Breakthrough in Live Cell Microscopy of 3D Cellular Models. / Innovazione nella microscopia di cellule vive di modelli cellulari 3D.
Breakthrough in Live Cell Microscopy of 3D Cellular Models. The process of the ENEA patent RM2012A000637 is very useful in this application. / Innovazione nella microscopia di cellule vive di modelli cellulari 3D. Il procedimento del brevetto ENEA RM2012A000637 è molto utile in questa applicazione.
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
As an alternative to 2D cell cultures, great efforts have been undertaken in recent years to develop 3D cellular models. The biology of these models seem to match better to the in vivo situation in terms of gene expression, pathway regulation, and phenotype. These 3D models consist of cell clusters (organoids, spheroids) ranging in size from about 150 to 300 μm. They may contain one or more cell types and can be embedded in different extracellular matrices. These cell models are grown in microwell plates with 24 to 96 wells or in special microfluidic chips (Figure 1).
The limitations of fluorescence microscopy in 3D imaging A wide range of microscopic techniques are available for studying 3D cellular models in the lab dish. Although not suited for true 3D imaging, widefield fluorescent microscopy can serve as an entry point to quantitative analysis. In applications where only the size of the spheroid or the global level of fluorescence is of relevance for the project, widefield imaging can even offer particular advantages over more sophisticated technologies because of its very fast image acquisition and minimal phototoxicity.
A variety of different laser-based methodologies allow “real” 3D imaging
• In confocal laser scanning microscopy, a laser beam focused by the objective scans the specimen point by point. The emission is filtered by a pinhole and analyzed by using a photo-multiplier tube (PMT).
• In spinning disk confocal microscopy, multiple image points are simultaneously excited, and the data is acquired using a camera with high sensitivity. This makes spinning disk microscopy suitable for studying dynamic cellular processes in living cells at high speed. The effective exposure of the living cells to the laser light is slightly lower than in confocal laser scanning microscopy because of higher photon efficiency of the detector.
• Single plane illuminated microscopy (SPIM, also referred to as lightsheet microscopy) is based on selective illumination of a thin plane. A camera captures images of the plane at high speed. Phototoxicity and bleaching effects are also extremely low. In the past, the method became very popular for studying the development of zebrafish embryos.
The next level: multiphoton microscopy
Visible light as used by the above-mentioned techniques for single-photon-fluorescence excitation undergoes absorption and scattering in living tissue. In the majority of applications, cellular resolution can only be achieved in areas not more than 50–100 µm away from the surface. In 2-photon microscopy, excitation of the dye occurs by simultaneous absorption of two photons of longer wavelength. To give an example, for excitation of the green-fluorescent-protein, a 480nm continuous-wave laser is used for single photon (confocal or spinning disk) laser scanning microscopy, and 900nm light emitted by a pulsed laser is used for 2-photon excitation. Another important advantage of 2-photon over single-photon excitation is the smaller volume of excitation. The 2-photon effect can just occur in the focal spot of the objective, where the photon flux is very high. In single photon microscopy, however, excitation occurs also above and below the focal plane leading to much higher phototoxicity. Advantages of 2-photon over single-photon excitation can also be seen on the detector side: a pinhole is used in single-photon excitation to filter out all photons that have been generated outside of the focal plane. Because photon emission occurs in all directions, many photons will not be detected as they do not pass through the pinhole. Moreover, photons that were emitted in the direction of the detector, but which have undergone scattering, might not be detected. These technical and physical constraints lead to a rather low photon-detection efficiency. Finally, photon scattering can also lead to “out-of-focus” light. Here, photons that have been generated outside of the focal plane were scattered within the tissue to pass through the pinhole. This effect will cause blurring within the image and becomes particularly prominent at high signal intensity.
