Elementi di base del Citofluorimetro e della Citometria a flusso / Basic elements of the Flow Cytometer and and Flow Cytometry.

Elementi di base del Citofluorimetro e della Citometria a flusso. Il procedimento del brevetto ENEA RM2012A000637 potrebbe migliorare tantissimo le applicazioni di questa tecnica.  / Basic elements of the  Flow Cytometer and  and Flow Cytometry. The process of the patent ENEA RM2012A000637 could greatly improve the applications of this technique.

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Rappresenta un’evoluzione del microscopio. È una tecnica che permette il trasporto (flusso) di cellule incolonnate davanti ad un raggio luminoso. Vari rilevatori poi strategicamente posizionati capteranno la luce diffusa dalla cellula in transito. Simultaneamente è in grado di rilevare la fluorescenza qualora questa fosse presente nel campione. Quindi essenzialmente è un sistema che si basa su due principi:

1. Diffusione: Con vari rilevatori posti ad angoli diversi (solitamente uno a piccolo angolo circa 1°, ed uno a circa 90°);
2. Fluorescenza: Rilevazione della fluorescenza emessa da campioni trattati con molecole fluorescenti;

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Solitamente la luce che colpisce l’oggetto (in questo caso la cellula in transito), ha destini diversi, infatti una parte viene assorbita dal corpo e trasformata in calore, una parte viene diffusa e una parte viene trasmessa. La luce diffusa, la sola che viene captata dallo strumento,è influenzata da vari fattori quali le caratteristiche fisiche del campione, il tipo di luce incidente e l’angolo di analisi.

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È una tecnica multiparametrica che ci fornisce dunque per ogni campione, per ogni singola cellula numerosi dati (vitalità, dimensioni, complessità, fenotipo, ecc…). Le varie popolazioni cellulari vengono analizzate cellula per cellula. Per fare questo le cellule che compongono il campione vengono ordinate in fila indiana e fatte passare una per volta davanti la fonte luminosa. Ogni cellula quindi darà informazioni sulla propria natura e ogni singolo dato potrà essere interpolato in grafici con quelli derivanti da altre cellule.

Per poter incolonnare le cellule in fila indiana viene utilizzato il sistema della Focalizzazione Idrodinamica in cui le cellule vengono inizialmente poste in un liquido isotonico, successivamente verrà creato un flusso, ad una precisa velocità e pressione, che permetterà l’incolonnamento delle cellule. Questa prima fase è la più importante perché cellule che non si incolonnano bene daranno ovviamente dati falsati perché magari saranno troppo vicine e la luce verrà diffusa inevitabilmente in modo diverso, ma lo strumento non riesce a capire se le cellule sono incolonnate bene o male (dipende dall’operatore).

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Una delle principali caratteristiche della citofluorimetria è il fatto che le cellule che vengono analizzate sono cellule in sospensione che vengono fatte passare attraverso una fonte luminosa. Cellule adese non possono essere studiate al citofluorimetro.

La grande varietà di dati deriva da sistemi di rilevamento diversi che sono in grado di darci informazioni diverse che, messe insieme, completano il quadro di analisi. I rilevatori della luce diffusa sono:

1. Forward scatter: è il rilevatore posto di fronte alla sorgente luminosa. È importante sottolineare che la luce captata non è la luce direttamente frontale (altrimenti misureremo la luce trasmessa), ma la luce che viene diffusa ad un angolo di circa 1°. Proprio per eliminare l’interferenza derivante dalla luce trasmessa, sopra il rilevatore è posto un filtro che impedisce alla luce di raggiungerlo. In questo modo solo la luce diffusa verrà rilevata ed analizzata.

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l forward scatter ci dà informazioni circa la grandezza della cellula. Infatti maggiore è la dimensione della cellula che ha attraversato la fonte luminosa e maggiore sarà la luce diffusa frontalmente (a circa 1°), quindi il rilevatore risponderà in maniera diversa in base alla luce che lo colpisce.

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2. Side scatter: è il rilevatore posto a circa 90°. Da informazioni circa la complessità della cellula (numero di organelli, struttura, ecc).

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Scatter plot: Unendo i dati provenienti da foreward scatter e side scatter, possiamo risalire a precise popolazioni cellulari. Lo scatter plot è il grafico ottenuto interpolando i due flussi di dati:

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Il terzo grafico sopra non è altro che la risultante della somma dei due grafici di foreward e side scatter:

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Tutta l’analisi può inoltre essere ampliata utilizzando la fluorescenza. Il citofluorimetro ha infatti sistemi con i quali è in grado di rilevare la presenza di eventuale fluorescenza (previo trattamento delle cellule con sostanze fluorescenti a meno che le cellule analizzate non siano in grado di emettere autonomamente fluorescenza). Quello che ne viene fuori è un diagramma dettagliato della popolazione cellulare che compone il campione.

