NanoDrop One sample contaminant identification / NanoDrop Un campione di identificazione del contaminante

NanoDrop One sample contaminant identification / NanoDrop Un campione di identificazione del contaminante

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Frequently Asked Questions

 The Thermo Scientific™ NanoDrop™ One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer is designed to help research scientists achieve success in downstream applications by accurately quantifying DNA, RNA and protein samples using only 1-2 μL. Built with novel Thermo Scientific™ Acclaro™ Sample Intelligence technology, the NanoDrop One instrument provides more information about sample quality by identifying common contaminants and delivering true sample concentrations. Here are answers to common questions about the Acclaro Contaminant Identification (ID) feature.

 1. How does the Acclaro Contaminant ID feature work on the NanoDrop One Spectrophotometer? 

The Acclaro Contaminant ID feature uses a chemometric approach to analyze the chemical components present in a sample. This type of analysis has been used previously in Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and near-infrared systems (e.g., Thermo Scientific™ Nicolet Spectrometers). The Acclaro algorithms rely on a reference library of spectra. These algorithms are then applied to the sample spectrum, and the software can make predictions about a sample’s contaminants by using chemometric mathematical principles.

2. In which NanoDrop One application is the Acclaro Contaminant ID feature implemented?

Contaminant ID is implemented in the dsDNA, RNA and Protein A280 Applications.

3. What contaminants can the Acclaro Contaminant ID technology detect?

 The Acclaro reference libraries currently support detection of RNA, protein, phenol, and guanidine HCl in dsDNA samples. They also support detection of DNA, protein, phenol, and guanidine isothiocyanate in RNA samples. Finally, they allows detection of DNA in protein samples. In the future, additional contaminants will be added to the libraries.

4. Are the Acclaro Contaminant ID algorithms applied to all sample concentrations? 

No, in the dsDNA and RNA applications the Acclaro Contaminant ID algorithms are applied to samples at different absorbance ranges based on the contaminant. In the protein A280 application, the Acclaro Contaminant ID algorithms are applied to all samples regardless of concentration. 

5. How do you read the Acclaro Contaminant ID results?

This Results screen shows that the Acclaro algorithms have detected contaminants in this DNA sample, as represented by the yellow triangle. To find out what contaminants the Acclaro software has identified and to obtain the corrected DNA concentration, simply tap the yellow icon to open the Contaminant Analysis screen shown below.

The Acclaro Contaminant Analysis screen presents important information about the sample. The original concentration and purity ratio results are shown on the top row. This is the calculated concentration result (Original) before contaminant corrections have been applied. The second row labeled “Corrected” shows two values. The first value is the corrected concentration of the analyte in the sample in ng/μL (the analyte in this example is dsDNA as indicated in the lower left corner of the screen). The Corrected result is the analyte concentration after contaminant correction has been applied. This value is the software-predicted concentration for the pure nucleic acid component in the sample. The second value is the %CV, which represents the confidence in the prediction. The lower the %CV number, the more confident we are in the corrected concentration predicted by the software. The third row identifies the impurity that is present (RNA, protein, phenol, guanidine HCl, or guanidine isothiocyanate) and reports how much absorbance at 260 nm is contributed by the contaminant. In this case, the %CV represents the confidence in the contaminant identity prediction. 

6. How do we use Acclaro Contaminant ID results in workflows? 

The Acclaro Contaminant ID feature gives customers two important pieces of information. First, the Contaminant ID feature identifies specific contaminants that are likely to be present in the sample. The identification of the potential contaminants in the sample can help scientists troubleshoot difficult extractions or purifications and make decisions regarding sample use in downstream experiments. Second, the Contaminant ID gives customers a corrected concentration. When setting up downstream reactions where DNA concentration is a critical parameter (e.g., PCR), the corrected concentration will help scientists ensure the success of downstream experiments. 

7. What accuracy and sensitivity can I expect from the Acclaro Contaminant ID feature, and what factors affect the accuracy of the result?

 Large sets of known mixtures of analytes “spiked” with contaminants were measured on the NanoDrop One instrument during the development of this feature. In general, the corrected nucleic acid result (the software-predicted concentration) was within 10% of the actual concentration. The sensitivity of Acclaro Contaminant ID depends on the contaminant’s molar absorptivity relative to the analyte of interest (nucleic acid or protein). Phenol has a very high molar absorptivity, therefore, it takes very little phenol to affect the spectrum and generate a corrected concentration for the analyte. Protein has a low molar absorptivity relative to dsDNA, therefore, it takes a large amount of protein to affect the spectrum.

ITALIANO

Domande frequenti

 Lo spettrofotometro UV-Vis Thermo Scientific™ NanoDrop™ a un microvolume è progettato per aiutare i ricercatori a raggiungere il successo nelle applicazioni a valle quantificando accuratamente campioni di DNA, RNA e proteine ​​utilizzando solo 1-2 μL. Costruito con la nuova tecnologia Thermo Scientific™ Acclaro™ Sample Intelligence, lo strumento NanoDrop One fornisce maggiori informazioni sulla qualità del campione identificando i contaminanti comuni e fornendo vere concentrazioni del campione. Di seguito sono riportate le risposte alle domande più frequenti sulla funzione di identificazione dei contaminanti (ID) di Acclaro.