Figure 2. Difference in image quality comparing one- and two-photon-excitation for intestinal crypts. Nuclei were stained with DAPI (green) and stained lysozyme is shown in red. A) One-photon-excitation with confocal detection. Excitation is not confined to the focal area of the objective (blue) but dye molecules are also excited in adjacent areas (out-of-focus-light, yellow) along the laser beam. Scattering of photons on both the excitation and emission level lead to reduced sharpness and loss of signal intensity. B) Two-photon-excitation (2PE). Two-photon-excitation can only occur if the light intensity of the laser exceeds a certain threshold. Therefore, 2PE does not lead to any out-of-focus light. In addition, the non-descanned detector has a larger surface area and is located closer to the back focal plane of the objective. Hence, it will capture photons from a wider range of angles. Images acquired with two-photon excitation appear less blurred and show more detail. 3D image stacks were acquired using a 25x, NA1.05 objective. / Differenza nella qualità dell'immagine confrontando l'eccitazione a uno e due fotoni per le cripte intestinali. I nuclei sono stati colorati con DAPI (verde) e il lisozima colorato è mostrato in rosso. A) Eccitazione a un fotone con rilevamento confocale. L'eccitazione non è confinata all'area focale dell'obiettivo (blu) ma le molecole di colorante vengono eccitate anche nelle aree adiacenti (luce fuori fuoco, gialla) lungo il raggio laser. La dispersione dei fotoni sia a livello di eccitazione che di emissione porta a una riduzione della nitidezza e alla perdita di intensità del segnale. B) Eccitazione a due fotoni (2PE). L'eccitazione a due fotoni può verificarsi solo se l'intensità della luce del laser supera una certa soglia. Pertanto, 2PE non porta a nessuna luce fuori fuoco. Inoltre, il rilevatore non scansionato ha una superficie maggiore ed è posizionato più vicino al piano focale posteriore dell'obiettivo. Quindi, catturerà i fotoni da una gamma più ampia di angolazioni. Le immagini acquisite con eccitazione a due fotoni appaiono meno sfocate e mostrano più dettagli. Le pile di immagini 3D sono state acquisite utilizzando un obiettivo NA1.05 da 25x.
In 2-photon microscopy, a pinhole is not needed because photons can just be generated within the focal plane. This allows placing the detector much closer to the objective. Usually, the diameter of the photo-multiplier is also larger allowing detection of photons from a large area at the back focal plane of the objective. Generation of reactive oxygen species (ROS) and photodamage of cells is also of less concern in 2-photon-microscopy. Although laser power is larger compared to single-photon-microscopy, cells seem to be able to eliminate ROS more efficiently because generation of long-lived triplet excited oxygen occurs in a much smaller excitation volume. The numerical aperture (NA) of an objective determines its lateral and axial point-spread-function (PSF) and its resolution within the image plane and across a 3D image stack. In 2D imaging the lateral resolution is the most relevant, and high-quality images with subcellular resolution can already be obtained with a low NA. However, in 3D imaging the axial PSF is of critical importance. While in an ideal system the axial PSF is only about two times larger compared to the lateral PSF, spherical aberrations caused by refractive index mismatch in deep tissue imaging lead to additional distortions and widening of the axial PSF. Therefore, experiments need to be carried out using objectives with NA>1 to obtain high-quality 3D image stacks. The images shown in Figure 4 were either obtained with a conventional dry objective with low NA or the Olympus XLPLN 25x, NA 1.05 (2.0 mm working distance) dedicated water immersed 2-photon objective. While the lateral resolution appears to be sufficient in both examples, the axial resolution is only large enough to identify cells in the x-z- or y-z-plane when the high NA objective was used. At low NA, cells appear as sticks and not as roundish objects.
