Dharmacon™ Accell™ siRNA reagents: achieving long-term gene silencing / Reagenti siRNA Dharmacon™ Accell™: raggiungimento del silenziamento genico a lungo termine

 Dharmacon™ Accell™ siRNA reagents: achieving long-term gene silencing / Reagenti siRNA Dharmacon™ Accell™: raggiungimento del silenziamento genico a lungo termine

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Figure 1. Repeated application workflow for inducing long-term gene silencing in cultured cell lines. Following the initial plating in growth medium (medium plus serum, supplements and antibiotics), cells are treated with Accell siRNA resuspended in the Accell Delivery Media. After 24-48 hours, the delivery mix is replaced with complete medium until cells are confluent, upon which the cultures are split and Accell delivery mix is re-applied. /  Flusso di lavoro di applicazioni ripetute per indurre il silenziamento genico a lungo termine in linee cellulari in coltura. Dopo la piastratura iniziale nel mezzo di crescita (mezzo più siero, integratori e antibiotici), le cellule vengono trattate con Accell siRNA risospeso nel mezzo di somministrazione Accell. Dopo 24-48 ore, la miscela di somministrazione viene sostituita con un terreno completo fino a quando le cellule non sono confluenti, su cui le colture vengono divise e la miscela di somministrazione Accell viene riapplicata.

Abstract 

Developing a thorough understanding of a gene’s contribution to a particular phenotype is problematic when the protein has an extended half life or the phenotype under study requires days to materialize. Under these circumstances, reagents that induce long-term gene silencing are needed to sufficiently deplete internal cellular stores for extended periods of time. To address this need, we have developed Dharmacon Accell siRNA reagents, with novel modifications enabling uptake by cells without the aid of lipid transfection reagents. This innovative delivery technology allows repeated application of Accell siRNA reagents to provide extended duration gene knockdown with only minimal effects on cell viability and the innate immune response. These attributes greatly broaden the range of biological questions and cell types that can be investigated by researchers using RNA interference (RNAi). 

Introduction 

Over the years, gene silencing by RNAi has relied heavily on the use of cationic lipid-based delivery reagents for transfecting cells with small interfering RNAs (siRNAs). In many cases, lipid-based transfection is sufficient and provides efficient levels of gene knockdown. Yet in a significant fraction of cases, cells are either refractory to lipid-mediated delivery of siRNAs or aversely sensitive to the presence of lipids. The Accell siRNA product line represents a recently developed technology that promotes delivery of siRNA independent of viral vectors or lipid-based transfection reagents (also referred to as “passive delivery”) to virtually any cell type. Through the incorporation of a unique combination of chemical and bioinformatic enhancements that increase functionality, stability, and lipid-independent delivery, Accell siRNAs can be used in a wide range of human, mouse, and rat cell lines that have been traditionally identified as difficult to transfect.  This novel delivery technology permits gene silencing with minimal off-target events (as assessed by genome-wide profiling) has limited repercussions on cell viability, and triggers a negligible innate immune response as assessed by quantitation of nine inflammatory response proteins using the SearchLight™ Array platform (Human Inflammatory Cytokine Array 1; Thermo Scientific Cat. # 84619). Thus, unlike electroporation, which is historically the first alternative delivery method for cells found to be averse to lipid-based transfection reagents, Accell siRNA reagents can be employed without significant effects on cell physiology. Over the course of investigations, it is often necessary to knock down gene expression for extended periods of time to accurately assess the contribution of a particular protein to a given biological event. Long-term reduction of gene expression can be problematic, particularly in cases where there are large intracellular reservoirs of the target or the half-life of the protein is drawn out. In some instances, researchers have attempted multiple, consecutive lipid-mediated transfections of siRNAs into cultured cells. Unfortunately, this approach is frequently cytotoxic and can induce brief (24-72 hours) changes in the state of the innate immune response. To overcome these barriers, DNA-mediated RNAi, commonly exploiting viral delivery platforms, has been adopted. This approach can be successful, but is costly and requires significant development time. For a solution that requires neither lipid transfection nor viral delivery, this Application Note provides details of how Accell siRNA reagents may be applied to provide long-term silencing of gene expression.

Workflow for long-term gene knockdown using Accell siRNA

 Figure 1 provides an overview of how Accell siRNA can be used to induce gene knockdown for extended periods of time. The day after cells are trypsinized, counted and plated, the growth medium used to culture cells (containing serum, supplements and antibiotics) is replaced with Accell Delivery Media (Cat. #B-005000-100, B-005000-500) containing Accell siRNA targeting the gene of interest (referred to as the Accell delivery mix). Passive transfection then proceeds for 24-48 hours, whereupon the Accell delivery mix is exchanged for growth medium, and cells are cultured for an additional period (generally 24-48 hours). Prior to reaching confluency, cultures are split, re-plated, and treated again using the same protocol described in the previous round. If cells require additional time prior to splitting, they may be treated again with Accell delivery mix without splitting. This may vary depending upon the cell type; however, the cycling between growth medium and Accell delivery mix can be performed with little affect on cell viability to provide long-term gene knockdown in your cell type of choice.

