Novel Imaging Technique Enables A Closer Look at Individual Synaptic Proteins. / La nuova tecnica di imaging consente uno sguardo più attento alle singole proteine sinaptiche.
Novel Imaging Technique Enables A Closer Look at Individual Synaptic Proteins. The process of the ENEA RM2012A000637 patent is very useful in this application. / La nuova tecnica di imaging consente uno sguardo più attento alle singole proteine sinaptiche. Il procedimento del brevetto ENEA RM2012A000637 è molto utile in questa applicazione.
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
MIT engineers have developed a technique that allows them to rapidly image many different proteins within a synapse. At bottom right is a composite of the other images. / Gli ingegneri del MIT hanno sviluppato una tecnica che consente loro di rappresentare rapidamente molte proteine diverse all'interno di una sinapsi. In basso a destra è un composito delle altre immagini. Credit: Syuan-Ming Guo and Li Li.
Good neighbors become good friends
Quickly dashing off to work in a bid to avoid the obligatory "morning" conversation with your neighbors might be your style, but in the brain, it's a totally different story. Neighboring neurons in the brain talk – a lot. They communicate day and night via electrical and chemical signals that are sent across synapses.
To enable this communication, the synapse is filled with a whole host of molecular machinery, including proteins. Many of these proteins form synaptic scaffolds that are implicated in the secretion of neurotransmitters and the processing of signals. When proteins go awry, we often see impaired communication in the brain, which can result in conditions such as autism or schizophrenia. Therefore, it is important for scientists to characterize the proteins and understand their healthy physiological functions, in order to decipher exactly what goes wrong in diseased states.
Proteins in high resolution
Researchers at the Massachusetts Institute of Technology, in collaboration with the Broad Institute of Harvard, have devised a novel approach to rapidly image the synaptic proteins at high resolution, using a multiplexed imaging approach.
The research is led by Mark Bathe, a professor of biological engineering at MIT, and Jeff Cottrell, director of translational research at the Stanley Center for Psychiatric Research at the Broad Institute. Their results are published in the journal Nature Communications.
"Multiplexed imaging is important because there's so much variability between synapses and cells, even within the same brain," says Bathe. "You really need to look simultaneously at proteins in the sample to understand what subpopulations of different synapses look like, discover new types of synapses, and understand how genetic variations impact them."
Labeling proteins with DNA
Due to the vast array of proteins that reside in the synapse, conventional fluorescence microscopy has limited applications; at most, it can only image four proteins at a time. This makes for a slow and tedious imaging process that can halt research.
The MIT team have developed a novel technique that is based on an existing method, DNA PAINT, originally created by Ralf Jungman of the Max Planck Institute of Biochemistry. In DNA PAINT, scientists attach a DNA-antibody probe to the proteins of interest, effectively "labeling" the protein. They then image the proteins by delivering a fluorescent DNA "oligo" that binds with the DNA-antibody probes.
The DNA strands have a low affinity for one another, and so they bind and unbind, which creates a blink of fluorescence that can be captured using super-resolution microscopy. However, the imaging of each individual protein can take half an hour, a drawback when many proteins in a sample require imaging.
Building on this technique, Bathe altered the DNA-dye imaging probe so that it can bind more tightly to the DNA-antibody, using "locked nucleic acids". The resulting signal is brighter, and so the imaging can be achieved quicker, albeit at a slightly lower resolution. They have named their novel approach, PRISM.
"When we do 12 or 15 colors on a single well of neurons, the whole experiment takes an hour, compared with overnight for the super-resolution equivalent," Bathe says.
Applying this technique, the scientists were able to label 12 proteins in the synapse, including scaffolding proteins and proteins known to mark excitatory and inhibitory synapses. One such protein was shank3, a scaffold protein associated with schizophrenia.