Figure 3. Comparison of confocal with 2-photon-microscopy. This comparison illustrates the difference in penetration depth of visible light (570 nm, confocal microscopy) with infrared light (1024 nm, 2P-excitation, XLPLN25XSVMP2 objective lens with WD 4 mm and NA 1.0). While images with sufficient signal intensity can only be obtained from the outer 50 µm in confocal images, penetration depth exceeds 150 µm for 2P-excitation at a wavelength of 1024 nm. The panel on the top shows an x-z-projection of the 3D dataset for both techniques. The lower panel shows individual images at different levels within the spheroid. / Confronto tra confocale e microscopia a 2 fotoni. Questo confronto illustra la differenza nella profondità di penetrazione della luce visibile (570 nm, microscopia confocale) con la luce infrarossa (1024 nm, eccitazione 2P, obiettivo XLPLN25XSVMP2 con WD 4 mm e NA 1.0). Mentre le immagini con un'intensità del segnale sufficiente possono essere ottenute solo dai 50 µm esterni nelle immagini confocali, la profondità di penetrazione supera i 150 µm per l'eccitazione 2P a una lunghezza d'onda di 1024 nm. Il pannello in alto mostra una proiezione x-z del set di dati 3D per entrambe le tecniche. Il pannello inferiore mostra le singole immagini a diversi livelli all'interno dello sferoide.
Implementation of multiphoton microscopy on an inverted stage
Historically, multiphoton microscopy was implemented on an upright stage tuned for intravital microscopy in living animals to study brains, spinal cords, tumors, or lymph nodes. This setup is not very well suited for imaging cell culture plates because the stage cannot easily move from well to well if the lens approaches the sample from the top. However, technically it is feasible to mount a tuneable 2-photon laser onto an inverted microscopy stage. In most applications, cells are stained with at least two different dyes (e.g., one to identify the outline of a cell and another one used as a functional biosensor). It is important that at least two dyes or fluorescent proteins can be excited at the same time. Lasers such as the Spectra-Physics InSight DeepSee offer one laser line that can be tuned between 690 and 1300 nm and a second line at a fixed wavelength of 1040 nm. With this combination it is possible to excite two dyes, such as GFP (900 nm) and RFP (1024 nm), simultaneously, which allows scientists to design smarter experiments. Another challenge for using multiphoton microscopy on an inverted microscope is the application of an immersion fluid to fill the gap between the bottom of the wellplate and the front lens of the objective. While closing this gap using a funnel-like adaptor is possible for short working distance lenses, it becomes a real challenge if the working distance exceeds 1–2 mm. The water film that is only kept between the two ends by surface tension needs to be resistant to moving the plate over the objective and axial movements over millimeters. To address this challenge the microscope stage had to be equipped with a specially developed immersion bridge that enables the use of 8mm working distance lenses (Figure 5).
Figure 4. Imaging of tendon samples using either a low or high NA objective in combination with 2P excitation. The cells were expressing GFP. The images obtained with the high NA objective also show the second-harmonic-signal generated by the collagen. The samples were embedded in 0.8% agarose in a 35 mm Petri dish. / Imaging di campioni di tendine utilizzando un obiettivo NA basso o alto in combinazione con l'eccitazione 2P. Le cellule esprimevano GFP. Le immagini ottenute con l'obiettivo NA alto mostrano anche il segnale della seconda armonica generato dal collagene. I campioni sono stati incorporati in agarosio allo 0,8% in una capsula di Petri da 35 mm.
Compound administration
The way compounds are administered to cell cultures is fundamentally different in basic research projects and compound screening. If the number of wells is small—for example, if cells are studied in a single Petri dish or 24-well plate—compounds can be added by using a manual pipette. This can be done shortly before imaging starts or by pausing data acquisition after baseline images have been recorded. One caveat of this procedure is that cells can be displaced by touching the well with the tip of the pipette or by adding the fluid too quickly. Because of the large number of samples in highcontent imaging, compounds need to be applied using dedicated fully multiplexed dispensers. This usually occurs before the start of the experiment and outside of the microscope. Thousands of compounds can be studied in batch mode, but analysis of the kinetics of the pharmacodynamic (PD) effect is almost impossible. Imaging of the PD effect is linked to an endpoint measurement, such as cell death. By using microfluidic compound administration techniques, we have started to develop a system where compounds can be administered to the samples in a tightly controlled and dynamic fashion. In our setup, we are using microfluidic pressure-driven pumps that allow administration of compounds at a given concentration into up to 24 wells at flow rates ranging practically from 5–20 ul/min. Using microfluidic chip technology, it is even possible to serialize compound administration to several replicates and create data sets with higher statistical power.
