Automated Viral Plaque Assay Workflow Cell Imaging Multi-Mode Reader. / Lettore multi-modalità di imaging cellulare del flusso di lavoro del dosaggio automatico della placca virale.

Automated Viral Plaque Assay Workflow Cell Imaging Multi-Mode Reader.  The process of the ENEA patent RM2012A000637 is very useful in this application. / Lettore multi-modalità di imaging cellulare del flusso di lavoro del dosaggio automatico della placca virale. Il procedimento del brevetto ENEA RM2012A000637 è molto utile in questa applicazione.

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Figure 1. Viral plaque assay workflow incorporating automated imaging and analysis conducted with the  Gen5 software / Flusso di lavoro del test della placca virale che incorpora imaging e analisi automatizzati condotti con il software Gen5

Introduction 

Plaque assays remain the standard method for determining viral titers for lysogenic viruses. 

The assay relies on determining the number of plaque-forming units (PFU) created in a monolayer of virus-infected cells. 

Plaques form when a virus-infected cell Iyses, leading to subsequent cycles of infection and lysis of neighboring cells. 

The resulting cellular dead zone, or plaque, surrounded by non-infected cells is identified using a counterstain, typically a crystal violet solution, and optical microscopy or visual inspection.

 Plaques may take up to several days to form depending on the virus and are conventionally counted manually after an empirically determined amount of time.

 At appropriate dilutions, each plaque represents infection and lysis from a single virion and is used along with the dilution factor to calculate the number of plaque-forming units per sample volume (PFU/mL). 

The practiced execution of the steps outlined above enable distinct counts of individual plaques to be achieved. However, the manual counting of plaques can be time intensive and subjective. 

Here we describe an automated imaging-based plaque assay using the BioTek Cytation Cell Imaging Multi-Mode Reader and Gen5 Microplate Reader and Imager Software. 

This method provides an accurate and efficient method for determining plaque counts and calculating viral titers in a range of microplate densities, including 6-, 24-, 48-, and 96-well formats. 

Plaque Assay Materials and Methods

 BHK cell suspension was added to 6-well microplates to form a fully confluent and evenly distributed monolayer in each well.

 After 24 hours, spent media was removed and cells were washed with phosphate-buffered saline (PBS).

 Serial 1:10 dilutions of vesicular stomatitis virus (VSV) were then added to individual wells across the plate and incubated for adsorption. 

After 1 hour, the inoculum was removed and the cells were washed with basal medium. 

An agarose semisolid overlay was applied to the wells to prevent the coalescence of forming plaques, and the plate was incubated for 24 hours to allow for quantifiable plaque formation. 

Following incubation, cell monolayers were fixed with 4% paraformaldehyde (PFE) for 1 hour at room temperature.

 After fixation, the agarose overlay was carefully removed to prevent monolayer disruption. 

Crystal violet solution was added to each well for 15 minutes, followed by 2-4 gentle washes with distilled water.

 Imaging Procedure and Analysis Using the BioTek Cytation and Gen5 microplate reader and imager software, plaque counting, and calculation of final titers was determined using optimized protocols. Color images were captured using color brightfield and the 1.25x objective.

 An image montage was acquired per well to capture the entire culture area and then images were stitched together to form a single image for analysis. Individual plaques were identified by Gen5 automated analysis tools using the green color channel, based on size and intensity thresholding, with total plaque count, average plaque area, and total plaque area per well reported.

 Additionally, by defining the serial dilutions within the protocol, the final viral titer was calculated and reported for each sample.

Figure 2. Automated image acquisition and analysis provides an efficient and robust method for conducting viral plaque assays. This procedure overview illustrates the three steps carried out on the system. Color brightfield images of the entire well area are captured by the Cytation .Gen5 image analysis tools then identify each plaque from the acquired images, with customized data exports reporting detailed metrics for each sample. / L'acquisizione e l'analisi automatizzate delle immagini forniscono un metodo efficiente e robusto per condurre analisi della placca virale. Questa panoramica della procedura illustra i tre passaggi eseguiti sul sistema. Le immagini in campo chiaro a colori dell'intera area del pozzetto vengono catturate dagli strumenti di analisi delle immagini Cytation .Gen5, quindi identificano ogni placca dalle immagini acquisite, con esportazioni di dati personalizzate che riportano metriche dettagliate per ciascun campione.

Conclusion 

The viral plaque assay is a well-established method for determining viral titers for lytic viruses.

 However, conventional analysis methods limit throughput and rely on subjective metrics. 

Employing automated image capture and analysis protocols on the Cytation system and Gen5 software provides a convenient and robust method for conducting viral plaque assays.

 While this study was conducted using the color brightfield imaging mode, similar protocols have been developed that utilize the inverted camera and color brightfield imaging available on  models and the Lionheart Automated Microscope, as well as the upright color camera available.

