Beyond CRISPR: A guide to the many other ways to edit a genome / Non solo CRISPR: i tanti modi per manipolare un genoma.

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa
 / Reported by Dr. Joseph Cotellessa

The popular technique has limitations that have sparked searches for alternatives.

The CRISPR–Cas9 tool enables scientists to alter genomes practically at will. Hailed as dramatically easier, cheaper and more versatile than previous technologies, it has blazed through labs around the world, finding new applications in medicine and basic research.

But for all the devotion, CRISPR–Cas9 has its limitations. It is excellent at going to a particular location on the genome and cutting there, says bioengineer Prashant Mali at the University of California, San Diego. “But sometimes your application of interest demands a bit more.”

The zeal with which researchers jumped on a possible new gene-editing system called NgAgoearlier this year reveals an undercurrent of frustration with CRISPR–Cas9 — and a drive to find alternatives. “It’s a reminder of how fragile every new technology is,” says George Church, a geneticist at Harvard Medical School in Boston, Massachusetts.  

A mini-meNgAgo is just one of a growing library of gene-editing tools. Some are variations on the CRISPR theme; others offer new ways to edit genomes.

CRISPR–Cas9 may one day be used to rewrite the genes responsible for genetic diseases. But the components of the system — an enzyme called Cas9 and a strand of RNA to direct the enzyme to the desired sequence — are too large to stuff into the genome of the virus most commonly used in gene therapy to shuttle foreign genetic material into human cells.

A solution comes in the form of a mini-Cas9, which was plucked from the bacterium Staphylococcus aureus¹. It’s small enough to squeeze into the virus used in one of the gene therapies currently on the market. Last December, two groups used the mini-me Cas9 in mice to correct the gene responsible for Duchenne muscular dystrophy^2, 3.

Expanded reach

Cas9 will not cut everywhere it’s directed to — a certain DNA sequence must be nearby for that to happen. This demand is easily met in many genomes, but can be a painful limitation for some experiments. Researchers are looking to microbes to supply enzymes that have different sequence requirements so that they can expand the number of sequences they can modify.

One such enzyme, called Cpf1, may become an attractive alternative. Smaller than Cas9, it has different sequence requirements and is highly specific^4, 5.

Another enzyme, called C2c2, targets RNA rather than DNA — a feature that holds potential for studying RNA and combating viruses with RNA genomes⁶.

True editors

Many labs use CRISPR–Cas9 only to delete sections in a gene, thereby abolishing its function. “People want to declare victory like that’s editing,” says Church. “But burning a page of the book is not editing the book.”

Those who want to swap one sequence with another face a more difficult task. When Cas9 cuts DNA, the cell often makes mistakes as it stitches together the broken ends. This creates the deletions that many researchers desire.

But researchers who want to rewrite a DNA sequence rely on a different repair pathway that can insert a new sequence — a process that occurs at a much lower frequency than the error-prone stitching. “Everyone says the future is editing many genes at a time, and I think: ‘We can’t even do one now with reasonable efficiency’,” says plant scientist Daniel Voytas of the University of Minnesota in Saint Paul.

But developments in the past few months have given Voytas hope. In April, researchers announced that they had disabled Cas9 and tethered to it an enzyme that converts one DNA letter to another. The disabled Cas9 still targeted the sequence dictated by its guide RNA, but could not cut: instead the attached enzyme switched the DNA letters, ultimately yielding a T where once there was a C⁷. A paper published in Science last week reports similar results⁸.

Voytas and others are hopeful that tethering other enzymes to the disabled Cas9 will allow different sequence changes.

Pursuing Argonautes

In May, a paper in Nature Biotechnology⁹ unveiled an entirely new gene-editing system. Researchers claimed that they could use a protein called NgAgo to slice DNA at a predetermined site without needing a guide RNA or a specific neighbouring genome sequence. Instead, the protein — which is made by a bacterium — is programmed using a short DNA sequence that corresponds to the target area.

