LAMP assay for detecting SARS-CoV-2 RNA using an absorbance-based colorimetric readout / Test LAMP per rilevare l'RNA di SARS-CoV-2 utilizzando una lettura colorimetrica basata sull'assorbanza

 LAMP assay for detecting SARS-CoV-2 RNA using an absorbance-based colorimetric readout / Test LAMP per rilevare l'RNA di SARS-CoV-2 utilizzando una lettura colorimetrica basata sull'assorbanza

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Introduction 

Rapid molecular diagnostic tests are a central tool to detect and thereby slow down the spread of infectious diseases.

 The SARS-CoV-2 pandemic has prompted international efforts to create and expand on the testing approaches available. 

The reverse transcription loopmediated isothermal amplifi cation (RT-LAMP) assay recognizes the target RNA by several distinct sequences and works to amplify it with high selectivity. 

LAMP assays show comparable sensitivity and specifi city to PCR based methods. 

In contrast to PCR, the LAMP assay is based on a Bst polymerase instead of Taq polymerase. 

The Bst polymerase and its strand displacement activity work optimally at 65 °C meaning that the LAMP assay can be performed under isothermal conditions at 65 °C. 

Since the need for temperature cycles is bypassed, assay runtime is reduced to about 30 min1 and the assay can be run on a plate reader with heating up to 65 °C. 

The LAMP assay as a rapid diagnostic method therefore offers an opportunity to work in high throughput increasing diagnostic capacity as an alternative or addition to PCR techniques.

 Materials & Methods 

FLUOstar® Omega 384 well black, sv, lobase (Greiner, #788096) qPCR Sealer (Greiner, #676040) SARS-CoV-2 

Rapid Colorimetric LAMP Assay Kit incl. pos. control (NEB, #E2019S) RNAse-free equipment Experimental Procedure The FLUOstar Omega was preheated to 65 °C for 2.5 h before the LAMP assay was incubated. 

The pos. control included in the LAMP assay kit (n-gene) was diluted 1:10 in nuclease-free water to a concentration of 100,000 copies/µL.

 The colorimetric LAMP reactions were performed in a fi nal reaction volume of 5 µL. 

The concentrations of the LAMP assay kit components were used according to the manufacturer’s instructions. 

Master mix, primers, guanidine hydrochloride, nucleasefree water and template were premixed, and transferred to a black 384 well plate and centrifuged for 1 min at 400 g. The LAMP assay samples were measured in quadruplicate. 

The samples were distributed over the plate. 

Plates were sealed with a qPCR sealer, and then read on the FLUOstar Omega using the following settings, plate read cycle times are based on a full 384 well plate: Instrument Settings Rev. 03/2021

 Keywords: Real-time, RNA, LAMP, polymerase, nucleic acids, viruses Assay Principle In the LAMP assay, thermophilic Bst polymerase and primer sets, recognize the SARS-CoV-2 nucleic acid sequence at different positions (fig. 1).

 If the target nucleic acid is amplifi ed by the LAMP assay, hydrogen ions are released, consequently shifting sample pH toward the acidic.

 A pH-sensitive dye is included for detection in absorbance mode. 

The amplifi cation is detected as an increase in absorbance OD at 415 nm and a decrease at 560 nm of the pH-sensitive dye.

 In positive samples, this pH-shift is expected to occur within 30 min from the start of the LAMP assay incubation.

Data analysis 

The difference between absorbance at 415 nm and 560 nm (∆OD) was used to analyse the pH-sensitive colour change over the incubation time. 

Time-to-maximum-slope for individual signal curves was calculated to differentiate between the pos. and negative (neg.) controls within the FLUOstar Omega MARS software

Results & Discussion

To assess the amplification of nucleic acids, ∆OD of the pos. and neg. controls were monitored over a period of 60 min. A substantial increase of the ∆OD was observed for the pos. controls at about 18 min after the start of the LAMP assay. 

This increase of the ∆OD in the pos. control occurred comparably across the individual replicate wells and test runs. 

The neg. controls also displayed an increase of ∆OD, however, this change occurred later, and showed a lower slope and higher variation across wells. 

The real-time measurement of the pH-shift over time gives users confidence in the data and is useful when establishing new assays to understand optimal cut off points to differentiate between pos. and neg. samples.