Demonstration of long-term gene knockdown using Accell sirna targeting PPIB 

To demonstrate the feasibility of providing long-term gene knockdown using Accell technology, the workflow described above was employed to target the housekeeping gene PPIB (Cyclophilin B, NM_000942) in SH-SY5Y neuroblastoma cells. Accell siRNA targeting PPIB was delivered at one of three concentrations (100 nM, 500 nM, or 1 µM) and the levels of mRNA knockdown were assessed using branched DNA (bDNA; Panomics) on days 3, 7, 11, 15, and 19. Accell Non-targeting siRNA #1 (Cat. #D-001910-01) was included to assess the specificity and overall effects of the treatment on cell viability. Finally, at each passage, untreated cells subjected to medium changes and splitting were treated with Accell siRNA targeting GAPDH as a control for transfectability of the cells. The results of these experiments demonstrate the efficacy of Accell technology in providing long-term gene knockdown. Accell siRNA-mediated gene knockdown of PPIB exhibited a dose-dependent response, with 1 µM concentrations providing greater than 70% reduction in gene expression in SH-SY5Y cells. Equally important, knockdown was specific while cell viability generally remained at 80% over the course of the 5 passages (19 days). The repeated application workflow was also optimized for HeLa cells, resulting in a 30-day duration of silencing.

Compatibility of Accell technology with lipid-mediated delivery

 To test whether long-term gene silencing using Accell siRNA was compatible with subsequent lipid-mediated siRNA transfections, HeLa cells treated over the course of 10 days with an Accell PPIB targeting siRNA were thereafter transfected with Dharmacon™ siGENOME™ (unmodified) siRNA targeting GAPDH (Cat. #D-001140-01-05) and delivered using Dharmacon™ DharmaFECT™ 1 Transfection Reagent (Cat. #T-2001-01).

 The results of these experiments show that passive delivery using Accell siRNA technology is compatible with standard lipid transfection techniques. In cases where cells were treated with both the Accell PPIB siRNA and the siGENOME GAPDH siRNA delivered by DharmaFECT 1, overall knockdown for each gene was 80% or greater (day 13). These studies attest to the flexibility of experimental design when using Accell siRNA reagents and demonstrate the ability to achieve multi-gene knockdown when using Accell siRNA in conjunction with lipid-mediated delivery techniques.

Summary

 While application of Accell siRNA reagents for short-term gene silencing requires little optimization, variations should be tested to identify the best protocol for long-term gene silencing in your cell type. Incorporation of controls that allow for assessment of the effects of passive delivery on cell viability and overall physiology are considered prudent to ensure that repeated exposure to Accell delivery mix does not introduce unwanted changes in the cell’s phenotypic state. Long-term gene knockdown is essential when protein stability and/or assay design requires sustained silencing. As demonstrated above, repeated application with the Accell delivery mix resulted in continuous silencing for up to 30 days. The described workflow is relatively non-toxic and compatible with lipid-mediated transfection (thus allowing multi-gene or combinatorial knockdown). This novel passive delivery technology significantly expands the experimental design options of researchers by permitting the use of cells that are historically refractory to lipid-mediated transfection.

ITALIANO

Riassunto

Lo sviluppo di una comprensione approfondita del contributo di un gene a un particolare fenotipo è problematico quando la proteina ha un'emivita estesa o il fenotipo in studio richiede giorni per materializzarsi. In queste circostanze, sono necessari reagenti che inducono il silenziamento genico a lungo termine per esaurire sufficientemente le riserve cellulari interne per lunghi periodi di tempo. Per rispondere a questa esigenza, abbiamo sviluppato i reagenti siRNA Dharmacon Accell, con nuove modifiche che consentono l'assorbimento da parte delle cellule senza l'ausilio di reagenti di trasfezione lipidica. Questa innovativa tecnologia di somministrazione consente l'applicazione ripetuta dei reagenti Accell siRNA per fornire un knockdown genico di lunga durata con effetti minimi sulla vitalità cellulare e sulla risposta immunitaria innata. Questi attributi ampliano notevolmente la gamma di questioni biologiche e tipi di cellule che possono essere studiati dai ricercatori che utilizzano l'interferenza dell'RNA (RNAi).