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3. Rilevamento della fluorescenza: Le cellule possono essere marcate con particolari fluorofori che risponderanno alla luce che le colpisce emettendo fluorescenza. Il citofluorimetro è dotato infatto di una serie di rilevatori per fluorescenza annessi a specchi dicroici che permettono di selezionare una precisa lunghezza d’onda (o una banda di λ). I rilevatori per la fluorescenza si trovano sul versante dello side scatter. Come sempre la fluorescenza sarà direttamente proporzionale alla concentrazione di fluoroforo e quindi (se il legame con il target è avvenuto secondo le modalità stabilite dall’operatore) della struttura target dell’anticorpo marcato con fluoroforo.

3. Rilevamento della fluorescenza: Le cellule possono essere marcate con particolari fluorofori che risponderanno alla luce che le colpisce emettendo fluorescenza. Il citofluorimetro è dotato infatto di una serie di rilevatori per fluorescenza annessi a specchi dicroici che permettono di selezionare una precisa lunghezza d’onda (o una banda di λ). I rilevatori per la fluorescenza si trovano sul versante dello side scatter. Come sempre la fluorescenza sarà direttamente proporzionale alla concentrazione di fluoroforo e quindi (se il legame con il target è avvenuto secondo le modalità stabilite dall’operatore) della struttura target dell’anticorpo marcato con fluoroforo.

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Il fatto che siano presenti diversi rilevatori per diverse fluorescenze a diversa λ ci permette di aumentare il range di analisi. Esempio:

Two color dot plot: è un grafico in cui vengono analizzate varie popolazioni cellulari che rispondono con diverse emissioni di fluorescenza. È essenziale, al fine di evitare falsi positivi, che i picchi di emissione dei fluorofori utilizzati non si sovrappongano. Compito dell’operatore sarà quello di eliminare/minimizzare/interpretare i falsi positivi. Inoltre dovrà stabilire il range di operatività andando a evidenziare una serie di dati ed escludendo i dati che non servono (lo strumento non riconosce tra cellula e detriti cellulari che verranno comunque conteggiati ma devono essere scartati).

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Ogni cellula che passa risponde in modo diverso emettendo fluorescenza ad una determinata λ. In base alla λ rilevata lo strumento collocherà un pallino in un punto del grafico. Ad esempio, nel grafico diviso in 4 quadranti in basso a sx avremo le cellule che non rispondono alla fluorescenza e che quindi non sono state riconosciute dall’anticorpo marcato. In basso a dx avremo quelle cellule che rispondono emettendo fluorescenza sul verde, in alto a sx le cellule che rispondono emettendo fluorescenza nell’arancio, mentre in alto a dx troveremo quelle cellule che hanno legato entrambi gli anticorpi, sia quello che emette nel verde sia quello che emette nell’arancio.

Sorgenti del FACS (citofluorimetro)

Si possono utilizzare molti sorgenti diverse, divisibili in 3 grandi famiglie:

1. Ad ampio spettro;
2. Sintonizzabili;
3. Lunghezze d’onda ben precise (3 diverse lampade). La più utilizzata è in questo caso la lampada a gas Argon che emette a 488nm.

La scelta della sorgente è ovviamente correlata al tipo di campione che si andrà ad analizzare. La lampada ad Argon è la più utilizzata perché possiede una elevata intensità, permette la focalizzazione della radiazione su di una sezione molto ridotta (dimensioni cellulari) e l’eccitazione di numerosi fluorofori.

Camera di flusso

È la porzione che permette l’incolonnamento delle cellule. L’operatore può scegliere la velocità con la quale fare passare le cellule dalla sorgente luminosa.

Filtri

Numerosi filtri possono anche essere usati in combo per permettere una migliore selezione della luce. Abbiamo filtri diversi che selezionano una singola λ o una banda di λ.

Rilevatori

Sono i convertitori del segnale da luminoso ad elettrico. Vengono eccitati dalla luce che li colpisce e grazie ad un fotomoltiplicatore sono in grado di dare risposte ben precise anche a segnali deboli.

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I fototubi sono molto sensibili e vengono posizionati laddove la luce arriva con meno intensità, mentre i fotodiodi sono meno efficienti e quindi vengono posizionati laddove la luce arriva con intensità più alta (frontalmente alla sorgente luminosa).

ENGLISH

It represents an evolution of the microscope. It is a technique that allows the transport (flow) of stacked cells in front of a luminous beam. Various sensors then strategically positioned will light the diffused light from the transit cell. At the same time it is able to detect fluorescence if this is present in the sample. So basically it is a system that is based on two principles:

Diffusion: With various detectors placed at different angles (usually one at a small angle about 1 °, and one at about 90 °);

Fluorescence: Detection of fluorescence emitted by samples treated with fluorescence molecules;

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Usually the light striking the object (in this case the cell in transit) has different destiny, in fact, one part is absorbed by the body and transformed into heat, one part is diffused and one part is transmitted. The diffused light, the only one captured by the instrument, is influenced by various factors such as the physical characteristics of the sample, the type of incident light and the angle of analysis.

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It is a multiparametric technique that gives us, for each sample, a large number of data (vitality, size, complexity, phenotype, etc.) for each single cell. The various cellular populations are analyzed per cell cell. To do this, the cells that make up the sample are sorted in an Indian row and passed one at a time in front of the light source. Each cell then will give information about its nature and each single data can be interpolated in graphs with those derived from other cells.

