Screening CRISPRsc in pool / Individuazione degli effetti di CRISPR per una singola cellula

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

 Fig. 1 - Flusso di lavoro di screening CRISPRsc di Horizon. / Horizon's CRISPRsc screening workflow.

Lo screening CRISPRsc (CRISPR single cell) combina la flessibilità dello screening in pool con la potenza della trascrittomica alla risoluzione di una singola cellula. Collegando un RNA guida specifico alla lettura dell'intero trascrittoma di una singola cellula, CRISPRsc offre l'opportunità di interrogare il fenotipo di una determinata perturbazione genetica con dettagli senza precedenti.

La piattaforma di screening CRISPRsc di Horizon ( Figura 1 ) offre un approccio semplificato per chiarire informazioni biologiche preziose e intriganti. Uno dei grandi vantaggi dello screening CRISPRsc è la possibilità di analizzare set di dati nel più tradizionale screening in pool e nei paradigmi di screening di singole cellule, per il confronto dei dati. L'analisi combinata dei dati di sequenziamento dell'intero trascrittoma può identificare gli obiettivi importanti che sono up- o down-regolati in risposta a un trattamento e può aiutare a verificare le prestazioni visibili se è noto che il trattamento esercita una certa risposta (ad es. cambiamento nell'espressione genica).

Il potere dello screening CRISPR in pool

Lo screening lentivirale in pool con CRISPR-Cas9 ha notevolmente migliorato il modo in cui i ricercatori cercano di chiarire i percorsi biologici, i driver del fenotipo e la scoperta terapeutica e si è evoluto fino a diventare un aspetto fondamentale della ricerca e degli sforzi di scoperta in numerosi campi. Gli schermi CRISPR raggruppati offrono una metodologia relativamente veloce, conveniente e precisa per determinare il meccanismo d'azione del farmaco e identificare la resistenza genetica ed i fattori di sensibilizzazione che consentono la stratificazione del paziente. Inoltre, consentono un modo semplice per studiare le interazioni gene-gene e determinare i nodi critici nei percorsi e nei processi biologici.

I limiti dello screening CRISPR in pool

Sebbene potente di per sé, lo screening CRISPR in pool è spesso limitato alla misurazione di un singolo fenotipo come la proliferazione o la sopravvivenza cellulare o semplici cambiamenti fenotipici, come la misurazione dei cambiamenti nell'attività di un singolo gene attraverso la generazione di un reporter di linea cellulare. Pubblicazioni recenti hanno dimostrato la fattibilità dell'accoppiamento dello screening CRISPR in pool a letture altamente complesse, come il profilo di espressione genica di singole cellule. È ampiamente riconosciuto che gruppi di cellule, anche in coltura, possono mostrare alti livelli di eterogeneità e ciò può comportare ampi intervalli di risposta all'interno della popolazione più ampia. Allo stesso modo, nelle linee cellulari tumorali si osservano anche alti livelli di eterogeneità cellulare che determinano un'alterata resistenza ai farmaci o risposta immunitaria.

Lo sviluppo di un potente approccio ibrido, screening CRISPRsc in pool

Per comprendere meglio le risposte ai farmaci e l'insorgenza di resistenza al trattamento è fondamentale studiare i meccanismi sottostanti alla risoluzione di una singola cellula. Sondando il trascrittoma di ogni singola cellula per la sua risposta a un trattamento o uno stimolo, possiamo collegare le firme dell'espressione genica con le risposte ai farmaci che consentono la rilevazione di biomarcatori e lo sviluppo di farmaci personalizzati. CRISPRsc (CRISPR single cell) combina la flessibilità dello screening in pool con la potenza della trascrittomica alla risoluzione di una singola cellula. Interrogando l'effetto di un RNA guida specifico per la lettura del trascrittoma intero di una singola cellula, CRISPRsc offre l'opportunità di interrogare il fenotipo di una determinata perturbazione genetica con dettagli senza precedenti. Ciò consente l'identificazione di risposte cellulari sfumate che sono parte integrante della risoluzione di complesse questioni biologiche. La piattaforma di screening CRISPRsc di Horizon (Fig. 1) offre un approccio semplificato per chiarire informazioni biologiche preziose e intriganti. Uno dei grandi vantaggi dello screening CRISPRsc è la possibilità di analizzare set di dati nel più tradizionale screening in pool e nei paradigmi di screening di singole cellule per il confronto dei dati. L'analisi combinata dei dati di sequenziamento dell'intero trascrittoma può identificare gli hit che sono up- o down-regolati in risposta a un trattamento e può aiutare a verificare le prestazioni dello schermo se è noto che il trattamento esercita una certa risposta (ad es. cambiamento nell'espressione genica). Mentre i risultati delle singole cellule consentono l'identificazione di risposte cellulari sfumate che sono parte integrante della risoluzione di complesse questioni biologiche.