Analyzing proteins in the thousands allowed the scientists to group proteins that tend to associate with each other more than others, providing insight into the heterogeneity of synapses based on the proteins they possess. Further processing of this information offers the potential to classify synapses based on their function.
"Inhibitory and excitatory are the canonical synapse types, but it is speculated that there are numerous different subtypes of synapses, without any real consensus around what those are," Bathe says.
Exploring the effects of tetrodotoxin
Tetrodotoxin (TDX), is a potent neurotoxin that strengthens synaptic connections between neurons. You may be familiar with TDX if you're knowledgeable about puffer fish – they produce it in their liver in quantities that, if consumed by a human, can produce paralysis of the diaphragm and cause suffocation.
Quickly dashing off to work in a bid to avoid the obligatory "morning" conversation with your neighbors might be your style, but in the brain, it's a totally different story. Neighboring neurons in the brain talk – a lot. They communicate day and night via electrical and chemical signals that are sent across synapses.
To enable this communication, the synapse is filled with a whole host of molecular machinery, including proteins. Many of these proteins form synaptic scaffolds that are implicated in the secretion of neurotransmitters and the processing of signals. When proteins go awry, we often see impaired communication in the brain, which can result in conditions such as autism or schizophrenia. Therefore, it is important for scientists to characterize the proteins and understand their healthy physiological functions, in order to decipher exactly what goes wrong in diseased states.
Proteins in high resolution
Researchers at the Massachusetts Institute of Technology, in collaboration with the Broad Institute of Harvard, have devised a novel approach to rapidly image the synaptic proteins at high resolution, using a multiplexed imaging approach.
The research is led by Mark Bathe, a professor of biological engineering at MIT, and Jeff Cottrell, director of translational research at the Stanley Center for Psychiatric Research at the Broad Institute. Their results are published in the journal Nature Communications.
"Multiplexed imaging is important because there's so much variability between synapses and cells, even within the same brain," says Bathe. "You really need to look simultaneously at proteins in the sample to understand what subpopulations of different synapses look like, discover new types of synapses, and understand how genetic variations impact them."
Labeling proteins with DNA
Due to the vast array of proteins that reside in the synapse, conventional fluorescence microscopy has limited applications; at most, it can only image four proteins at a time. This makes for a slow and tedious imaging process that can halt research.
The MIT team have developed a novel technique that is based on an existing method, DNA PAINT, originally created by Ralf Jungman of the Max Planck Institute of Biochemistry. In DNA PAINT, scientists attach a DNA-antibody probe to the proteins of interest, effectively "labeling" the protein. They then image the proteins by delivering a fluorescent DNA "oligo" that binds with the DNA-antibody probes.
The DNA strands have a low affinity for one another, and so they bind and unbind, which creates a blink of fluorescence that can be captured using super-resolution microscopy. However, the imaging of each individual protein can take half an hour, a drawback when many proteins in a sample require imaging.
Building on this technique, Bathe altered the DNA-dye imaging probe so that it can bind more tightly to the DNA-antibody, using "locked nucleic acids". The resulting signal is brighter, and so the imaging can be achieved quicker, albeit at a slightly lower resolution. They have named their novel approach, PRISM.
"When we do 12 or 15 colors on a single well of neurons, the whole experiment takes an hour, compared with overnight for the super-resolution equivalent," Bathe says.
Applying this technique, the scientists were able to label 12 proteins in the synapse, including scaffolding proteins and proteins known to mark excitatory and inhibitory synapses. One such protein was shank3, a scaffold protein associated with schizophrenia.
Analyzing proteins in the thousands allowed the scientists to group proteins that tend to associate with each other more than others, providing insight into the heterogeneity of synapses based on the proteins they possess. Further processing of this information offers the potential to classify synapses based on their function.
"Inhibitory and excitatory are the canonical synapse types, but it is speculated that there are numerous different subtypes of synapses, without any real consensus around what those are," Bathe says.