 The spectrometer’s simultaneous detection at 415 nm and 560 nm allows for a cycle time of 2 mins and 13 s per 384 well plate providing frequent time points to be measured. 

The FDA CFR-21 part 11 approved MARS software supplied with the instrument facilitates the automatic calculation of ∆OD and time to max slope allowing users to differentiate between pos. and neg. controls easily. 

Using the LAMP assay on a microplate reader, users are able to test samples in under 40 minutes making this technique highly suitable as a high throughput diagnostic tool. 0,4 0,3 0,2 0,1 0 -0,1 -0,2 65 60 55 50 45 40 35 ∆OD [OD] Temperature [°C] 0 10 20 30 40 50 60 Time [min] Temperature Pos. Control Neg. Control 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Time-to-max-slope ∆OD [min]

 Positive control Negative control The change in ∆OD in the neg. wells is the result of spurious amplifi cation products – a well-known event in LAMP assays. 

The real-time monitoring of the amplification allows to define the ideal measurement window to discriminate pos. from neg. samples.

 To differentiate between pos. and neg. samples, time-tomaximum-slope of the individual curves can be used as an alternative way to evaluate ∆OD at a certain time point. 

While pos. controls reach max. slope after about 19 min, neg. control samples need about 39 min. 

This measurement can be applied using the MARS software supplied with the instrument.

ITALIANO

Introduzione

I test diagnostici molecolari rapidi sono uno strumento centrale per rilevare e quindi rallentare la diffusione delle malattie infettive.

 La pandemia di SARS-CoV-2 ha stimolato gli sforzi internazionali per creare ed espandere gli approcci di test disponibili.

Il saggio di amplificazione isotermica mediata da loop di trascrizione inversa (RT-LAMP) riconosce l'RNA target mediante diverse sequenze distinte e lavora per amplificarlo con elevata selettività.

I dosaggi LAMP mostrano sensibilità e specificità comparabili ai metodi basati sulla PCR.

A differenza della PCR, il test LAMP si basa su una Bst polimerasi invece che su Taq polimerasi.

La Bst polimerasi e la sua attività di spostamento del filamento funzionano in modo ottimale a 65 ° C, il che significa che il dosaggio LAMP può essere eseguito in condizioni isotermiche a 65 ° C.

Poiché la necessità di cicli di temperatura viene bypassata, il tempo di esecuzione del test è ridotto a circa 30 min1 ed il test può essere eseguito su un lettore di piastre con riscaldamento fino a 65 ° C.

Il dosaggio LAMP come metodo diagnostico rapido offre quindi un'opportunità di lavorare in alta produttività aumentando la capacità diagnostica come alternativa o aggiunta alle tecniche PCR.

 Materiali e metodi

FLUOstar® Omega 384 well black, sv, lobase (Greiner, # 788096) qPCR Sealer (Greiner, # 676040) SARS-CoV-2

Kit per analisi colorimetrica rapida LAMP incl. pos. controllo (NEB, # E2019S) RNAse-free equipment Procedura sperimentale FLUOstar Omega è stato preriscaldato a 65 ° C per 2,5 ore prima dell'incubazione del test LAMP.

La pos. il controllo incluso nel kit di test LAMP (gene n) è stato diluito 1:10 in acqua priva di nucleasi fino a una concentrazione di 100.000 copie / µl.

 Le reazioni LAMP colorimetriche sono state eseguite in un volume di reazione finale di 5 µL.

Le concentrazioni dei componenti del kit di analisi LAMP sono state utilizzate secondo le istruzioni del produttore.

Master mix, primer, guanidina cloridrato, acqua priva di nucleasi e templato sono stati premiscelati e trasferiti in una piastra nera a 384 pozzetti e centrifugati per 1 minuto a 400 g. I campioni del test LAMP sono stati misurati in quadruplicato.

I campioni sono stati distribuiti sulla piastra.

Le piastre sono state sigillate con un sigillante qPCR, quindi lette su FLUOstar Omega utilizzando le seguenti impostazioni, i tempi del ciclo di lettura della piastra si basano su una piastra a 384 pozzetti completa.

 Parole chiave: tempo reale, RNA, LAMP, polimerasi, acidi nucleici, virus Principio del saggio Nel saggio LAMP, la polimerasi Bst termofila e i set di primer, riconoscono la sequenza dell'acido nucleico SARS-CoV-2 in diverse posizioni (fig. 1).

