mass spectrometry method for authenticating vaccines with machine learning, which may offer a solution to the public health threat posed by the rise in counterfeit vaccines.

This growing prevalence in substandard and falsified vaccines is caused by the degradation of authentic vaccines and the production of deliberately falsified vaccine products. Despite concerns surrounding this, there are currently no coordinated global infrastructure or screening methods to monitor vaccine supply chains. Considering this, the team developed a matrix-assisted laser desorption/ionisation-mass spectrometry (MALDI-MS) workflow that uses open-source machine learning and statistical analysis to essentially sniff out fake vaccines.

Using a bioMérieux (Marcy-l’Étoile, France) VITEK MS system and SpectralWorks (Runcorn, UK) AnalyzerPro XD software for the data analysis, the researchers tested the workflow using four different commercially available vaccines – including for influenza, hepatitis B and meningococcal disease – and a range of known falsified vaccine compositions. They then used machine learning and additional statistical analysis to model the data and predict m/z features, ultimately demonstrating that they had a reliable model that could differentiate authentic and falsified vaccines.

“To the best of our knowledge, this is the first time MALDI-MS has been used to successfully identify and discriminate vaccines and falsified surrogates using a machine-learning approach to data analysis,” they write. Seeing as the method relies on clinical MS machines already distributed globally, they hope their work will bring us closer to addressing the urgent need for more effective vaccine supply chain screening.

Monitoring responses to vaccines

In addition, MS has been used to analyze individual responses to vaccines. For example, a 2025 study leveraged a novel nanoparticle-based LC-MS/MS workflow to assess proteomic changes in response to mRNA COVID-19 vaccines.

Since their deployment throughout the COVID-19 pandemic, research has demonstrated that immune responses to these vaccines differ among individuals, which can lead to varying vaccine efficacy. To investigate how individuals respond to vaccines in the context of COVID-19, researchers from Seer Inc. (CA, USA) studied a cohort of 12 volunteers following two doses of the Pfizer-BioNTech mRNA COVID-19 vaccine.

They combined a novel nanoparticle-based LC-MS/MS workflow with tandem mass tag labeling to assess proteomic changes, quantifying over 3000 proteins and providing the “deepest view into [the] COVID-19 vaccine-related plasma proteome” yet. They identified 69 proteins regulated in a dose-dependent way in response to vaccination and 74 proteins that are specifically regulated in participants who contracted COVID-19 after vaccination.

The findings provide valuable insight into individual variability in response to COVID-19 vaccination, emphasizing the importance of global proteome profiling in understanding vaccine response as well as the potential use of LC-MS/MS for this purpose.

A few things to watch out for…

The developments in MS technologies have expanded the capabilities of this technique to provide detailed protein structure information and amino acid sequence data for potential target antigens and vaccine products.

Thankfully, this increase in data has been matched by increasingly effective software with which to interpret it. However, academic models often fail to meet requirements for universal validation, so commercial tools are used to ensure findings are widely applicable and repeatable in other labs. Yet, here too, there are issues. Different tools are prone to different errors: mislabeling post-translational modifications in antigens or confusing amino acid pairs with those with similar properties in antibodies.

This serves as a reminder that while MS techniques are advancing at pace and new technologies are enabling faster analysis to help drive vaccines forward, carful manual analysis is still required at times to validate results and ensure in silico artifacts don’t make it into research as fact.

Da:

https://www.biotechniques.com/drug-discovery-development/the-a-to-v-of-m-z-recent-updates-in-mass-spectrometry-for-vaccine-development/