CRISPR Library Solutions / Soluzioni per librerie CRISPR
CRISPR Library Solutions / Soluzioni per librerie CRISPR
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Pooled Screens
Genetic screens using pooled libraries are typically performed to locate and identify genes that are involved in cellular response, such as in signaling pathways, or to discover the function of novel genes. Pooled screening libraries can vary in scale from as few as 100 constructs, up to hundreds of thousands. In contrast to an arrayed approach, pooled screens do not normally require extensive and costly automation equipment. Instead, with the appropriate experimental design, a pooled approach allows researchers to screen a population of modified cells with just a few culture plates. Cloning, trans formation, transfection, packaging, transduction and screening are all done in a single, pooled sample requiring little in the way of specialized equipment and offering a more user-friendly approach to functional, phenotypic screens.
CRISPR Screening
While pooled screens have been a functional genomics tool for over a decade previous technologies, like RNAi, have a number of restrictions which may limit their use for some applications. The introduction of CRISPR-based tools has provided an opportunity to overcome many of these limitations. CRISPR utilizes a ribonucleoprotein with a single guide RNAs (sgRNAs) that targets an enzyme (typically a Cas9 nuclease or a modified version of Cas9) to a genetic locus where it can modify the DNA. To generate knock-outs for functional screening, the Cas9 nuclease induces a double-strand break at the target site. Error prone repair of this break by non-homologous end joining results in modification of the target site, and often causes a loss-of function phenotype by inserting or deleting bases to cause a frameshift mutation. Unlike other engineered nucleases that require extensive protein engineering, CRISPR systems rely on simple base pairing to target genomic loci making the system easily adaptable to a wide-range of applications and targets.
Working with Pooled Libraries
Pooled Libraries in Functional Genomics Workflow
CRISPR screens in mammalian cells typically begin with the design of a set of guides targeting genomic regions of interest that are defined by the user. This can be a small set of genes involved in a signaling pathway, up to all of the exons in an organism. After designing these guides, they are synthesized as DNA oligos and cloned into a viral delivery plasmid. From Library to Cells After packaging into viruses, the guides are delivered alongside Cas9 to a pool of cells. Under the correct conditions, approximately one guide will be active per cell, providing a pool of cells each with a single gene knocked-out. This pool is then exposed to a specific treatment, such as a drug or other external stimulus, and cells passing the selection are sequenced to determine which guide was present in the selected cell. One of the key inputs into this workflow is the CRISPR guide library. Library quality and composition can affect all of the downstream segments of the workflow including screening effort, sequencing cost, and false positive/negative identification.
Figure 2. Agilent’s massively parallel oligo synthesis platform is the basis for our offering in CRISPR libraries. However, we offer an extensive range of instrumentation and reagents that can help you get the best possible results from your CRISPR screens. / La piattaforma di sintesi oligo massiccia di Agilent è la base per la nostra offerta nelle librerie CRISPR. Tuttavia, offriamo una vasta gamma di strumentazione e reagenti che possono aiutarti ad ottenere i migliori risultati possibili dai tuoi schermi CRISPR.
Library Quality
Our Platform
There are multiple parameters that one needs to consider in both choosing an oligo library and designing an experiment. The first is library fidelity, which refers to the error rate (errors per kilobase) in a sequenced library.
Agilent’s CRISPR libraries are all synthesized on its technologically advanced SurePrint platform with error rates well below the industry average. While fidelity is important to generating a high quality library the second parameter, representation, is even more critical. Representation refers to the relative abundance of each guide in the pool and can be measured by comparing the number of under-represented guides to the number of over-represented guides. If too many over-represented guides are present, they will dominate the results and increase the number of cells that need to be screened to get full coverage of the members in the pool. Similarly, if too many guides are under-represented then the amount of screening that needs to be done rapidly becomes prohibitive, especially for genome-wide approaches or experiments of a similar scale. Agilent’s DNA synthesis technology allows rational design of parallel synthesis that permits tailoring of library representation to achieve the most uniform distribution of guides across even the most complex libraries.