Exploring the effects of tetrodotoxin
Tetrodotoxin (TDX), is a potent neurotoxin that strengthens synaptic connections between neurons. You may be familiar with TDX if you're knowledgeable about puffer fish – they produce it in their liver in quantities that, if consumed by a human, can produce paralysis of the diaphragm and cause suffocation.
Image credit: Pixabay.In this study, the authors demonstrated that, using their novel technique, they could measure changes in synaptic protein levels post-application of TDX.
"Using conventional immunofluorescence, you can typically extract information from three or four targets within the same sample, but with our technique, we were able to expand that number to 12 different targets within the same sample. We applied this method to examine synaptic remodeling that occurs following treatment with TDX, and our finding corroborated previous work that revealed a coordinated upregulation of synaptic proteins following TDX treatment," says Eric Danielson, an MIT senior postdoc who is an author of the study.
Next steps – exploring disease
Bathe and colleagues now plan to use PRISM to explore how the structure and composition of synapses are directly affected by manipulating genes that are linked with various disorders. Genomic sequencing has provided insight into genetic components of conditions such as autism and schizophrenia – PRISM could take this insight to the next level.
"Understanding how genetic variation impacts neurons' development in the brain, and their synaptic structure and function, is a huge challenge in neuroscience and in understanding how these diseases arise," Bathe concludes.
ITALIANO
I buoni vicini diventano buoni amici
Scappare rapidamente al lavoro nel tentativo di evitare la conversazione "mattutina" obbligatoria con i tuoi vicini potrebbe essere il tuo stile, ma nel cervello, è una storia completamente diversa. Neuroni vicini nel cervello parlano - molto. Comunicano giorno e notte tramite segnali elettrici e chimici che vengono inviati attraverso le sinapsi.
Per abilitare questa comunicazione, la sinapsi è piena di tutta una serie di macchinari molecolari, comprese le proteine. Molte di queste proteine formano impalcature sinaptiche che sono implicate nella secrezione dei neurotrasmettitori e nell'elaborazione dei segnali. Quando le proteine si guastano, spesso vediamo una comunicazione alterata nel cervello, che può provocare condizioni come l'autismo o la schizofrenia. Pertanto, è importante per gli scienziati caratterizzare le proteine e comprenderne le sane funzioni fisiologiche, al fine di decifrare esattamente cosa non va negli stati malati.
Proteine ad alta risoluzione
I ricercatori del Massachusetts Institute of Technology, in collaborazione con il Broad Institute of Harvard, hanno ideato un nuovo approccio per l'immagine rapida delle proteine sinaptiche ad alta risoluzione, utilizzando un approccio di imaging multiplex.
La ricerca è guidata da Mark Bathe, professore di ingegneria biologica presso il MIT, e Jeff Cottrell, direttore della ricerca traslazionale presso lo Stanley Center for Psychiatric Research presso il Broad Institute. I loro risultati sono stati pubblicati sulla rivista Nature Communications.
"L'imaging multiplex è importante perché c'è così tanta variabilità tra sinapsi e cellule, anche all'interno dello stesso cervello", afferma Bathe. "Devi davvero guardare simultaneamente le proteine nel campione per capire che aspetto hanno le sottopopolazioni di diverse sinapsi, scoprire nuovi tipi di sinapsi e capire come le variazioni genetiche incidono su di esse."
Etichettatura delle proteine con DNA
A causa della vasta gamma di proteine che risiedono nella sinapsi, la microscopia a fluorescenza convenzionale ha applicazioni limitate; al massimo, può solo immaginare quattro proteine alla volta. Questo rende il processo di imaging lento e noioso che può fermare la ricerca.
Il gruppo del MIT ha sviluppato una nuova tecnica basata su un metodo esistente, DNA PAINT, originariamente creato da Ralf Jungman del Max Planck Institute of Biochemistry. Nel DNA PAINT, gli scienziati attaccano una sonda DNA-anticorpo alle proteine di interesse, "marcando" efficacemente la proteina. Quindi immaginano le proteine che forniscono un DNA "oligo" fluorescente che si lega alle sonde anticorpo del DNA.