Introduzione

Nel corso degli anni, il silenziamento genico da parte dell'RNAi si è basato molto sull'uso di reagenti di consegna a base di lipidi cationici per la trasfezione di cellule con piccoli RNA interferenti (siRNA). In molti casi, la trasfezione basata sui lipidi è sufficiente e fornisce livelli efficienti di knockdown genico. Tuttavia, in una frazione significativa dei casi, le cellule sono o refrattarie alla somministrazione di siRNA mediata dai lipidi o negativamente sensibili alla presenza di lipidi. La linea di prodotti Accell siRNA rappresenta una tecnologia sviluppata di recente che promuove la consegna di siRNA indipendente da vettori virali o reagenti di trasfezione a base di lipidi (nota anche come "consegna passiva") praticamente a qualsiasi tipo di cellula. Attraverso l'incorporazione di una combinazione unica di miglioramenti chimici e bioinformatici che aumentano la funzionalità, la stabilità e la consegna indipendente dai lipidi, gli siRNA Accell possono essere utilizzati in un'ampia gamma di linee cellulari umane, di topo e di ratto che sono state tradizionalmente identificate come difficili da trasfettare. Questa nuova tecnologia di somministrazione consente il silenziamento genico con eventi minimi fuori bersaglio (come valutato dal profilo dell'intero genoma) ha ripercussioni limitate sulla vitalità cellulare, e innesca una risposta immunitaria innata trascurabile come valutato dalla quantificazione di nove proteine ​​di risposta infiammatoria utilizzando la piattaforma SearchLight™ Array (Human Inflammatory Cytokine Array 1; Thermo Scientific Cat. # 84619). Pertanto, a differenza dell'elettroporazione, che è storicamente il primo metodo di somministrazione alternativo per le cellule risultate avverse ai reagenti di trasfezione a base di lipidi, i reagenti Accell siRNA possono essere impiegati senza effetti significativi sulla fisiologia cellulare. Nel corso delle indagini, è spesso necessario abbattere l'espressione genica per lunghi periodi di tempo per valutare con precisione il contributo di una particolare proteina a un dato evento biologico. La riduzione a lungo termine dell'espressione genica può essere problematica, in particolare nei casi in cui ci sono grandi serbatoi intracellulari del bersaglio o l'emivita della proteina è ridotta. In alcuni casi, i ricercatori hanno tentato trasfezioni multiple e consecutive mediate dai lipidi di siRNA in cellule in coltura. Sfortunatamente, questo approccio è spesso citotossico e può indurre brevi (24-72 ore) cambiamenti nello stato della risposta immunitaria innata. Per superare queste barriere, è stato adottato l'RNAi mediato dal DNA, che sfrutta comunemente piattaforme di consegna virale. Questo approccio può avere successo, ma è costoso e richiede tempi di sviluppo significativi. Per una soluzione che non richiede né la trasfezione lipidica né la somministrazione virale, questa nota applicativa fornisce dettagli su come i reagenti Accell siRNA possono essere applicati per fornire il silenziamento a lungo termine dell'espressione genica.

Flusso di lavoro per il knockdown genico a lungo termine utilizzando Accell siRNA

 La Figura 1 fornisce una panoramica di come Accell siRNA può essere utilizzato per indurre il knockdown del gene per lunghi periodi di tempo. Il giorno dopo che le cellule sono state tripsinizzate, contate e piastrate, il mezzo di crescita utilizzato per la coltura delle cellule (contenente siero, integratori e antibiotici) viene sostituito con Accell Delivery Media (Cat. #B-005000-100, B-005000-500) contenente Accell siRNA mirato al gene di interesse (denominato mix di consegna Accell). La trasfezione passiva procede quindi per 24-48 ore, dopodiché la miscela di somministrazione Accell viene scambiata con un mezzo di crescita e le cellule vengono coltivate per un periodo aggiuntivo (generalmente 24-48 ore). Prima di raggiungere la confluenza, le colture vengono divise, ripiastrate e trattate nuovamente utilizzando lo stesso protocollo descritto nel round precedente. Se le cellule richiedono più tempo prima di essere suddivise, possono essere trattate nuovamente con la miscela di somministrazione Accell senza dividersi. Questo può variare a seconda del tipo di cellula; tuttavia, il ciclo tra il mezzo di crescita e il mix di consegna Accell può essere eseguito con scarso effetto sulla vitalità cellulare per fornire un knockdown genico a lungo termine nel tipo di cellula prescelto.

