New technique could help scientists create a gene in just 1 day / Una nuova tecnica potrebbe aiutare gli scienziati a creare un gene in appena 1 giorno

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

DNA-writing enzymes could revolutionize synthetic biology and data storage.

 / Gli enzimi di scrittura del DNA potrebbero rivoluzionare la biologia sintetica e l'archiviazione dei dati.

EDUARDO DE UGARTE/BERKELEY LAB CREATIVE SERVICES

Creating a new gene in a single day could soon be possible, thanks to a new technique that mimics the way the body copies its own DNA. Though the technology needs to clear a few more hurdles, it could one day let researchers speedily rewrite microbe genes, enabling them to synthesize new medicines and fuels on the fly.

“It’s the future,” says George Church, a geneticist at Harvard University who has pioneered numerous technologies to read and write DNA for synthetic biology. “This is going to be enormous.”

Researchers have been able to make DNA since the 1970s. The traditional approach takes DNA nucleotides—the chemical letters A, G, C, and T—and adds them, one by one, to a growing chain called an oligonucleotide, or oligo. But the process, which uses a series of toxic organic reagents, is typically slow and error-prone, limiting oligos to about 200 letters—a tiny fraction of the thousands of letters that make up most genes.

Our cells make DNA differently. A variety of enzymes called polymerases read a single strand of DNA and then synthesize a complementary strand that binds to it. That has prompted dreams of re-engineering polymerases to write new DNA.

Over the decades, most researchers have settled on one particular polymerase, called terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT), because, unlike other polymerases, it can attach new nucleotides to an oligo strand without following a DNA template strand. Natural TdT does this to write millions of new variations of genes for antibodies, which the immune system can then select from to target invaders. But the natural enzyme adds new DNA letters randomly, rather than controlling the precise sequence of letters as researchers want to do.

Scientists have tried for years to make TdT add one nucleotide at a time and stop, before repeating the process with a different nucleotide, says Sebastian Palluk, a Ph.D. student who worked on the project in chemist Jay Keasling’s lab at the Lawrence Berkeley National Laboratory in California. They started by adding chemical groups to DNA’s four bases that act as “stop” signals. So, when TdT adds a modified A to an oligo of any length, it would be prevented from adding the next base. The oglio is then fished out, washed, and treated with another compound to cut off the blocking group, readying it for the next extension.

But TdT doesn’t work well with these modified nucleotides. “TdT is very picky,” Palluk says. One such system, for example, required about an hour to add each modified base, far too slow to be practical.

Palluk says he also tried to make this approach work. “I went down that route for 2 years,” he says. But he got to talking with Daniel Arlow, a fellow Ph.D. student in Keasling’s lab who was also trying to use enzymes to synthesize DNA. Eventually, the pair settled on a novel approach. They start with four separate pools for the four separate bases, each one with copies of TdT tethered to either A, G, C, or T. To grow their oligo, they add a base from one of the pools. After TdT adds the base to the end of the oligo, it remains tethered, blocking any additional copies of the enzyme from reacting with the oligo and extending it further. The now oligos are then fished out, and the tethers are snipped off. The free TdT is washed away, and the oligo is ready for the next base to be added.

Ultimately, the approach should be cheap, Keasling says, because TdT is easy to manufacture in bacteria and yeast. It’s also fast. Most new nucleotides attach to the growing oligo in 10 to 20 seconds, Palluk, Arlow, Keasling, and their colleagues report today in Nature Biotechnology. For now, the tether snipping step still takes a minute. So synthesizing a whole gene will still likely take the better part of a day.

Church says the new approach is not quite ready to dethrone conventional DNA synthesis. So far, the group has made oligos only 10 bases long. And there are still a few writing problems, as the approach was only 98% accurate at writing DNA in the desired sequence, below the 99% accuracy of the traditional approach. “It’s cool for a first demonstration,” Palluk says. “But it’s not quite there yet.”

In order to write oligos up to 1000 bases long, the approach will likely need to be 99.9% accurate. If it gets there, Church says it could help revolutionize not just synthetic biology’s efforts to write and test new genes, but also enable efforts to write massive libraries of data in DNA to create a compact archive the firehoses of information coming from giant science projects such as astronomy surveys, which could then be fished out and read out later.

ITALIANO

Creare un nuovo gene in un solo giorno potrebbe essere presto possibile, grazie a una nuova tecnica che imita il modo in cui il corpo copia il proprio DNA. Sebbene la tecnologia debba chiarire qualche ostacolo in più, potrebbe un giorno consentire ai ricercatori di riscrivere rapidamente i geni microbici, consentendo loro di sintetizzare nuovi farmaci al volo.

"È il futuro", afferma George Church, un genetista dell'Università di Harvard che ha aperto la strada a numerose tecnologie per leggere e scrivere DNA per la biologia sintetica. "Questo sarà enorme".