Figure 5. Conceptual differences for imaging 2D and 3D cellular models. Very often 24-well plates are used, for which spatial dimensions are indicated in A. (A) Objectives with short working distances are used in combination with water or silicone oil to achieve high numerical aperture (NA) and good refractive index matching. (B) The distance between the objective and the object can be in the range of several mm in many 3D cellular models. In a conventional microscopy setup, only dry lenses can be used, as the immersion fluid cannot be kept between front lens and the plate. As a consequence, NA will be significantly lower, leading in particular to dramatically reduced axial resolution. (C) In specialized setups, the immersion fluid can constantly be applied even if long working distance lenses are used. High NA can be achieved by using dedicated objectives developed for MPM applications. / Differenze concettuali per l'imaging di modelli cellulari 2D e 3D. Molto spesso vengono utilizzate piastre da 24 pozzetti, per le quali le dimensioni spaziali sono indicate in A. (A) Gli obiettivi con brevi distanze di lavoro vengono utilizzati in combinazione con acqua o olio di silicone per ottenere un'elevata apertura numerica (NA) e un buon adattamento dell'indice di rifrazione. (B) La distanza tra l'obiettivo e l'oggetto può essere nell'intervallo di diversi mm in molti modelli cellulari 3D. In una configurazione di microscopia convenzionale, possono essere utilizzate solo lenti asciutte, poiché il fluido di immersione non può essere trattenuto tra la lente frontale e la piastra. Di conseguenza, NA sarà significativamente inferiore, portando in particolare a una risoluzione assiale drasticamente ridotta. (C) In configurazioni specializzate, il fluido di immersione può essere applicato costantemente anche se vengono utilizzate lenti a lunga distanza di lavoro. Un NA elevato può essere raggiunto utilizzando obiettivi dedicati sviluppati per applicazioni MPM.
Conclusions
In the past, analysis of 3D cellular models at good resolution was challenging, particularly during time-lapse imaging in multiwell plates. Using a modified inverted microscope, it is possible to efficiently address basic biology questions as well as compound effects in 3D cellular models. The multiphoton microscope presented here bridges the gap between high-content imaging and a classical research microscope. While the optical quality of the image data is certainly outstanding, the throughput is limited, allowing scientists to study approximately 20–40 spheroids in one hour at isotropic micro-meter resolution. This trade-off will be acceptable in many projects where only a few compounds should undergo in-depth profiling. For larger screening studies, dedicated high-contentimaging systems will still be the technology of choice. However, future improvements in hardware design as well as smarter microscopy-control-software will certainly enhance the output of highend-microscopes and open up new opportunities for their use in drug discovery.
ITALIANO
Un nuovo metodo consente la microscopia di cellule vive 3D ad alta risoluzione per lo screening dei composti a media produttività.
