Automated PBMC isolation and T cell wash and concentration by the CTS Rotea system / Isolamento automatizzato di PBMC e lavaggio e concentrazione delle cellule T mediante il sistema CTS Rotea

 Automated PBMC isolation and T cell wash and concentration by the CTS Rotea system / Isolamento automatizzato di PBMC e lavaggio e concentrazione delle cellule T mediante il sistema CTS Rotea

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Introduction 

Successful processing and manufacturing in cell and gene therapy workfl ows is essential to the efficacy of the product. 

Autologous cell and gene therapy workflows involve isolating cells from an individual, engineering the cells, expanding and concentrating them, and infusing them back into the patient (Figure 1).

 Certain steps in these workflows could benefi t from optimized automation to decrease hands-on time and the cost of the cell manufacturing process. 

The Gibco™ Cell Therapy Systems™ (CTS™) Rotea™ Counterfl ow Centrifugation System is a closed cellp rocessing system developed for small-batch cell therapy manufacturing (Figure 2). 

The CTS Rotea system can be integrated into multiple steps in a cell therapy workflow, including cell isolation, washing, and concentration of many cell types. 

Here we demonstrate the efficacy of the CTS Rotea system for isolating peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from leukapheresis products, and washing and concentrating T cells—two common processes that are central in many cell therapy workflows.

 Materials and methods PBMCs were isolated from healthy donors using the CTS Rotea system, and the recovery, viability, and phenotypes were assessed and compared with those of PBMCs that were manually isolated using a density gradient medium. 

T cells were expanded in culture before being washed and concentrated using the CTS Rotea system and were similarly assessed and characterized post-processing.

 All CTS Rotea system protocols were written using the Gibco™ CTS™ Rotea™ Protocol Builder desktop application. 

PBMC isolation 

Fresh Leukopak™ bags were purchased from AllCells or HemaCare. 

After diluting contents of a bag with 3 parts of isolation buffer (HBSS, 0.002 M EDTA, and 0.025% HSA) to obtain a solution of 1/4 the original concentration, PBMCs were isolated using the CTS Rotea system.

 The processing time for one quarter of a Leukopak bag is approximately 25 min. A summary of the PBMC isolation workflow is diagrammed below.

 Prime system Load cells in chamber Wash cells Deplete red blood cells Recover PBMCs. 

1. Prime the system—the specific sequence of steps  is necessary to replace all the air in the system with fluid; dilute contents of Leukopak bag. 

2. Load cells to form a stable fluidized bed.

 3. Introduce lysis buffer to deplete red blood cells. 

4. Wash cell bed with medium to stop lysis. 

5. Recover cells to intermediate bag for downstream processing.

Results

 PBMC isolation 

Across three separate runs, both viability and recovery of PBMCs isolated from a Leukopak bag using red blood cell lysis buff er with the CTS Rotea system were consistently high.

 Red blood cells are greatly reduced while T cells are signifi cantly increased.  

T cell expansion 

Expansion rates were nearly identical between T cells isolated using the CTS Rotea system and using a density gradient medium, showing that cells processed using the CTS Rotea system do not behave diff erently from those processed using manual methods. 

The expanded T cells also have similar percentages of helper (CD4⁺), cytotoxic (CD8⁺), CD62L⁺ CCR7⁺, and exhausted (PD1⁺, LAG-3⁺) T cells, all of which are of vital importance in many cell therapies.

 T cell expansion. 

(A) Expansion of T cells isolated using the CTS Rotea system and a density gradient medium. 

(B) Characterization of the expanded T cells isolated using the CTS Rotea system and a density gradient medium. 

 Average recovery and viability for two T cell wash and concentrate runs with an input of 5 x 10⁹ cells.

 T cell washing and concentration In addition, we tested the output capability of the CTS Rotea system by completing a series of T cell washing and concentration runs to determine viability and recovery of T cells post-processing.

 One liter of culture medium containing 5 x 10⁸ cells was used as input, and the output volume was then changed from 5 mL to 10 mL, and fi nally, to 20 mL.

 After processing on the CTS Rotea system, viability and recovery were >90% for all output volumes, including 5 mL. 

The CTS Rotea system chamber is capable of capturing up to 5 x 109 T cells in a stable fluidized bed while maintaining over 90% viability and recovery. 

The CTS Rotea system can easily process more than 5 billion cells using the same consumable by looping the protocol multiples times.

The CTS Rotea system shows consistency in performing T cell wash and concentrate protocols that maintain high viability of cells with high recovery. 

 The variability between runs is also low with standard deviations of 1.1% for viability and 3.4% for recovery. 