The finding kicked off a wave of excitement and speculation that CRISPR–Cas9 would be unseated, but laboratories have so far failed to reproduce the results. Even so, there is still hope that proteins from the family that NgAgo belongs to — known as Ago or Argonautes — made by other bacteria could provide a way forward, says genome engineer Jin-Soo Kim at the Institute for Basic Science in Seoul.

Programming enzymes

Other gene-editing systems are also in the pipeline, although some have lingered there for years. For an extensive project that aimed to edit genes in bacteria, Church’s lab did not reach for CRISPR at all. Instead, the team relied heavily on a system called lambda Red, which can be programmed to alter DNA sequences without the need for a guide RNA. But despite 13 years of study in Church’s lab, lambda Red works only in bacteria.

Church and Feng Zhang, a bioengineer at the Broad Institute of MIT and Harvard in Cambridge, Massachusetts, say that their labs are also working on developing enzymes called integrases and recombinases for use as gene editors. “By exploring the diversity of enzymes, we can make the genome-editing toolbox even more powerful,” says Zhang. “We have to continue to explore the unknown.”

ITALIANO

Nonostante i successi ottenuti in questi anni, la popolare tecnica di editing genetico ha alcune limitazioni che hanno indotto i ricercatori a cercare alternative ancora più flessibili per intervenire sul genoma. Lo strumento CRISPR-Cas9 consente agli scienziati di modificare il genoma praticamente a volontà. Salutato come molto più semplice, economico e versatile delle tecnologie precedenti, si è diffuso nei laboratori di tutto il mondo, trovando nuove applicazioni nel campo della medicina e della ricerca di base.

Ma, con tutto il rispetto dovuto, anche CRISPR-Cas9 ha i suoi limiti. E' eccellente per raggiungere una particolare posizione sul genoma e tagliarlo proprio lì, dice Prashant Mali bioingegnere all'Università della California a San Diego. "Ma a volte l'applicazione di interesse richiede  qualcosa di più."

L'entusiasmo con cui all'inizio di quest'anno i ricercatori si sono rivolti a un possibile nuovo sistema di editing genetico, chiamato NgAgo, rivela un sottofondo di frustrazione nel lavoro con CRISPR-Cas9, e una spinta a trovare un'alternativa. "Ci ricorda quanto sia fragile ogni nuova tecnologia", dice George Church, genetista alla Harvard Medical School di Boston, Massachusetts. NgAgo non è che una libreria di strumenti di editing genetico, che è in continuo ampliamento. Alcuni sono variazioni sul tema CRISPR; altri offrono nuovi modi per modificare i genomi.

Mini-me
Un giorno CRISPR-Cas9 potrebbe  essere usato per riscrivere i geni responsabili di malattie genetiche. Ma i componenti del sistema - un enzima chiamato Cas9 e un filamento di RNA per dirigere l'enzima fino alla sequenza desiderata - sono troppo grandi per essere stipati nel genoma del virus più comunemente usato nella terapia genica come veicolo di materiale genetico estraneo nelle cellule umane.

Una soluzione è il ricorso a un mini-Cas9, ricavato dal batterioStaphylococcus aureus. È abbastanza piccolo per essere inserito nel virus usato in una delle terapie geniche attualmente 

disponibili. Lo scorso dicembre, due gruppi hanno usato un Mini-Me Cas9 nei topi per correggere il gene responsabile della distrofia muscolare di Duchenne.

Espandere la portata
Cas9 non è però in grado di tagliare tutto ciò verso cui è indirizzato: perché ciò accada deve trovarsi nelle vicinanze di una certa sequenza di DNA. In molti genomi questa esigenza è soddisfatta facilmente, ma per alcuni esperimenti può essere una grave limitazione. I ricercatori stanno cercando microbi che forniscano enzimi che richiedono una sequenza diversa, in modo da espandere il numero di sequenze che possono essere modificate.

Uno degli enzimi esaminati, chiamato Cpf1, può diventare un'alternativa interessante. Più piccolo di Cas9, il tipo di sequenza che richiede è diverso, ed è altamente specifico.

Un altro enzima, chiamato C2c2, si rivolge all'RNA invece che al DNA, una caratteristica potenzialmente utile per lo studio dell'RNA e per la lotta contro i virus con genoma a RNA.

