Detection of RNA contamination in Mammalian DNA preparations / Rilevazione della contaminazione da RNA nelle preparazioni di DNA dei mammiferi

Detection of RNA contamination in Mammalian DNA preparations / Rilevazione della contaminazione da RNA nelle preparazioni di DNA dei mammiferi

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Figure 1: The bar graph compares the concentration results of various mixtures of DNA and RNA using different approaches. The purple bars represent data using a broad range dsDNA assay kit. This assay uses a fluorescence dye, that specifically binds DNA. The blue bars represent the data when a direct A260 absorbance is used to calculate the DNA concentration. The red bars represent the theoretical target DNA concentrations. The green bars represent the Acclaro-corrected DNA concentrations. The DNA and RNA preparations used for the DNA/ RNA mixtures were isolated from HeLa cells. Error bars represent the standard deviation from the mean. / Il grafico a barre confronta i risultati di concentrazione di varie miscele di DNA e RNA utilizzando approcci diversi. Le barre viola rappresentano i dati utilizzando un kit di test dsDNA ad ampio raggio. Questo test utilizza un colorante fluorescente, che lega in modo specifico il DNA. Le barre blu rappresentano i dati quando viene utilizzata un'assorbanza A260 diretta per calcolare la concentrazione di DNA. Le barre rosse rappresentano le concentrazioni teoriche di DNA target. Le barre verdi rappresentano le concentrazioni di DNA corrette da Acclaro. Le preparazioni di DNA e RNA utilizzate per le miscele DNA/RNA sono state isolate dalle cellule HeLa. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard dalla media.

Using advanced UV-Vis algorithms to improve specificity

Introduction 

Quantification of nucleic acids has traditionally been performed by determining the UV absorbance at 3 analytical wavelengths: 230 nm, 260 nm, and 280 nm. The information derived from these absorbance measurements allows scientists to measure nucleic acid concentration and to have an indication of sample purity. A disadvantage of this approach is the lack of specificity. Thus, any contaminant that absorbs at these wavelengths will lead to inaccuracies in a nucleic acid concentration result. The Thermo Scientific™ NanoDrop™ One/OneC Spectrophotomer features Thermo Scientific™ Acclaro™ Intelligence Technology Software which uses full-spectrum data and advanced algorithms to identify common nucleic acid contaminants and provide corrected nucleic acid concentrations. In this technical note, we show how a newly introduced feature in Acclaro software allows users to detect and correct for RNA contamination in DNA preparations or DNA contamination in RNA preparations.

Materials and methods

 DNA and RNA were prepared from HeLa cells, treated with RNase or DNase to remove contaminant nucleic acid, and dialyzed in TE buffer, pH 8.0. Initial stock concentrations were determined on the NanoDrop One spectrophotometer against a TE blank. Various mixtures of DNA and RNA were made (as shown in Figure 1), and triplicates of each sample were read on the instrument. A fresh 2.0 µL aliquot of the appropriate mixture was used for each replicate. 

The following DNA concentration results were calculated: • Theoretical DNA concentration: baseline corrected A260*50 ng/µL *(%DNA/100).

 • Uncorrected DNA concentration: baseline corrected A260 *50 ng/µL. 

• Acclaro-corrected DNA concentration: Acclaro-corrected A260 *50 ng/µL

The theoretical, uncorrected, and Acclaro-corrected DNA concentrations were compared to those obtained with a DNA-specific fluorescent assay. Fluorescence assays were performed using a broad range dsDNA assay kit and a fluorescence instrument. A standard curve was generated according to the assay kit’s protocol. For this assay, standards were prepared by adding 10 µL of the appropriate DNA standard to 200 µL of working solution. Nucleic acid samples were then prepared by adding 2.0 µL of sample to 200 µL of working solution. DNA standards and samples were incubated at room temperature for 5 minutes and then read on the fluorescence instrument. Mean DNA concentrations and standard deviations for each sample are shown in Figure 1. Results When calculating DNA concentration in the presence of contaminating RNA, the highest degree of inaccuracy was observed when uncorrected A260 absorbance was used to calculate the DNA concentration. Both macromolecules (i.e., RNA and DNA) absorb light at 260 nm; therefore, using absorbance at 260 nm to calculate the concentration of DNA can lead to an overestimation of the actual concentration of DNA in a sample. The Acclaro-corrected results (green bars) demonstrate that greater accuracy is achieved in the determination of DNA concentration when using the Acclaro feature. The Acclaro algorithm uses the full spectral data in conjunction with multivariate mathematics to specifically determine the concentration of DNA in a DNA/RNA mixture. The DNA concentrations obtained after Acclaro correction were much closer to the those obtained by using a DNA-specific fluorescence dye.

Conclusion

 RNA contamination in genomic DNA preparations is a common issue in molecular biology workflows. When measuring samples with traditional spectrometry, copurified RNA will artificially inflate the concentration of DNA. Although using specific DNA-binding dyes may provide a more accurate determination of DNA concentration than absorbance at 260 nm, contamination of a DNA sample with copurified RNA can have adverse effects in modern genomic workflows. We demonstrated that by using full spectral data and multivariate mathematical algorithms, researchers can overcome the disadvantages of both type of assays mentioned. The Acclaro software that runs the Nanodrop One spectrophotometer allows the identification of RNA contamination in a DNA sample and provides a corrected concentration result. These two factors will allow molecular biologists to quickly troubleshoot difficult extractions and improve downstream results. 