Agilent’s CRISPR libraries harness the SurePrint platform to provide more uniform guide representation and better fidelity than other commercially available solutions. Whether pre-defined or fully custom, every SureGuide CRISPR library is made with the same exceptional quality.
SureGuide CRISPR Solutions
Any Format, Any Site, Any Species Agilent’s CRISPR libraries are available in three formats. Ready-to-Package plasmid libraries consist of pre-defined, licensed content. These genome-wide knock-out libraries, or GeCKO libraries, target all exons in the human or mouse genome and have been pre-validated by researchers around the world who are studying functional gene interactions at an -omics scale. SureGuide Ready-to-Clone libraries offer the added flexibility of designing your own guide sequences, and arrive as an amplified pool of linear DNA compatible with our SureVector library cloning kit. With ready-to-clone libraries you can fully specify the sequence of each guide in the library. Ready-to-Amplify libraries offer the ultimate flexibility in customization. Synthesized using the same ultra-high quality process as our standard libraries, you can fully design every aspect of your CRISPR protocol allowing for the use of alternative delivery systems, cloning approaches, and targeting in any organism of your choice.
The key input into this workflow is the CRISPR guide library. Both library quality and composition can affect all of the downstream segments of your experiment including screening effort, sequencing cost, and false positive/negative identification
Genome-Wide Screens
Genome-wide CRISPR screens are designed to provide functional knock-outs of all the genes within a cell. Agilent offers two genome-wide plasmid libraries in a pooled format. Both are designed, validated, and licensed, with one targeting all the exons in human cells and the other targeting all the exons in mouse cells. GeCKO libraries are delivered in an optimized lentivirus plasmid in a ready-to-package format.
Figure 3. All CRISPR libraries begin with the synthesis of a high-quality oligo pool. For full flexibility, these ready-to-amplify pools are directly available for order by fully specifying the sequences of all library members. Ready-to-clone libraries take you one step further in the workflow, allowing customization but requiring a cloning step while ready-to-package libraries are only available in predefined content but require no cloning, only viral packaging and delivery. / Tutte le librerie CRISPR iniziano con la sintesi di un oligo pool di alta qualità. Per la massima flessibilità, questi pool pronti per l'amplificazione sono direttamente disponibili per l'ordine specificando completamente le sequenze di tutti i membri della libreria. Le librerie pronte per la clonazione fanno un ulteriore passo avanti nel flusso di lavoro, consentendo la personalizzazione ma richiedendo una fase di clonazione, mentre le librerie pronte per il confezionamento sono disponibili solo nel contenuto predefinito ma non richiedono clonazione, solo confezionamento e consegna virale.
Genome-wide screens require considerable time and resources to complete. Agilent’s GeCKO libraries assure that you can focus on your experimental design, leaving the library quality to us.
Figure 6. Left image.The general cycle of oligo synthesis via phosphoramidite chemistry. Agilent’s real time quality control inspection system verifies chemical deposition at each step in the process to minimize guide drop-out and premature truncation. Right image. Calculated yield of full-length oligonucleotides as a function of length, at two different cycle yields, with and without depurination. Convectional processesused by competitors see a large fall-off in fidelity compared to Agilent’s platform. / Immagine a sinistra. Il ciclo generale della sintesi dell'oligo tramite la chimica della fosforamidite. Il sistema di ispezione del controllo qualità in tempo reale di Agilent verifica il deposito di sostanze chimiche in ogni fase del processo per ridurre al minimo l'abbandono della guida ed il troncamento prematuro. Immagine destra. Resa calcolata di oligonucleotidi a lunghezza intera in funzione della lunghezza, a due diverse rese di ciclo, con e senza depurinazione. I processi convezionali utilizzati dai concorrenti vedono un forte calo di fedeltà rispetto alla piattaforma Agilent.