I veri "redattori"
Molti laboratori utilizzano CRISPR-Cas9 solo per eliminare sezioni di un gene, in modo da bloccarne la funzione. "Molti considerano questa modificazione una vittoria", dice Church. "Ma bruciando una pagina del libro non si sta modificando il libro."

Chi vuole cambiare una sequenza in un'altra si trova a fronteggiare un compito più difficile. Quando Cas9 taglia il DNA, spesso la cellula produce degli errori nel ricucire le estremità rotte, determinando l'eliminazione del gene che molti ricercatori desiderano.

Ma i ricercatori che vogliono riscrivere una sequenza di DNA fanno riferimento a un diverso percorso di riparazione che può inserire una nuova sequenza, un processo che si verifica con una frequenza molto inferiore a quella della ricucitura con errori. "Tutti dicono che il futuro sta nella modificazione di molti geni in una volta sola, ma io penso: attualmente non riusciamo a farlo con efficienza ragionevole nemmeno per un solo gene", dice Daniel Voytas, biologo vegetale all'Università del Minnesota a Saint Paul.

Ma gli sviluppi degli ultimi mesi hanno ridato speranza a Voytas. In aprile alcuni ricercatori hanno  annunciato di aver disattivato Cas9 e di averlo legato a un enzima che converte una lettera del DNA in un'altra. L'enzima Cas9 disattivato continua a dirigersi verso la sequenza definita dal suo RNA guida, ma non lo taglia: invece, l'enzima allegato cambia le lettere di DNA, inserendo una T dove prima c'era una C. Un articolo pubblicato su "Science" ai primi di agosto riferisce resulti simili. Voytas e altri sono fiduciosi che l'aggancio di altri enzimi al Cas9 disabilitato permetterà di realizzare diverse variazioni nelle sequenze.

Sulla strada degli Argonauti
In maggio, un articolo su "Nature Biotechnology" ha svelato un sistema di editing genetico completamente nuovo. Secondo i ricercatori si potrebbe usare una proteina chiamata NgAgo per tagliare il DNA in un sito predeterminato senza bisogno di un RNA guida o di una specifica sequenza del genoma vicina. La proteina - che è prodotta da un batterio - è stata programmata con una breve sequenza di DNA che corrisponde alla zona di destinazione.

La scoperta ha sollevato un'ondata di entusiamo e di speculazioni sulla possibilà che CRISPR-Cas9 venga spodestato, ma finora i laboratori non sono riusciti a riprodurre quei risultati. Ciò nonostante è ancora viva la speranza che le proteine della famiglia a cui appartiene NgAgo - conosciuto come Ago, o Argonautes - che sono prodotte da altri batteri possano fornire una nuova spinta in avanti, dice Jin-Soo Kim, esperto di ingegneria genetica all'Institute for Basic Science a Seul.

Programmare gli enzimi
In cantiere ci sono anche altri sistemi di editing genetico, anche se alcuni di essi ristagnano da anni. Per un vasto progetto di modificazione dei geni nei batteri, il laboratorio di Church non ha guardato a CRISPR ma a un sistema chiamato Lambda Red, che può essere programmato per alterare le sequenze di DNA senza la necessità di un RNA guida. Tuttavia, a dispetto dei 13 anni in cui è stato studiato nel laboratorio di Church, Lambda Red funziona solo nei batteri.

Church e Feng Zhang, bioingegnere al Broad Institute del MIT e della Harvard University, dicono che i loro laboratori stanno lavorando anche allo sviluppo di enzimi chiamati integrasi e ricombinasi per usarli nell'editing genetico. "Esplorando la diversità degli enzimi, possiamo mettere a punto una cassetta degli attrezzi per l'editing genetico ancora più potente", dice Zhang. "Dobbiamo continuare a esplorare l'ignoto."

Da:

http://www.nature.com/news/beyond-crispr-a-guide-to-the-many-other-ways-to-edit-a-genome-1.20388

http://www.lescienze.it/news/2016/08/17/news/non_solo_crispr_i_molti_modi_per_modificare_un_genoma-3200261/