I ricercatori sono stati in grado di creare DNA sin dagli anni '70. L'approccio tradizionale prende i nucleotidi del DNA - le lettere chimiche A, G, C e T - e li aggiunge, uno per uno, a una catena in crescita chiamata oligonucleotide o oligo. Ma il processo, che utilizza una serie di reagenti organici tossici, è in genere lento e soggetto a errori, limitando gli oligo a circa 200 lettere, una piccola parte delle migliaia di lettere che costituiscono la maggior parte dei geni.

Le nostre cellule rendono il DNA in modo diverso. Una varietà di enzimi chiamati polimerasi leggono un singolo filamento di DNA e quindi sintetizzano un filamento complementare che si lega ad esso. Ciò ha spinto i sogni di reingegnerizzare le polimerasi per scrivere nuovo DNA.

Nel corso dei decenni, la maggior parte dei ricercatori si è basata su una particolare polimerasi, chiamata deossinucleotidil transferasi terminale (TdT), perché, a differenza di altre polimerasi, può attaccare nuovi nucleotidi a un filo di oligo senza seguire un filamento di DNA. Natural TdT fa questo per scrivere milioni di nuove varianti di geni per gli anticorpi, che il sistema immunitario può quindi selezionare per indirizzare gli invasori. Ma l'enzima naturale aggiunge nuove lettere di DNA in modo casuale, piuttosto che controllare la sequenza precisa di lettere come i ricercatori vogliono fare.

Gli scienziati hanno cercato per anni di produrre TdT aggiungendo un nucleotide alla volta e fermandosi, prima di ripetere il processo con un diverso nucleotide, dice Sebastian Palluk, un dottorato di ricerca. studente che ha lavorato al progetto nel laboratorio del chimico Jay Keasling presso il Lawrence Berkeley National Laboratory in California. Hanno iniziato aggiungendo gruppi chimici alle quattro basi del DNA che fungono da segnali di "stop". Quindi, quando TdT aggiunge una A modificata ad un oligo di qualsiasi lunghezza, sarebbe impedito di aggiungere la base successiva. L'oligo viene quindi ripescato, lavato e trattato con un altro composto per tagliare il gruppo di blocco, preparandolo per la prossima estensione.

Ma TdT non funziona bene con questi nucleotidi modificati. "TdT è molto esigente", afferma Palluk. Uno di questi sistemi, ad esempio, richiedeva circa un'ora per aggiungere ogni base modificata, troppo lentamente per essere pratica.

Palluk dice che ha anche provato a far funzionare questo approccio. "Sono andato su quella strada per 2 anni", dice. Ma ha avuto modo di parlare con Daniel Arlow, un collega di dottorato. studente nel laboratorio di Keasling che stava anche cercando di usare gli enzimi per sintetizzare il DNA. Alla fine, la coppia optò per un nuovo approccio. Iniziano con quattro contenitori separati per le quattro basi separate, ciascuna con copie di TdT legate a A, G, C o T. Per far crescere il loro oligo, aggiungono una base da uno dei contenitori. Dopo che TdT aggiunge la base all'estremità dell'oligo, rimane legato, bloccando qualsiasi copia aggiuntiva dell'enzima dalla reazione con l'oligo e estendendolo ulteriormente. Gli ora oligos vengono quindi pescati e le corde vengono tagliate. Il TdT libero viene lavato via e l'oligo è pronto per la prossima base da aggiungere.

In definitiva, l'approccio dovrebbe essere economico, dice Keasling, perché TdT è facile da fabbricare in batteri e lieviti. È anche veloce. La maggior parte dei nuovi nucleotidi si lega all'oligo in crescita in 10-20 secondi, Palluk, Arlow, Keasling e i loro colleghi riportano oggi in Nature Biotechnology. Per ora, il passaggio per il tethering richiede ancora un minuto. Quindi sintetizzare un intero gene richiederà probabilmente la parte migliore di un giorno.

Church afferma che il nuovo approccio non è ancora pronto a detronizzare la sintesi convenzionale del DNA. Finora, il gruppo ha fatto oligos solo con 10 basi. E ci sono ancora alcuni problemi di scrittura, poiché l'approccio era solo del 98% accurato nello scrivere DNA nella sequenza desiderata, al di sotto dell'accuratezza del 99% dell'approccio tradizionale. "È bello per una prima dimostrazione", afferma Palluk. "Ma non è ancora abbastanza.presto"

Per scrivere oligos fino a 1000 basi, l'approccio dovrà probabilmente essere accurato al 99,9%. Se arriva lì, Church dice che potrebbe aiutare a rivoluzionare non solo gli sforzi della biologia sintetica per scrivere e testare nuovi geni, ma anche gli sforzi per scrivere enormi librerie di dati nel DNA per creare un archivio compatto le firme di informazioni provenienti da progetti scientifici giganti come come indagini sull'astronomia, che potrebbero poi essere ripescate e lette in seguito.

Da:

http://www.sciencemag.org/news/2018/06/new-technique-could-help-scientists-create-gene-just-1-day?utm_campaign=news_daily_2018-06-18&et_rid=344224141&et_cid=2122885