Dimostrazione di knockdown genico a lungo termine utilizzando Accell sirna mirato a PPIB

Per dimostrare la fattibilità di fornire un knockdown genico a lungo termine utilizzando la tecnologia Accell, il flusso di lavoro descritto sopra è stato impiegato per mirare al gene housekeeping PPIB (Cyclophilin B, NM_000942) nelle cellule di neuroblastoma SH-SY5Y. Accell siRNA targeting PPIB è stato consegnato a una delle tre concentrazioni (100 nM, 500 nM o 1 μM) e i livelli di atterramento dell'mRNA sono stati valutati utilizzando DNA ramificato (bDNA; Panomics) nei giorni 3, 7, 11, 15 e 19 Accell non-targeting siRNA #1 (Cat. #D-001910-01) è stato incluso per valutare la specificità e gli effetti complessivi del trattamento sulla vitalità cellulare. Infine, ad ogni passaggio, le cellule non trattate soggette a cambiamenti medi e scissione sono state trattate con Accell siRNA mirato a GAPDH come controllo per la trasfettabilità delle cellule. I risultati di questi esperimenti dimostrano l'efficacia della tecnologia Accell nel fornire knockdown genico a lungo termine. Il knockdown del gene PPIB mediato da siRNA di Accell ha mostrato una risposta dose-dipendente, con concentrazioni di 1 µM che forniscono una riduzione superiore al 70% dell'espressione genica nelle cellule SH-SY5Y. Altrettanto importante, il knockdown è stato specifico mentre la vitalità cellulare è rimasta generalmente all'80% nel corso dei 5 passaggi (19 giorni). Il flusso di lavoro delle applicazioni ripetute è stato ottimizzato anche per le cellule HeLa, con una durata di silenziamento di 30 giorni.

Compatibilità della tecnologia Accell con la consegna mediata dai lipidi

 Per verificare se il silenziamento genico a lungo termine utilizzando Accell siRNA fosse compatibile con le successive trasfezioni di siRNA mediate dai lipidi, le cellule HeLa trattate nel corso di 10 giorni con un siRNA Accell PPIB mirato sono state successivamente trasfettate con siRNA Dharmacon™ siGENOME™ (non modificato) mirato a GAPDH (Cat. #D-001140-01-05) e consegnato utilizzando il reagente di trasfezione Dharmacon™ DharmaFECT™ 1 (Cat. #T-2001-01).

 I risultati di questi esperimenti mostrano che la consegna passiva utilizzando la tecnologia Accell siRNA è compatibile con le tecniche di trasfezione lipidica standard. Nei casi in cui le cellule sono state trattate sia con il siRNA Accell PPIB che con il siRNA siGENOME GAPDH fornito da DharmaFECT 1, il knockdown complessivo per ciascun gene è stato pari o superiore all'80% (giorno 13). Questi studi attestano la flessibilità della progettazione sperimentale quando si utilizzano i reagenti Accell siRNA e dimostrano la capacità di ottenere un knockdown multi-gene quando si utilizza Accell siRNA in combinazione con tecniche di somministrazione mediate dai lipidi.

Riepilogo

Sebbene l'applicazione dei reagenti Accell siRNA per il silenziamento genico a breve termine richieda poca ottimizzazione, le variazioni dovrebbero essere testate per identificare il miglior protocollo per il silenziamento genico a lungo termine nel tipo di cellula. L'incorporazione di controlli che consentano la valutazione degli effetti della somministrazione passiva sulla vitalità cellulare e sulla fisiologia generale è considerata prudente per garantire che l'esposizione ripetuta al mix di somministrazione Accell non introduca cambiamenti indesiderati nello stato fenotipico della cellula. Il knockdown del gene a lungo termine è essenziale quando la stabilità della proteina e/o la progettazione del test richiedono un silenziamento prolungato. Come dimostrato sopra, l'applicazione ripetuta con la miscela di consegna Accell ha portato a un silenziamento continuo fino a 30 giorni. Il flusso di lavoro descritto è relativamente non tossico e compatibile con la trasfezione mediata dai lipidi (consentendo così il knockdown multigene o combinatorio). Questa nuova tecnologia di somministrazione passiva amplia significativamente le opzioni di progettazione sperimentale dei ricercatori consentendo l'uso di cellule che sono storicamente refrattarie alla trasfezione mediata dai lipidi.

Da:

https://f.hubspotusercontent40.net/hubfs/547446/Technology%20Networks/Landing%20Pages/Horizon/September%202021/accell-app-gene-silencing-appnote%20(2).pdf?__hstc=8807082.44b0f6eac84be5818378483b36bfad3b.1601170002551.1635459762179.1635625005867.199&__hssc=8807082.2.1635625005867&__hsfp=1427989272&hsCtaTracking=ce761ed6-4a63-4a6c-944a-2b04aeeda4c2%7C4b4e7d2d-2cb8-4ba4-8110-74a30d6d18ae