 1. Come funziona la funzione Acclaro Contaminant ID sullo spettrofotometro NanoDrop One?

La funzione Acclaro Contaminant ID utilizza un approccio chemiometrico per analizzare i componenti chimici presenti in un campione. Questo tipo di analisi è stato utilizzato in precedenza nella spettroscopia a infrarossi in trasformata di Fourier (FTIR) e nei sistemi nel vicino infrarosso (ad es. Spettrometri Nicolet Thermo Scientific). Gli algoritmi di Acclaro si basano su una libreria di riferimento di spettri. Questi algoritmi vengono quindi applicati allo spettro del campione ed il software può fare previsioni sui contaminanti di un campione utilizzando principi matematici chemiometrici.

2. In quale applicazione NanoDrop One è implementata la funzione Acclaro Contaminant ID?

L'ID del contaminante è implementato nelle applicazioni dsDNA, RNA e Protein A280.

3. Quali contaminanti può rilevare la tecnologia Acclaro Contaminant ID?

 Le librerie di riferimento Acclaro attualmente supportano il rilevamento di RNA, proteine, fenoli e guanidina HCl nei campioni di dsDNA. Supportano anche il rilevamento di DNA, proteine, fenoli e isotiocianato di guanidina nei campioni di RNA. Infine, consentono il rilevamento del DNA nei campioni di proteine. In futuro verranno aggiunti ulteriori contaminanti alle biblioteche.

4. Gli algoritmi di Acclaro Contaminant ID vengono applicati a tutte le concentrazioni del campione?

No, nelle applicazioni dsDNA e RNA gli algoritmi Acclaro Contaminant ID vengono applicati a campioni con intervalli di assorbanza diversi in base al contaminante. Nell'applicazione della proteina A280, gli algoritmi di Acclaro Contaminant ID vengono applicati a tutti i campioni indipendentemente dalla concentrazione. 

5. Come si leggono i risultati dell'Acclaro Contaminant ID?

Questa schermata dei risultati mostra che gli algoritmi di Acclaro hanno rilevato contaminanti in questo campione di DNA. Per scoprire quali contaminanti ha identificato il software Acclaro e per ottenere la corretta concentrazione di DNA, è sufficiente toccare l'icona gialla per aprire la schermata Analisi dei contaminanti mostrata di seguito.

La schermata Acclaro Contaminant Analysis presenta informazioni importanti sul campione. I risultati originali della concentrazione e del rapporto di purezza sono mostrati nella riga superiore. Questo è il risultato della concentrazione calcolata (Originale) prima dell'applicazione delle correzioni dei contaminanti. La seconda riga denominata "Corretto" mostra due valori. Il primo valore è la concentrazione corretta dell'analita nel campione in ng/μL (l'analita in questo esempio è dsDNA come indicato nell'angolo inferiore sinistro dello schermo). Il risultato corretto è la concentrazione dell'analita dopo l'applicazione della correzione del contaminante. Questo valore è la concentrazione prevista dal software per il componente di acido nucleico puro nel campione. Il secondo valore è il %CV, che rappresenta la fiducia nella previsione. Più basso è il numero %CV, più siamo sicuri della concentrazione corretta prevista dal software. La terza riga identifica l'impurità presente (RNA, proteina, fenolo, guanidina HCl o isotiocianato di guanidina) e riporta la quantità di assorbanza a 260 nm fornita dal contaminante. In questo caso, il %CV rappresenta la fiducia nella previsione dell'identità del contaminante.

6. Come utilizziamo i risultati di Acclaro Contaminant ID nei flussi di lavoro?

La funzione Acclaro Contaminant ID fornisce ai clienti due importanti informazioni. In primo luogo, la funzione Contaminant ID identifica contaminanti specifici che potrebbero essere presenti nel campione. L'identificazione dei potenziali contaminanti nel campione può aiutare gli scienziati a risolvere i problemi di estrazioni o purificazioni difficili e prendere decisioni sull'uso del campione negli esperimenti a valle. In secondo luogo, l'ID del contaminante offre ai clienti una concentrazione corretta. Quando si impostano reazioni a valle in cui la concentrazione di DNA è un parametro critico (ad es. PCR), la concentrazione corretta aiuterà gli scienziati a garantire il successo degli esperimenti a valle.

7. Quale accuratezza e sensibilità posso aspettarmi dalla funzione Acclaro Contaminant ID e quali fattori influenzano l'accuratezza del risultato?

Durante lo sviluppo di questa funzione sono stati misurati ampi set di miscele note di analiti "addizionati" con contaminanti sullo strumento NanoDrop One. In generale, il risultato corretto dell'acido nucleico (la concentrazione prevista dal software) era entro il 10% della concentrazione effettiva. La sensibilità di Acclaro Contaminant ID dipende dall'assorbimento molare del contaminante rispetto all'analita di interesse (acido nucleico o proteina). Il fenolo ha un assorbimento molare molto elevato, quindi basta pochissimo fenolo per influenzare lo spettro e generare una concentrazione corretta per l'analita. Le proteine hanno un basso assorbimento molare rispetto al dsDNA, quindi ci vuole una grande quantità di proteine per influenzare lo spettro.

Da:

https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Application-Notes/EB53212-acclaro-nucleic-acid-resource-guide.pdf?cid=7014z000000iOhm&tracksrc=IntEm316851&cta=link_5_6&elq_mid=23060&elq_cid=4639296