Un nuovo metodo per produrre DNA artificiale / A new method to produce artificial DNA

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Un gruppo dell'Università di Berkeley ha ideato un nuovo metodo per sintetizzare sequenze di DNA. Basato su un enzima naturale, il metodo, una volta perfezionato, potrebbe superare le limitazioni del metodo attuale, che è molto costoso e poco affidabile quando si superano le 200 coppie di basi.

Nel tumultuoso progresso delle ricerche in campo biomedicale, c’è un processo che è rimasto pressoché inalterato per 40 anni: la produzione di DNA artificiale.

Ora un gruppo del Lawrence Berkeley National Laboratory (Berkeley Lab), in California, ha annunciato la messa a punto di una nuova metodica, descritta sulle pagine di “Nature Biotechnology”, per generare sequenze di DNA più rapidamente, con maggiore accuratezza e a costi inferiori rispetto a quella usata finora, il cosiddetto metodo Caruthers.

Una molecola di DNA può essere immaginata come una scala di corda con pioli rigidi, formata da unità elementari, chiamate nucleotidi. Ogni nucleotide è formato dallo zucchero desossiribosio (da cui acido desossiribolucleico, nome completo del DNA), da un gruppo fosfato e da una base azotata, che può essere solo di quattro tipi: adenina, citosina, guanina e timina.

Nel modello della scala, le corde laterali sono formate dagli zuccheri e dai gruppi fosfato e ogni piolo è formato da una coppia di basi azotate legate tra loro in un unico modo: adenina-timina oppure guanina-citosina. Non sono possibili altri appaiamenti.

Per ottenere un gene, cioè una sequenza di coppie di basi in grado di conservare l’informazione necessaria per la sintesi di una proteina, bisogna collegare migliaia di questi gradini. Per farlo, le strade sono due: prelevare un gene da un organismo vivente, oppure farlo sintetizzare da un’azienda specializzata.

“In questo secondo caso, si va su un sito Internet e si ordinare la sequenza: la consegna avviene in due settimane circa”, spiega Daniel Arlow, che ha partecipato allo studio. "Al costo di circa 300 dollari a gene, una ricerca su migliaia di geni può costare molto cara”.

Il metodo Caruthers 

sfrutta i principi della chimica organica per legare tra loro le unità elementari del DNA, una alla volta. Rimasto per decenni lo standard di riferimento in tutto il mondo, ha un inconveniente importante perché ha un limite di 200 coppie di basi, oltre il quale non è più affidabile e può produrre sequenze errate.

Considerando i problemi di lunghezza delle sequenze e gli alti costi, i ricercatori del Berkeley Lab hanno pensato di progettare un nuovo metodo di sintesi basato su un enzima chiamato transferasi terminale deossinucleotidica (terminal deoxynucleotidyl transferase, TDT), che si trova nel sistema immunitario dei vertebrati ed è uno dei pochi enzimi in natura che “scrive” nuovo DNA senza bisogno di copiarlo da altre sequenze dello stesso tipo. Inoltre, è anche molto rapido perché mette in fila circa 200 nucleotidi al minuto. 

Il problema è che per sfruttare il TdT occorre forzarlo ad aggiungere un solo nucleotide e poi a fermarsi, altrimenti continuerebbe ad aggiungere sequenze ripetute dello stesso nucleotide.

Gli autori ci sono riusciti legando un nucleotide a ogni enzima TdT un collegamento sacrificabile, che si perde una volta che il nucleotide in questione viene aggiunto alla sequenza. In questo modo, l’enzima viene rimosso non appena completata l’operazione e il processo può continuare con un altro nucleotide fissato a un altro enzima TdT.

Keasling e colleghi hanno dimostrato il metodo producendo manualmente una sequenza di 10 basi. La strada per ottimizzare il processo e arrivare alle applicazioni è ancora lunga, ma i ricercatori sono fiduciosi che alla fine riusciranno a produrre un gene di 1000 basi in un colpo solo, alla velocità del metodo chimico.

ENGLISH

A group from the University of Berkeley has devised a new method to synthesize DNA sequences. Based on a natural enzyme, the method, once perfected, could overcome the limitations of the current method, which is very expensive and unreliable when exceeding 200 base pairs.

In the tumultuous progress of research in the biomedical field, there is a process that has remained almost unchanged for 40 years: the production of artificial DNA.

Now a group of the Lawrence Berkeley National Laboratory (Berkeley Lab), in California, has announced the development of a new method, described on the pages of "Nature Biotechnology", to generate DNA sequences faster, with greater accuracy and at lower costs. compared to the one used so far, the so-called Caruthers method.

A DNA molecule can be imagined as a rope ladder with rigid pegs, formed of elementary units, called nucleotides. Each nucleotide is made from deoxyribose sugar (from which deoxyribolyucleic acid, complete name of DNA), from a phosphate group and from a nitrogenous base, which can only be of four types: adenine, cytosine, guanine and thymine.

In the scale model, the lateral cords are formed by sugars and phosphate groups and each peg is formed by a pair of nitrogenous bases linked together in a single way: adenine-thymine or guanine-cytosine. No other pairing is possible.

To obtain a gene, that is a sequence of pairs of bases able to preserve the information necessary for the synthesis of a protein, it is necessary to connect thousands of these steps. To do this, there are two ways: take a gene from a living organism, or let it be synthesized by a specialized company.

"In this second case, we go to an Internet site and order the sequence: delivery takes about two weeks", explains Daniel Arlow, who took part in the study. "At a cost of about $ 300 a gene, research into thousands of genes can cost a lot of money."

The Caruthers method exploits the principles of organic chemistry to bind together the elementary units of DNA, one at a time. It has remained the reference standard all over the world for decades, it has an important drawback because it has a limit of 200 base pairs, beyond which it is no longer reliable and can produce incorrect sequences.

Considering the problems of length of the sequences and the high costs, the researchers of the Berkeley Lab have decided to design a new method of synthesis based on an enzyme called terminal deoxynucleotide transferase (terminal deoxynucleotidyl transferase, TDT), which is found in the immune system of vertebrates and is one of the few enzymes in nature that "writes" new DNA without needing to copy it from other sequences of the same type. In addition, it is also very fast because it lines up around 200 nucleotides per minute.

The problem is that to exploit the TdT it is necessary to force it to add a single nucleotide and then to stop, otherwise it would continue to add repeated sequences of the same nucleotide.

The authors succeeded by binding a nucleotide to each TdT enzyme a sacrificable link, which is lost once the nucleotide in question is added to the sequence. In this way, the enzyme is removed as soon as the operation is completed and the process can continue with another nucleotide fixed to another TdT enzyme.

Keasling and colleagues demonstrated the method by manually producing a sequence of 10 bases. The way to optimize the process and get to applications is still long, but the researchers are confident that eventually they will be able to produce a gene of 1000 bases in one go, at the speed of the chemical method.

Da:

http://www.lescienze.it/news/2018/06/19/news/nuovo_metodo_dna_artificale-4020736/?ref=nl-Le-Scienze_22-06-2018