Flow cytometry was performed on T cells before and after being washed and concentrated using the CTS Rotea system. 

Populations of CD4 (helper) and CD8 (cytotoxic) T cells were consistent between the two sample groups, exemplifying the fact that the relative proportions of cell subpopulations are unaff ected by CTS Rotea system processing.

This allows for active monitoring of all steps within a protocol, including the fl uidized cell bed formation and stabilization.

 Conclusion

 The CTS Rotea Counterfl ow Centrifugation System is capable of isolating, washing, and concentrating various cell types with no phenotypic change and no loss in recovery or viability. 

PBMCs isolated from a leukapheresis product had recovery and viability comparable to PBMCs manually isolated using a density gradient medium, with no change in phenotype or cell type composition. 

T cells isolated from PBMCs were successfully activated with Dynabeads magnetic beads, expanded, and characterized after processing with the CTS Rotea system.

 Expanded primary T cells that were washed and concentrated using the CTS Rotea system showed high recovery, cell concentration, and viability with no change in phenotype across various output volumes. 

The flexibility and efficiency of the system and user-programmable software allow it to be incorporated into multiple steps of various cell therapy workflows. 

ITALIANO

Introduzione

L'elaborazione e la produzione di successo nei flussi di lavoro della terapia cellulare e genica sono essenziali per l'efficacia del prodotto.

I flussi di lavoro di terapia genica e cellulare autologa comportano l'isolamento delle cellule da un individuo, l'ingegnerizzazione delle cellule, l'espansione e la concentrazione delle stesse e la loro refusione nel paziente (Figura 1).

 Alcuni passaggi di questi flussi di lavoro potrebbero trarre vantaggio da un'automazione ottimizzata per ridurre i tempi di intervento ed il costo del processo di produzione delle cellule.

Il sistema di centrifugazione a controflusso Gibco™ Cell Therapy Systems™ (CTS™) Rotea™ è un sistema di elaborazione delle cellule chiuse sviluppato per la produzione di terapie cellulari in piccoli lotti (Figura 2).

Il sistema CTS Rotea può essere integrato in più passaggi in un flusso di lavoro di terapia cellulare, inclusi isolamento cellulare, lavaggio e concentrazione di molti tipi di cellule.

Qui dimostriamo l'efficacia del sistema CTS Rotea per isolare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) dai prodotti della leucoaferesi e lavare e concentrare le cellule T, due processi comuni che sono centrali in molti flussi di lavoro di terapia cellulare.

 Materiali e metodi I PBMC sono stati isolati da donatori sani utilizzando il sistema CTS Rotea ed il recupero, la vitalità ed i fenotipi sono stati valutati e confrontati con quelli dei PBMC che sono stati isolati manualmente utilizzando un mezzo a gradiente di densità.

Le cellule T sono state espanse in coltura prima di essere lavate e concentrate utilizzando il sistema CTS Rotea e sono state valutate e caratterizzate in modo simile dopo l'elaborazione.

 Tutti i protocolli del sistema CTS Rotea sono stati scritti utilizzando l'applicazione desktop Gibco™ CTS™ Rotea™ Protocol Builder.

Isolamento PBMC

Le nuove borse Leukopak™ sono state acquistate da AllCells o HemaCare.

Dopo aver diluito il contenuto di una sacca con 3 parti di tampone di isolamento (HBSS, 0.002 M EDTA e 0,025% HSA) per ottenere una soluzione di 1/4 della concentrazione originale, le PBMC sono state isolate utilizzando il sistema CTS Rotea.

 Il tempo di lavorazione per un quarto di un sacchetto Leukopak è di circa 25 min. Di seguito è riportato un riepilogo del flusso di lavoro di isolamento PBMC.

 Sistema Prime 

Caricare le cellule nella camera 

Lavare le cellule

 Eliminare i globuli rossi 

Recuperare le PBMC.

1. Adescare il sistema: la sequenza specifica di passaggi è necessaria per sostituire tutta l'aria nel sistema con fluido; diluire il contenuto della sacca Leukopak.

2. Celle di carico per formare un letto fluidizzato stabile.

 3. Introdurre il tampone di lisi per esaurire i globuli rossi.

4. Lavare il letto cellulare con il terreno per arrestare la lisi.

5. Recuperare le cellule nella sacca intermedia per l'elaborazione a valle.

Risultati

 Isolamento PBMC

In tre sessioni separate, sia la vitalità che il recupero dei PBMC isolati da una sacca Leukopak utilizzando un tampone di lisi dei globuli rossi con il sistema CTS Rotea erano costantemente elevati.

 I globuli rossi sono notevolmente ridotti mentre i linfociti T sono significativamente aumentati.