I filamenti di DNA hanno una bassa affinità reciproca e quindi si legano e si sciolgono, il che crea un battito di fluorescenza che può essere catturato mediante microscopia a super risoluzione. Tuttavia, l'imaging di ogni singola proteina può richiedere mezz'ora, un inconveniente quando molte proteine in un campione richiedono l'imaging.
Basandosi su questa tecnica, Bathe ha modificato la sonda di imaging del colorante DNA in modo che possa legarsi più strettamente all'anticorpo DNA, usando "acidi nucleici bloccati". Il segnale risultante è più luminoso e quindi l'imaging può essere ottenuto più rapidamente, sebbene con una risoluzione leggermente inferiore. Hanno chiamato il loro nuovo approccio, PRISM.
"Quando eseguiamo 12 o 15 colori su un singolo pozzo di neuroni, l'intero esperimento impiega un'ora, rispetto alla notte per l'equivalente in super-risoluzione", afferma Bathe.
Applicando questa tecnica, gli scienziati sono stati in grado di etichettare 12 proteine nella sinapsi, comprese le proteine del ponteggio e le proteine note per contrassegnare sinapsi eccitatorie e inibitorie. Una di queste proteine era lo stinco3, una proteina dell'impalcatura associata alla schizofrenia.
L'analisi delle proteine a migliaia ha permesso agli scienziati di raggruppare le proteine che tendono ad associarsi tra loro più delle altre, fornendo informazioni sull'eterogeneità delle sinapsi in base alle proteine che possiedono. L'ulteriore elaborazione di queste informazioni offre il potenziale per classificare le sinapsi in base alla loro funzione.
"Inibitori ed eccitatori sono i tipi di sinapsi canoniche, ma si ipotizza che ci siano numerosi sottotipi di sinapsi diversi, senza alcun reale consenso su ciò che sono", dice Bathe.
Esplorare gli effetti della tetrodotossina
La tetrodotossina (TDX) è una potente neurotossina che rafforza le connessioni sinaptiche tra i neuroni. Potresti avere familiarità con TDX se sei a conoscenza dei pesci palla - lo producono nel loro fegato in quantità che, se consumati da un essere umano, possono produrre paralisi del diaframma e causare soffocamento.
In questo studio, gli autori hanno dimostrato che, usando la loro nuova tecnica, potevano misurare i cambiamenti nei livelli di proteina sinaptica post-applicazione di TDX.
"Usando l'immunofluorescenza convenzionale, in genere è possibile estrarre informazioni da tre o quattro target all'interno dello stesso campione, ma con la nostra tecnica siamo stati in grado di espandere quel numero a 12 target diversi all'interno dello stesso campione. Abbiamo applicato questo metodo per esaminare il rimodellamento sinaptico che si verifica in seguito al trattamento con TDX e la nostra scoperta ha confermato un precedente lavoro che ha rivelato una sovraregolazione coordinata delle proteine sinaptiche a seguito del trattamento con TDX ", afferma Eric Danielson, senior postdoc del MIT che è autore dello studio.
I prossimi passi: esplorare la malattia
Bathe e i colleghi ora intendono utilizzare il PRISM per esplorare come la struttura e la composizione delle sinapsi siano direttamente influenzate dalla manipolazione di geni collegati a vari disturbi. Il sequenziamento genomico ha fornito informazioni sulle componenti genetiche di condizioni come l'autismo e la schizofrenia: il PRISM potrebbe portare questa visione al livello successivo.
"Comprendere in che modo la variazione genetica influisce sullo sviluppo dei neuroni nel cervello e sulla loro struttura e funzione sinaptica è una grande sfida per le neuroscienze e per capire come si presentano queste malattie", conclude Bathe.
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