Introduzione In molte applicazioni della scoperta di farmaci e della ricerca di base, le classiche colture cellulari 2D (monostrato di cellule su coprioggetti rivestiti o in piastre multipozzetto) sono attualmente sostituite da modelli cellulari 3D più complessi. Questi modelli comprendono, ad esempio, sferoidi cresciuti da tumori, cellule intestinali o cerebrali, espianti di organi o co-colture cellulari complesse. A causa delle loro dimensioni in entrambe le direzioni laterale e assiale, la microscopia a cellule vive a risoluzione cellulare o anche subcellulare è impegnativa utilizzando tecniche convenzionali come la microscopia a fluorescenza a campo ampio e la microscopia confocale od a disco rotante a scansione laser. Anche la microscopia a foglio luminoso, che è stata applicata con successo all'imaging delle larve di zebrafish, non può essere utilizzata come strumento universale per l'imaging di modelli cellulari 3D. A seconda del tipo di microscopio utilizzato per l'imaging, le sfide includono la fototossicità, una risoluzione assiale insufficiente o la necessità di attrezzature speciali per il montaggio del campione. In una collaborazione tra Novartis e Olympus, è stata sviluppata una versione modificata di un microscopio multifotone invertito per soddisfare le esigenze dell'imaging time-lapse 3D a lungo termine ad alta risoluzione di modelli cellulari 3D. In questo progetto è stato necessario affrontare diverse sfide chiave: è necessario un laser 2P a doppia linea per consentire l'eccitazione simultanea di almeno due fluorocromi. In secondo luogo, è necessario utilizzare una lente ad immersione in acqua a lunga distanza di lavoro (4 mm) con un'apertura numerica elevata (NA) di almeno 1,0 per creare pile di immagini con una risoluzione assiale sufficiente. Anche la somministrazione di sostanze mediante perfusione microfluidica deve essere inclusa per una somministrazione efficiente dei composti e per lo scambio di tamponi. Il sistema FLUOVIEW™ FVMPE-RS discusso qui consente l'imaging 3D efficiente di colture cellulari coltivate in piastre standard da 24 a 94 pozzetti per diversi giorni e colma il divario tra microscopi di ricerca e sistemi di imaging ad alto contenuto. In Novartis il sistema viene utilizzato abitualmente per analisi di profilo dei composti a media produttività, compresi studi su tumori e sferoidi epatici, espianti di muscoli, pelle e tessuti intestinali, nonché varie co-colture.
Formati di analisi classici basati su colture cellulari 2D
Per molti decenni, le cellule sono state piastrate in piastre Petri o poste in piastre multipozzetto per studi biologici di base o per testare l'effetto dei composti sulla funzione cellulare o sul fenotipo. È spesso molto evidente che la placcatura di cellule su plastica o vetro di solito produce cellule fenotipicamente diverse rispetto alle condizioni in vivo, anche quando le piastre sono rivestite con una miscela di proteine come laminina, Matrigel o collagene. In molti casi, le cellule tendono a espandersi ed a formare estensioni che formano forti legami con il rivestimento. Inoltre, gli studi sulla meccanotrasduzione nelle cellule hanno trovato prove evidenti che le cellule percepiscono la rigidità del loro ambiente e, di conseguenza, adattano i loro percorsi molecolari, la funzione e il fenotipo. Pertanto, l'uso di colture 2D ha un valore traslazionale limitato e spesso i risultati ottenuti nel modello cellulare in vitro non sono completamente correlati con i risultati in modelli animali o soggetti umani.
Modelli cellulari 3D per creare un valore traslazionale avanzato
In alternativa alle colture cellulari 2D, negli ultimi anni sono stati compiuti grandi sforzi per sviluppare modelli cellulari 3D. La biologia di questi modelli sembra corrispondere meglio alla situazione in vivo in termini di espressione genica, regolazione del percorso e fenotipo. Questi modelli 3D sono costituiti da ammassi cellulari (organoidi, sferoidi) di dimensioni variabili da circa 150 a 300 μm. Possono contenere uno o più tipi di cellule e possono essere incorporati in diverse matrici extracellulari. Questi modelli cellulari vengono coltivati in piastre di micropozzetti da 24 a 96 pozzetti o in speciali chip microfluidici (Figura 1).
I limiti della microscopia a fluorescenza nell'imaging 3D.
È disponibile un'ampia gamma di tecniche microscopiche per lo studio di modelli cellulari 3D nel piatto da laboratorio. Sebbene non sia adatta per l'imaging 3D reale, la microscopia a fluorescenza ad ampio campo può fungere da punto di ingresso per l'analisi quantitativa. Nelle applicazioni in cui solo la dimensione dello sferoide o il livello globale di fluorescenza è rilevante per il progetto, l'imaging widefield può anche offrire particolari vantaggi rispetto a tecnologie più sofisticate a causa della sua acquisizione dell'immagine molto veloce e della minima fototossicità.