Espansione delle cellule T

I tassi di espansione erano quasi identici tra le cellule T isolate utilizzando il sistema CTS Rotea e utilizzando un mezzo a gradiente di densità, dimostrando che le cellule elaborate utilizzando il sistema CTS Rotea non si comportano diversamente da quelle elaborate con metodi manuali.

Le cellule T espanse hanno anche percentuali simili di cellule T helper (CD4⁺), citotossiche (CD8⁺), CD62L⁺ CCR7⁺ e esaurite (PD1⁺, LAG-3⁺), tutte di vitale importanza in molte terapie con cellule.

 Espansione delle cellule T.

(A) Espansione delle cellule T isolate utilizzando il sistema CTS Rotea e un mezzo a gradiente di densità.

(B) Caratterizzazione delle cellule T espanse isolate utilizzando il sistema CTS Rotea ed un mezzo a gradiente di densità.

 Recupero e vitalità medi per due cicli di lavaggio e concentrato di cellule T con un input di 5 x 10⁹ cellule.

 Lavaggio e concentrazione delle cellule T.

Inoltre, abbiamo testato la capacità di output del sistema CTS Rotea completando una serie di cicli di lavaggio e concentrazione delle cellule T per determinare la vitalità ed il recupero della post-elaborazione delle cellule T.

 Come input è stato utilizzato un litro di terreno di coltura contenente 5 x 10⁸ di cellule ed il volume di output è stato quindi modificato da 5 mL a 10 mL e, infine, a 20 mL.

 Dopo l'elaborazione sul sistema CTS Rotea, la vitalità ed il recupero erano >90% per tutti i volumi in uscita, inclusi 5 ml.

La camera del sistema CTS Rotea è in grado di catturare fino a 5 x 109 cellule T in un letto fluido stabile mantenendo oltre il 90% di vitalità e recupero.

Il sistema CTS Rotea è in grado di elaborare facilmente più di 5 miliardi di celle utilizzando lo stesso materiale di consumo, ripetendo il protocollo più volte.

Il sistema CTS Rotea mostra coerenza nell'esecuzione di protocolli di lavaggio e concentrazione delle cellule T che mantengono un'elevata vitalità delle cellule con un elevato recupero.

 Anche la variabilità tra le esecuzioni è bassa con deviazioni standard dell'1,1% per la vitalità e del 3,4% per il recupero.

La citometria a flusso è stata eseguita sulle cellule T prima e dopo essere state lavate e concentrate utilizzando il sistema CTS Rotea.

Le popolazioni di cellule T CD4 (helper) e CD8 (citotossiche) erano coerenti tra i due gruppi campione, esemplificando il fatto che le proporzioni relative delle sottopopolazioni cellulari non sono influenzate dall'elaborazione del sistema CTS Rotea.

Ciò consente il monitoraggio attivo di tutte le fasi all'interno di un protocollo, compresa la formazione e la stabilizzazione del letto cellulare fluido.

 Conclusione

 Il sistema di centrifugazione a controflusso CTS Rotea è in grado di isolare, lavare e concentrare vari tipi di cellule senza cambiamenti fenotipici e senza perdita di recupero o vitalità.

Le PBMC isolate da un prodotto di leucoaferesi avevano un recupero e una vitalità paragonabili alle PBMC isolate manualmente utilizzando un mezzo a gradiente di densità, senza alcun cambiamento nel fenotipo o nella composizione del tipo cellulare.

Le cellule T isolate da PBMC sono state attivate con successo con perline magnetiche Dynabeads, espanse e caratterizzate dopo l'elaborazione con il sistema CTS Rotea.

 Le cellule T primarie espanse che sono state lavate e concentrate utilizzando il sistema CTS Rotea hanno mostrato un elevato recupero, concentrazione cellulare e vitalità senza alcun cambiamento nel fenotipo attraverso vari volumi di output.

La flessibilità e l'efficienza del sistema e del software programmabile dall'utente consentono di incorporarlo in più fasi di vari flussi di lavoro di terapia cellulare.

Da:

https://f.hubspotusercontent40.net/hubfs/547446/Technology%20Networks/Landing%20Pages/Thermo/Rachael/Nov%202020/DeNovo-New-Rotea-AppNote-Global-FHR.pdf?__hstc=8807082.44b0f6eac84be5818378483b36bfad3b.1601170002551.1622465823934.1622727442481.114&__hssc=8807082.1.1622727442481&__hsfp=2281083568&hsCtaTracking=566137a1-c5c2-4275-bd56-5fdc8c6d65bc%7C5ffe87ea-afd8-42cd-8875-dc5f25185f86