Sia che il tuo obiettivo sia la convalida target delle terapie farmacologiche, l'analisi della differenziazione cellulare o un altro processo biologico complesso, siamo lieti di discutere su come questo approccio può portare la tua ricerca al livello successivo.

ENGLISH

The power of pooled CRISPR screening

Pooled lentiviral screening with CRISPR-Cas9 has significantly enhanced how researchers go about elucidating biological pathways, phenotype drivers, and therapeutic discovery and has evolved to become a fundamental aspect of research and discovery efforts in numerous fields. Pooled CRISPR screens offer a relatively fast, cost effective, and precise methodology to determine drug mechanism of action and to identify genetic resistance and sensitizing factors that enable patient stratification. Further, they enable a straightforward way to study gene-gene interactions and determine critical nodes in biological pathways and processes.

The limitations of pooled CRISPR screening

Though powerful in its own right, pooled CRISPR screening is often restricted to the measurement of a single phenotype such as proliferation or cell survival, or simple phenotypic changes, such as, measurement of changes in activity of a single gene through the generation of a reporter cell line. Recent publications have demonstrated the feasibility of coupling pooled CRISPR screening to highly complex readouts, such as single cell gene expression profiling. It is widely appreciated that groups of cells, even in culture, can display high levels of heterogeneity and this can result in wide ranges of response within the larger population. Similarly, high levels of cell heterogeneity are also observed in cancer cell lines and results in altered drug resistance or immune response.

The development of a powerful hybrid approach, pooled CRISPRsc screening

To better understand drug responses and the occurrence of treatment resistance it is paramount to investigate the underlying mechanisms at single cell resolution. By probing the transcriptome of each individual cell for its response to a treatment or a stimulus, we can link gene expression signatures with drug responses which enables the detection of biomarkers and the development of personalized medicines. CRISPRsc (CRISPR single cell) combines the flexibility of pooled screening with the power of transcriptomics at single cell resolution. By interrogating the effect a specific guide RNA to single cell whole transcriptome readout, CRISPRsc offers the opportunity to interrogate the phenotype of any given genetic perturbation in unprecedented detail. This allows identification of nuanced cellular responses that are integral to solving complex biological questions. Horizon’s CRISPRsc screening platform (Fig. 1) offers a streamlined approach to elucidating valuable and intriguing biological information. One of the great advantages of CRISPRsc screening is the possibility to analyze datasets in the more traditional pooled screening and in the single cell screening paradigms for data comparison. Pooled analysis of whole transcriptome sequencing data can identify hits that are up- or down-regulated in response to a treatment and can help to verify screen performance if the treatment is known to exert a certain response (e.g. change in gene expression). While the single-cell results allow identification of nuanced cellular responses that are integral to solving complex biological questions.

Whether your focus is target validation of drug therapies, analyzing cell differentiation, or another complex biological process, we're happy to discuss how this approach can take your research to the next level. 

Da:

https://horizondiscovery.com/en/blog/discover-more-with-pooled-crisprsc-screening?utm_campaign=eml-21q1-CRISPRsc-GEN-webinar%20followup&utm_medium=email&utm_source=Eloqua