Una varietà di diverse metodologie basate sul laser consentono l'imaging 3D "reale"
• Nella microscopia confocale a scansione laser, un raggio laser focalizzato dall'obiettivo scansiona il campione punto per punto. L'emissione viene filtrata da un foro stenopeico e analizzata utilizzando un tubo fotomoltiplicatore (PMT).
• Nella microscopia confocale a disco rotante, più punti dell'immagine vengono eccitati contemporaneamente ed i dati vengono acquisiti utilizzando una telecamera ad alta sensibilità. Ciò rende la microscopia a disco rotante adatta allo studio dei processi cellulari dinamici nelle cellule viventi ad alta velocità. L'esposizione effettiva delle cellule viventi alla luce laser è leggermente inferiore rispetto alla microscopia a scansione laser confocale a causa della maggiore efficienza dei fotoni del rivelatore.
• La microscopia illuminata a piano singolo (SPIM, denominata anche microscopia a foglio luminoso) si basa sull'illuminazione selettiva di un piano sottile. Una telecamera cattura le immagini dell'aereo ad alta velocità. Anche la fototossicità e gli effetti sbiancanti sono estremamente bassi. In passato, il metodo è diventato molto popolare per studiare lo sviluppo degli embrioni di zebrafish.
Il livello successivo: microscopia multifotonica
La luce visibile utilizzata dalle tecniche sopra menzionate per l'eccitazione a fluorescenza a singolo fotone subisce assorbimento e diffusione nel tessuto vivente. Nella maggior parte delle applicazioni, la risoluzione cellulare può essere ottenuta solo in aree a non più di 50–100 µm di distanza dalla superficie. Nella microscopia a 2 fotoni, l'eccitazione del colorante avviene per assorbimento simultaneo di due fotoni di lunghezza d'onda maggiore. Per fare un esempio, per l'eccitazione della proteina fluorescente verde, un laser a onda continua da 480 nm viene utilizzato per la microscopia a scansione laser a singolo fotone (confocale o disco rotante) e la luce emessa da un laser pulsato a 900 nm viene utilizzata per 2 fotoni eccitazione. Un altro importante vantaggio dell'eccitazione a 2 fotoni rispetto all'eccitazione a fotone singolo è il minor volume di eccitazione. L'effetto a 2 fotoni può verificarsi solo nel punto focale dell'obiettivo, dove il flusso di fotoni è molto elevato. Nella microscopia a singolo fotone, tuttavia, l'eccitazione si verifica anche sopra e sotto il piano focale, portando a una fototossicità molto più elevata. I vantaggi dell'eccitazione a 2 fotoni rispetto all'eccitazione a fotone singolo possono essere visti anche dal lato del rivelatore: un foro stenopeico viene utilizzato nell'eccitazione a fotone singolo per filtrare tutti i fotoni che sono stati generati al di fuori del piano focale. Poiché l'emissione di fotoni avviene in tutte le direzioni, molti fotoni non verranno rilevati poiché non passano attraverso il foro stenopeico. Inoltre, i fotoni che sono stati emessi nella direzione del rivelatore, ma che hanno subito una diffusione, potrebbero non essere rilevati. Questi vincoli tecnici e fisici portano a un'efficienza di rilevamento dei fotoni piuttosto bassa. Infine, la diffusione dei fotoni può anche portare alla luce "fuori fuoco". Qui, i fotoni che sono stati generati al di fuori del piano focale sono stati dispersi all'interno del tessuto per passare attraverso il foro stenopeico. Questo effetto causerà sfocatura all'interno dell'immagine e diventa particolarmente evidente ad alta intensità del segnale.