 Se l'acido nucleico target viene amplificato dal dosaggio LAMP, vengono rilasciati ioni idrogeno, spostando di conseguenza il pH del campione verso l'acido.

 Un colorante sensibile al pH è incluso per il rilevamento in modalità di assorbanza.

L'amplificazione viene rilevata come un aumento dell'assorbanza OD a 415 nm e una diminuzione a 560 nm del colorante sensibile al pH.

 Nei campioni positivi, questa variazione del pH dovrebbe avvenire entro 30 minuti dall'inizio dell'incubazione del test LAMP.

Analisi dei dati

La differenza tra l'assorbanza a 415 nm e 560 nm (∆OD) è stata utilizzata per analizzare il cambiamento di colore sensibile al pH durante il tempo di incubazione.

Il tempo per la pendenza massima per le singole curve del segnale è stato calcolato per differenziare tra le curve pos. e controlli negativi (neg.) all'interno del software FLUOstar Omega MARS

Risultati e discussione

Per valutare l'amplificazione degli acidi nucleici, ∆OD della pos. e neg. i controlli sono stati monitorati per un periodo di 60 min. È stato osservato un aumento sostanziale del ∆OD per la pos. controlli a circa 18 minuti dall'inizio del test LAMP.

Questo aumento del ∆OD nella pos. il controllo si è verificato in modo comparabile tra i singoli pozzetti replicati e le corse dei test.

I neg.  controlli mostravano anche un aumento di ∆OD, tuttavia, questo cambiamento si è verificato più tardi e ha mostrato una pendenza inferiore ed una variazione più elevata tra i pozzetti.

 La misurazione in tempo reale dello spostamento del pH nel tempo offre agli utenti la fiducia nei dati ed è utile quando si stabiliscono nuovi saggi per comprendere i punti di cut-off ottimali per differenziare tra pos. e neg. campioni.

 La rilevazione simultanea dello spettrometro a 415 nm e 560 nm consente un tempo di ciclo di 2 minuti e 13 secondi per piastra a 384 pozzetti fornendo frequenti punti temporali da misurare.

Il software MARS approvato dalla FDA CFR-21 parte 11 fornito con lo strumento facilita il calcolo automatico del ∆OD e del tempo per la pendenza massima consentendo agli utenti di differenziare tra pos. e neg. controlla facilmente.

Utilizzando il test LAMP su un lettore di micropiastre, gli utenti sono in grado di testare i campioni in meno di 40 minuti, rendendo questa tecnica altamente adatta come strumento diagnostico ad alta produttività. 0,4 0,3 0,2 0,1 0 -0,1 -0,2 65 60 55 50 45 40 35 ∆OD [OD] Temperatura [° C] 0 10 20 30 40 50 60 Tempo [min] Temperatura Pos. Controllo Neg. Controllo 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Tempo per la pendenza massima ∆OD [min] 

Controllo positivo e Controllo negativo

 La variazione di ∆OD nella neg. wells è il risultato di prodotti di amplificazione spuri, un evento ben noto nei dosaggi LAMP.

Il monitoraggio in tempo reale dell'amplificazione permette di definire la finestra di misura ideale per discriminare la pos. da neg. campioni.

  Per distinguere tra pos. e neg. campioni, tempo-massima-pendenza delle singole curve può essere utilizzato come un modo alternativo per valutare ∆OD in un certo punto temporale.

Mentre pos. i controlli raggiungono max. pendenza dopo circa 19 min, neg. i campioni di controllo richiedono circa 39 min.

Questa misura può essere applicata utilizzando il software MARS fornito con lo strumento.

Da:

https://f.hubspotusercontent40.net/hubfs/547446/Technology%20Networks/Landing%20Pages/BMG%20LabTech/AN356.pdf?__hstc=8807082.44b0f6eac84be5818378483b36bfad3b.1601170002551.1616279309040.1616448676859.95&__hssc=8807082.1.1616448676859&__hsfp=1823273589&hsCtaTracking=0d5cbf65-5ae1-47b8-81e3-08a4ebbadc2e%7C85331b56-ab0a-40c9-9328-eb928ed6250e