SureVector Library Cloning
Reliable Library Construction
Agilent has developed a proprietary method for cloning complex oligo libraries. This approach, using our SureVector technology, uses a single step, homology-based DNA assembly to generate a plasmid library from an amplified oligo pool. The SureVector library cloning kit includes the enzymes and buffers required for assembly, a human or mouse specific control fragment, and a lentivirus backbone. For fully custom applications, designing your constructs to be compatible with SureVector is simple, as it only requires 30-60 base-pair overlaps with your choice of vector
Figure 7. Traditional cloning technologies rely on restriction enzymes to generate clonable DNA fragments. Overlap based methods (right) include both Gibson assembly and SureVector. These methods use a blend of enzymes to combine homologous ends into a seamless strand of DNA. / Le tradizionali tecnologie di clonazione si basano sugli enzimi di restrizione per generare frammenti di DNA clonabili. I metodi basati sulla sovrapposizione (a destra) includono sia l'assembly Gibson che SureVector. Questi metodi utilizzano una miscela di enzimi per combinare estremità omologhe in un filamento di DNA senza soluzione di continuità.
The SureVector library cloning kit allows you to reliably generate plasmid libraries, maintaining maximum uniformity of representation in your unamplified or pre-amplified custom CRISPR libraries.
Instructions to Order GeCKOv2
Libraries GeCKOv2 libraries are available for both mouse (G7554A) and human (G7555A) applications. Kits also include a control appropriate for the organism the library is designed for. If you require additional information, including the sequences of each component of the library please contact your local Agilent representative or technical support.
Instructions to Order Custom Libraries
Custom ready-to-clone libraries (G7555A) are available in three sizes, up to 10,000 guides, up to 30,000 guides and up to 60,000 guides. Promoter elements are included in the construct and are a U6 promoter optimized for human applications (alternative promoters can be ordered in an unamplified format). You will provide to your Agilent representative either:
(1) a text file containing the variable sequence of the guide corresponding to your targets,
(2) a list of genomic regions preferably in a .bed format or
(3) a list of target gene names using the ‘NCBI gene’ nomenclature. Options 2 and 3 are only available for S. Pyogenes Cas9. Custom ready-to-amplify libraries (G7555B) are available in four sizes, up to 5,000 guides, up to 25,000 guides, up to 50,000 guides and up to 100,000 guides. To order a custom library you will provide the full sequence of the construct you will be cloning.
ITALIANO
Tecnologia avanzata degli acidi nucleici per migliori librerie CRISPR.
Agilent Technologies ha una lunga storia nella costruzione di acidi nucleici. Nata dallo spin-off di Agilent da Hewlett-Packard Company, la nostra tecnologia di sintesi degli oligonucleotidi del DNA si basa sui concetti che consentono la stampa a getto d'inchiostro. Questa piattaforma consente di stampare fino a un milione di elementi oligo su un singolo chip, creando pool di oligo altamente complessi con ciascun oligo presente in rapporti precisi. Le sostanze chimiche avanzate sviluppate da Agilent consentono anche la stampa di oligo più lunghi di quelli normalmente disponibili presso i fornitori commerciali. Abbiamo sfruttato questa tecnologia per sviluppare un'ampia gamma di prodotti leader di mercato, inclusi i microarray personalizzati SurePrint, SureSelect per l'arricchimento del target NGS, le sonde SureFISH ed il kit di mutagenesi QuikChange HT per l'ingegneria delle proteine. Sia che tu stia cercando contenuti predefiniti della massima qualità o che tu debba creare le tue librerie oligo da zero, Agilent ha una soluzione per le tue esigenze CRISPR.
Schermi in pool
Gli screening genetici che utilizzano librerie raggruppate vengono in genere eseguiti per individuare ed identificare i geni coinvolti nella risposta cellulare, ad esempio nelle vie di segnalazione, o per scoprire la funzione di nuovi geni. Le librerie di screening in pool possono variare in scala da un minimo di 100 costrutti a centinaia di migliaia. A differenza di un approccio in serie, gli schermi in pool normalmente non richiedono apparecchiature di automazione estese e costose. Invece, con il progetto sperimentale appropriato, un approccio combinato consente ai ricercatori di selezionare una popolazione di cellule modificate con poche piastre di coltura.