Nella microscopia a 2 fotoni, non è necessario un foro stenopeico perché i fotoni possono essere generati solo all'interno del piano focale. Ciò consente di posizionare il rilevatore molto più vicino all'obiettivo. Solitamente, anche il diametro del fotomoltiplicatore è maggiore consentendo il rilevamento di fotoni da un'ampia area sul piano focale posteriore dell'obiettivo. Anche la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e il fotodanneggiamento delle cellule sono meno preoccupanti nella microscopia a 2 fotoni. Sebbene la potenza del laser sia maggiore rispetto alla microscopia a singolo fotone, le cellule sembrano essere in grado di eliminare i ROS in modo più efficiente perché la generazione di ossigeno eccitato a tripletto di lunga durata avviene in un volume di eccitazione molto più piccolo. L'apertura numerica (NA) di un obiettivo determina la sua funzione di diffusione del punto laterale e assiale (PSF) e la sua risoluzione all'interno del piano dell'immagine e attraverso una pila di immagini 3D. Nell'imaging 2D la risoluzione laterale è la più rilevante e immagini di alta qualità con risoluzione subcellulare possono già essere ottenute con un basso NA. Tuttavia, nell'imaging 3D la PSF assiale è di fondamentale importanza. Mentre in un sistema ideale la PSF assiale è solo circa due volte più grande rispetto alla PSF laterale, le aberrazioni sferiche causate dalla mancata corrispondenza dell'indice di rifrazione nell'imaging dei tessuti profondi portano a ulteriori distorsioni e all'allargamento della PSF assiale. Pertanto, è necessario eseguire esperimenti utilizzando obiettivi con NA>1 per ottenere stack di immagini 3D di alta qualità. Le immagini mostrate nella Figura 4 sono state ottenute con un obiettivo a secco convenzionale con NA basso o con l'obiettivo a 2 fotoni immerso in acqua dedicato Olympus XLPLN 25x, NA 1,05 (distanza di lavoro di 2,0 mm). Mentre la risoluzione laterale sembra essere sufficiente in entrambi gli esempi, la risoluzione assiale è sufficiente solo per identificare le cellule nel piano x-z o y-z quando è stato utilizzato l'obiettivo NA alto. A basso NA, le cellule appaiono come bastoncini e non come oggetti tondeggianti.
Implementazione della microscopia multifotone su uno stadio invertito.
Storicamente, la microscopia multifotone è stata implementata su un palco verticale sintonizzato per la microscopia intravitale negli animali viventi per studiare il cervello, il midollo spinale, i tumori oi linfonodi. Questa configurazione non è molto adatta per l'imaging di piastre di coltura cellulare perché il tavolino non può spostarsi facilmente da un pozzo all'altro se l'obiettivo si avvicina al campione dall'alto. Tuttavia, tecnicamente è possibile montare un laser a 2 fotoni sintonizzabile su uno stadio di microscopia invertita. Nella maggior parte delle applicazioni, le cellule vengono colorate con almeno due coloranti diversi (ad esempio, uno per identificare il contorno di una cellula e un altro utilizzato come biosensore funzionale). È importante che almeno due coloranti o proteine fluorescenti possano essere eccitati contemporaneamente. Laser come Spectra-Physics InSight DeepSee offrono una linea laser che può essere sintonizzata tra 690 e 1300 nm e una seconda linea a una lunghezza d'onda fissa di 1040 nm. Con questa combinazione è possibile eccitare due coloranti, come GFP (900 nm) e RFP (1024 nm), contemporaneamente, il che consente agli scienziati di progettare esperimenti più intelligenti. Un'altra sfida per l'utilizzo della microscopia multifotone su un microscopio invertito è l'applicazione di un fluido di immersione per riempire lo spazio tra il fondo della piastra a pozzetti e la lente anteriore dell'obiettivo. Mentre colmare questo divario utilizzando un adattatore a imbuto è possibile per obiettivi a breve distanza di lavoro, diventa una vera sfida se la distanza di lavoro supera 1–2 mm. Il film d'acqua che viene trattenuto solo tra le due estremità dalla tensione superficiale deve resistere allo spostamento della piastra sull'obiettivo ed ai movimenti assiali di millimetri. Per affrontare questa sfida, il tavolino del microscopio doveva essere dotato di un ponte ad immersione appositamente sviluppato che consentisse l'uso di lenti a distanza di lavoro di 8 mm (Figura 5).