ITALIANO

Utilizzo di algoritmi UV-Vis avanzati per migliorare la specificità

Introduzione

La quantificazione degli acidi nucleici è stata tradizionalmente eseguita determinando l'assorbanza UV a 3 lunghezze d'onda analitiche: 230 nm, 260 nm e 280 nm. Le informazioni derivate da queste misurazioni dell'assorbanza consentono agli scienziati di misurare la concentrazione di acido nucleico e di avere un'indicazione della purezza del campione. Uno svantaggio di questo approccio è la mancanza di specificità. Pertanto, qualsiasi contaminante che assorbe a queste lunghezze d'onda porterà a imprecisioni nel risultato della concentrazione di acido nucleico. Lo spettrofotometro Thermo Scientific™ NanoDrop™ One/OneC è dotato del software Thermo Scientific™ Acclaro™ Intelligence Technology che utilizza dati a spettro completo ed algoritmi avanzati per identificare i contaminanti comuni degli acidi nucleici e fornire concentrazioni corrette di acido nucleico. In questa nota tecnica, mostriamo come una funzionalità introdotta di recente nel software Acclaro consente agli utenti di rilevare e correggere la contaminazione da RNA nelle preparazioni di DNA o la contaminazione da DNA nelle preparazioni di RNA.

Materiali e metodi

 DNA e RNA sono stati preparati da cellule HeLa, trattati con RNasi o DNasi per rimuovere l'acido nucleico contaminante e dializzati in tampone TE, pH 8,0. Le concentrazioni iniziali dello stock sono state determinate sullo spettrofotometro NanoDrop One rispetto a un bianco TE. Sono state realizzate varie miscele di DNA e RNA (come mostrato nella Figura 1) e sullo strumento sono stati letti triplicati di ciascun campione. Per ogni replica è stata utilizzata un'aliquota fresca di 2,0 µl della miscela appropriata.

Sono stati calcolati i seguenti risultati della concentrazione di DNA: 

• Concentrazione teorica di DNA: A260*50 ng/µL corretto al basale *(%DNA/100).

 • Concentrazione di DNA non corretta: A260 corretto al basale *50 ng/µL.

• Concentrazione di DNA con correzione per acclaro: A260 con correzione per acclaro *50 ng/µL

Le concentrazioni di DNA teoriche, non corrette e corrette per Acclaro sono state confrontate con quelle ottenute con un test fluorescente specifico del DNA. I test di fluorescenza sono stati eseguiti utilizzando un kit di test dsDNA ad ampia gamma e uno strumento di fluorescenza. È stata generata una curva standard secondo il protocollo del kit di analisi. Per questo test, gli standard sono stati preparati aggiungendo 10 µ l dello standard di DNA appropriato a 200 µ l di soluzione di lavoro. I campioni di acido nucleico sono stati quindi preparati aggiungendo 2,0 µl di campione a 200 µl di soluzione di lavoro. Gli standard ed i campioni di DNA sono stati incubati a temperatura ambiente per 5 minuti e quindi letti sullo strumento a fluorescenza. Le concentrazioni medie di DNA e le deviazioni standard per ciascun campione sono mostrate nella Figura 1. Risultati Quando si calcola la concentrazione di DNA in presenza di RNA contaminante, è stato osservato il massimo grado di imprecisione quando è stata utilizzata un'assorbanza A260 non corretta per calcolare la concentrazione di DNA. Entrambe le macromolecole (cioè RNA e DNA) assorbono la luce a 260 nm; pertanto, l'utilizzo dell'assorbanza a 260 nm per calcolare la concentrazione di DNA può portare a una sovrastima della concentrazione effettiva di DNA in un campione. I risultati corretti da Acclaro (barre verdi) dimostrano che si ottiene una maggiore precisione nella determinazione della concentrazione di DNA quando si utilizza la funzione Acclaro. L'algoritmo di Acclaro utilizza i dati spettrali completi insieme alla matematica multivariata per determinare in modo specifico la concentrazione di DNA in una miscela DNA/RNA. Le concentrazioni di DNA ottenute dopo la correzione di Acclaro erano molto più vicine a quelle ottenute utilizzando un colorante a fluorescenza specifico per il DNA.

Conclusione

La contaminazione dell'RNA nelle preparazioni di DNA genomico è un problema comune nei flussi di lavoro di biologia molecolare. Quando si misurano i campioni con la spettrometria tradizionale, l'RNA copurificato gonfia artificialmente la concentrazione di DNA. Sebbene l'uso di specifici coloranti che legano il DNA possa fornire una determinazione più accurata della concentrazione del DNA rispetto all'assorbanza a 260 nm, la contaminazione di un campione di DNA con RNA copurificato può avere effetti negativi nei moderni flussi di lavoro genomici. Abbiamo dimostrato che utilizzando dati spettrali completi ed algoritmi matematici multivariati, i ricercatori possono superare gli svantaggi di entrambi i tipi di test menzionati. Il software Acclaro che esegue lo spettrofotometro Nanodrop One consente l'identificazione della contaminazione da RNA in un campione di DNA e fornisce un risultato di concentrazione corretto. Questi due fattori consentiranno ai biologi molecolari di risolvere rapidamente i problemi di estrazioni difficili e migliorare i risultati a valle.

Da:

https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Application-Notes/EB53212-acclaro-nucleic-acid-resource-guide.pdf?cid=7014z000000iOhm&tracksrc=IntEm316851&cta=link_5_6&elq_mid=23060&elq_cid=4639296