ITALIANO

Introduzione

I saggi della placca rimangono il metodo standard per la determinazione dei titoli virali per i virus lisogeni.

Il test si basa sulla determinazione del numero di unità formanti placca (PFU) create in un monostrato di cellule infettate da virus.

Le placche si formano quando una cellula infetta da virus Iys, portando a successivi cicli di infezione e lisi delle cellule vicine.

La zona morta cellulare risultante, o placca, circondata da cellule non infette viene identificata utilizzando una colorazione di contrasto, tipicamente una soluzione di cristalvioletto, e la microscopia ottica o l'ispezione visiva.

 Le placche possono richiedere fino a diversi giorni per formarsi a seconda del virus e vengono convenzionalmente contate manualmente dopo un periodo di tempo determinato empiricamente.

 A diluizioni appropriate, ogni placca rappresenta l'infezione e la lisi da un singolo virione e viene utilizzata insieme al fattore di diluizione per calcolare il numero di unità formanti placca per volume di campione (PFU/mL).

L'esecuzione pratica dei passaggi sopra descritti consente di ottenere conteggi distinti delle singole placche. Tuttavia, il conteggio manuale delle placche può richiedere molto tempo ed essere soggettivo.

Qui descriviamo un dosaggio automatico della placca basato sull'imaging utilizzando il lettore multi-mode BioTek Cytation Cell Imaging e il lettore di micropiastre Gen5 e il software Imager.

Questo metodo fornisce un metodo accurato ed efficiente per determinare i conteggi delle placche e calcolare i titoli virali in una gamma di densità di micropiastre, inclusi i formati a 6, 24, 48 e 96 pozzetti.

Materiali e metodi per il test della placca

 La sospensione cellulare BHK è stata aggiunta a micropiastre da 6 pozzetti per formare un monostrato completamente confluente e uniformemente distribuito in ciascun pozzetto.

 Dopo 24 ore, i mezzi esauriti sono stati rimossi e le cellule sono state lavate con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).

 Diluizioni seriali 1:10 del virus della stomatite vescicolare (VSV) sono state quindi aggiunte ai singoli pozzetti attraverso la piastra e incubate per l'assorbimento.

Dopo 1 ora, l'inoculo è stato rimosso e le cellule sono state lavate con terreno di base.

Ai pozzetti è stata applicata una copertura semisolida di agarosio per prevenire la coalescenza della formazione di placche e la piastra è stata incubata per 24 ore per consentire la formazione di placche quantificabili.

Dopo l'incubazione, i monostrati cellulari sono stati fissati con paraformaldeide (PFE) al 4% per 1 ora a temperatura ambiente.

 Dopo la fissazione, l'overlay di agarosio è stato accuratamente rimosso per prevenire la rottura del monostrato.

La soluzione di cristalvioletto è stata aggiunta a ciascun pozzetto per 15 minuti, seguita da 2-4 lavaggi delicati con acqua distillata.

 Procedura ed analisi di imaging

 Utilizzando il lettore di micropiastre BioTek  e Gen5 ed il software imager, il conteggio delle placche ef il calcolo dei titoli finali sono stati determinati utilizzando protocolli ottimizzati. Le immagini a colori sono state acquisite utilizzando il campo chiaro a colori e l'obiettivo 1,25x.

 È stato acquisito un montaggio di immagini per pozzetto per catturare l'intera area di coltura e quindi le immagini sono state unite per formare un'unica immagine per l'analisi. Le singole placche sono state identificate dagli strumenti di analisi automatizzata Gen5 utilizzando il canale del colore verde, in base alla soglia di dimensione e intensità, con conteggio totale della placca, area media della placca e area totale della placca per pozzetto riportato.

 Inoltre, definendo le diluizioni seriali all'interno del protocollo, è stato calcolato e riportato il titolo virale finale per ciascun campione.

Conclusione

Il saggio della placca virale è un metodo consolidato per determinare i titoli virali per i virus litici.

  Tuttavia, i metodi di analisi convenzionali limitano l'uscita dei risultati e si basano su metriche soggettive.

L'utilizzo di protocolli automatizzati di acquisizione ed analisi delle immagini sul sistema Cytation e sul software Gen5 fornisce un metodo conveniente e robusto per condurre analisi della placca virale.

  Sebbene questo studio sia stato condotto utilizzando la modalità di imaging in campo chiaro a colori, sono stati sviluppati protocolli simili che utilizzano la telecamera invertita e l'imaging in campo chiaro a colori disponibili sui modelli e il microscopio automatizzato Lionheart, nonché la telecamera a colori verticale disponibile.

Da:

https://www.biotek.com/assets/tech_resources/RA44187.8797106482_%20Automated%20viral%20plaque%20assay%20workflow_Application%20Bulletin.pdf