Amministrazione composta
Il modo in cui i composti vengono somministrati alle colture cellulari è fondamentalmente diverso nei progetti di ricerca di base e nello screening dei composti. Se il numero di pozzetti è piccolo, ad esempio se le cellule vengono studiate in una singola capsula di Petri o in una piastra da 24 pozzetti, è possibile aggiungere composti utilizzando una pipetta manuale. Questo può essere fatto poco prima dell'inizio dell'imaging o mettendo in pausa l'acquisizione dei dati dopo che le immagini di base sono state registrate. Un avvertimento di questa procedura è che le cellule possono essere spostate toccando il pozzetto con la punta della pipetta o aggiungendo il fluido troppo rapidamente. A causa dell'elevato numero di campioni nell'imaging ad alto contenuto, i composti devono essere applicati utilizzando erogatori dedicati completamente multiplexati. Questo di solito si verifica prima dell'inizio dell'esperimento e al di fuori del microscopio. Migliaia di composti possono essere studiati in modalità batch, ma l'analisi della cinetica dell'effetto farmacodinamico (PD) è quasi impossibile. L'imaging dell'effetto PD è collegato a una misurazione dell'endpoint, come la morte cellulare. Utilizzando tecniche di somministrazione di composti microfluidici, abbiamo iniziato a sviluppare un sistema in cui i composti possono essere somministrati ai campioni in modo strettamente controllato e dinamico. Nella nostra configurazione, utilizziamo pompe a pressione microfluidica che consentono la somministrazione di composti a una data concentrazione in un massimo di 24 pozzetti con portate che vanno praticamente da 5 a 20 ul/min. Utilizzando la tecnologia dei chip microfluidici, è persino possibile serializzare la somministrazione di composti su più repliche e creare set di dati con una potenza statistica maggiore.
Conclusioni
In passato, l'analisi di modelli cellulari 3D con una buona risoluzione era impegnativa, in particolare durante l'imaging time-lapse in piastre multipozzetto. Utilizzando un microscopio invertito modificato, è possibile affrontare in modo efficiente questioni di biologia di base nonché effetti composti in modelli cellulari 3D. Il microscopio multifotone presentato qui colma il divario tra l'imaging ad alto contenuto e un microscopio da ricerca classico. Mentre la qualità ottica dei dati dell'immagine è certamente eccezionale, il rendimento è limitato, consentendo agli scienziati di studiare circa 20-40 sferoidi in un'ora con una risoluzione isotropica di micrometri. Questo compromesso sarà accettabile in molti progetti in cui solo pochi composti dovrebbero essere sottoposti a una profilazione approfondita. Per studi di screening più ampi, i sistemi di imaging dedicati ad alto contenuto continueranno a essere la tecnologia preferita. Tuttavia, i futuri miglioramenti nella progettazione dell'hardware e il software di controllo della microscopia più intelligente miglioreranno sicuramente la produzione di microscopi di fascia alta e apriranno nuove opportunità per il loro utilizzo nella scoperta di farmaci.
Da:
https://f.hubspotusercontent40.net/hubfs/547446/Technology%20Networks/Landing%20Pages/Olympus/eBook_Advanced_3DCellular_Models.pdf?__hstc=8807082.44b0f6eac84be5818378483b36bfad3b.1601170002551.1637723101130.1637757744997.212&__hssc=8807082.1.1637757744997&__hsfp=2530671978&hsCtaTracking=255c84f9-9218-455a-8eab-d6d31717e14c%7C2c6f4b44-5063-4bda-919c-4b50496a3fed
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