In order to be able to colonize the cells in an Indian row, the Hydrodynamic Focalization System is used where the cells are initially placed in an isotonic liquid, and then a flow is created at a precise rate and pressure that will allow the cells to collapse. This first phase is the most important because cells that do not clone well will obviously give false data because they may be too close and the light will inevitably diffuse in a different way, but the instrument fails to figure out whether the cells are stacked properly or badly (depending operator).

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One of the main features of cytofluorometry is the fact that the cells being analyzed are suspended cells that are passed through a light source. Adhesive cells can not be studied at the cytofluorometer.

The great variety of data comes from different detection systems that are able to give us different information that, together, complete the analysis framework. The diffused light detectors are:

Forward scatter: the detector is placed in front of the light source. It is important to emphasize that the captured light is not the direct frontal light (otherwise we will measure the transmitted light), but the light that is diffused at an angle of about 1 °. Just to eliminate the interference from the transmitted light, a filter is placed above the detector, which prevents the light from reaching it. In this way only the diffused light will be detected and analyzed.

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The forward scatter gives us information about the size of the cell. In fact, the size of the cell that has crossed the light source is greater, and the diffused light will be frontally (about 1 °), so the detector will respond differently depending on the light that hits it.

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Side scatter: The detector is placed at about 90 °. From information about cell complexity (number of organelles, structure, etc.).

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Scatter plot: By combining data from foreward scatter and side scatter, we can trace to precise cellular populations. The scatter plot is the graph obtained by interpolating the two data streams:

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The third graph above is nothing more than the result of the sum of the two foreward and side scatter charts:

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All analysis can also be expanded using fluorescence. The citofluorimeter has systems with which it is able to detect the presence of any fluorescence (after treatment of cells with fluorescent substances unless the cells analyzed are able to independently emit fluorescence). What comes out is a detailed diagram of the cellular population that makes up the sample.

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Detection of Fluorescence: Cells can be labeled with particular fluorophores that will respond to the light that strikes them by emitting fluorescence. The citofluorimeter is equipped with a series of fluorescence detectors attached to dichroic mirrors that allow you to select a precise wavelength (or bandwidth of λ). The fluorescence detectors are located on the side of the side scatter. As always, the fluorescence will be directly proportional to the fluorophorus concentration and hence (if the binding with the target occurred according to the modes established by the operator) of the target structure of the fluorophorous-labeled antibody.

Detection of Fluorescence: Cells can be labeled with particular fluorophores that will respond to the light that strikes them by emitting fluorescence. The citofluorimeter is equipped with a series of fluorescence detectors attached to dichroic mirrors that allow you to select a precise wavelength (or bandwidth of λ). The fluorescence detectors are located on the side of the side scatter. As always, the fluorescence will be directly proportional to the fluorophorus concentration and hence (if the binding with the target occurred according to the modes established by the operator) of the target structure of the fluorophorous-labeled antibody.

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The fact that different detectors are present for different fluorescents at different λ allows us to increase the range of analyzes. Example:

Two color dot plot: This is a graph in which various cellular populations that respond with different fluorescence emissions are analyzed. It is essential, in order to avoid false positives, that the emission peaks of the fluorophors used do not overlap. The task of the operator will be to eliminate / minimize / interpret the false positives. It will also have to set the operating range by highlighting a number of data and excluding the data that they do not need (the cellular and cellular debris tool will not be counted but will be discarded).

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Each passing cell responds differently emitting fluorescence to a given λ. Depending on the detected λ, the instrument will place a dot at a point in the chart. For example, in the chart divided into 4 quadrants at bottom of the xx we will have the cells that do not respond to the fluorescence and therefore have not been recognized by the marked antibody. At the bottom of dx we will have those cells responding by emitting fluorescence on green, high at sx the cells responding by emitting fluorescence in the orange, while at the top of dx we will find those cells that have bound both antibodies, both that emitted in green What he emits in the orange.

FACS sources (citofluorimeter)

You can use many different sources, which can be divided into 3 large families:

Broad spectrum;

tunable;

Wide wavelengths (3 different lamps). The most used is in this case the argon gas lamp that emits at 488nm.

Choosing the source is obviously related to the type of sample that will be analyzed. The Argon lamp is the most used because it possesses a high intensity, allows the focusing of radiation on a very small section (cellular size) and the excitation of many fluorophores.

Flow Room

It is the portion that allows the cells to collapse. The operator can choose the speed with which to pass the cells from the light source.

filters

Numerous filters can also be used in combo to allow better light selection. We have different filters that select a single λ or a λ band.

Detectors

Signal converters from light to electric. They are excited by the light that strikes them and thanks to a photomultiplier they are able to give precise answers even to weak signals.

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Phototypes are very sensitive and are positioned where light comes with less intensity, while photodiodes are less efficient and are positioned where light arrives at higher intensity (front of the light source).

Da:

https://www.medicinadilaboratorio.it/citofluorimetro-citometria-a-flusso/

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