Clonazione, trasformazione, trasfezione, confezionamento, trasduzione e screening vengono tutti eseguiti in un unico campione raggruppato che richiede poco in termini di apparecchiature specializzate ed offre un approccio più intuitivo agli schermi fenotipici funzionali.
Screening CRISPR
Sebbene gli schermi in pool siano stati uno strumento di genomica funzionale per oltre un decennio, le tecnologie precedenti, come RNAi, hanno una serie di restrizioni che potrebbero limitarne l'uso per alcune applicazioni. L'introduzione di strumenti basati su CRISPR ha fornito l'opportunità di superare molte di queste limitazioni. CRISPR utilizza una ribonucleoproteina con un singolo RNA guida (sgRNA) che indirizza un enzima (tipicamente una nucleasi Cas9 od una versione modificata di Cas9) ad un locus genetico dove può modificare il DNA. Per generare knock-out per lo screening funzionale, la nucleasi Cas9 induce una rottura del doppio filamento nel sito target. La riparazione soggetta a errori di questa rottura mediante l'unione di estremità non omologhe provoca la modifica del sito target e spesso provoca una perdita di fenotipo funzionale inserendo od eliminando basi per causare una mutazione frameshift. A differenza di altre nucleasi ingegnerizzate che richiedono un'ampia ingegneria proteica, i sistemi CRISPR si basano su un semplice accoppiamento di basi per colpire i loci genomici, rendendo il sistema facilmente adattabile ad un'ampia gamma di applicazioni e target.
Lavorare con le biblioteche in pool
Librerie in pool nel flusso di lavoro di genomica funzionale
Gli schermi CRISPR nelle cellule di mammifero iniziano in genere con la progettazione di una serie di guide mirate alle regioni genomiche di interesse definite dall'utente. Questo può essere un piccolo insieme di geni coinvolti in una via di segnalazione, fino a tutti gli esoni in un organismo. Dopo aver progettato queste guide, vengono sintetizzate come oligo di DNA e clonate in un plasmide di consegna virale.
Dalla libreria alle cellule
Dopo il confezionamento in virus, le guide vengono consegnate insieme a Cas9 ad un gruppo di cellule. Nelle condizioni corrette, sarà attiva circa una guida per cellula, fornendo un pool di cellule ciascuna con un singolo gene eliminato. Questo gruppo viene quindi esposto ad un trattamento specifico, come un farmaco od un altro stimolo esterno, e le cellule che passano la selezione vengono sequenziate per determinare quale guida era presente nella cellula selezionata. Uno degli input chiave in questo flusso di lavoro è la libreria di guide CRISPR. La qualità e la composizione della libreria possono influire su tutti i segmenti a valle del flusso di lavoro, inclusi lo sforzo di screening, i costi di sequenziamento e l'identificazione dei falsi positivi/negativi.
Qualità della Biblioteca
La nostra piattaforma
Ci sono molteplici parametri da considerare sia nella scelta di una libreria oligo che nella progettazione di un esperimento. Il primo è la fedeltà della libreria, che si riferisce al tasso di errore (errori per kilobase) in una libreria sequenziata.
Le librerie CRISPR di Agilent sono tutte sintetizzate sulla sua piattaforma tecnologicamente avanzata SurePrint con tassi di errore ben al di sotto della media del settore. Mentre la fedeltà è importante per generare una libreria di alta qualità, il secondo parametro, la rappresentazione, è ancora più critico. La rappresentazione si riferisce all'abbondanza relativa di ciascuna guida nel gruppo e può essere misurata confrontando il numero di guide sottorappresentate con il numero di guide sovrarappresentate. Se sono presenti troppe guide sovrarappresentate, domineranno i risultati ed aumenteranno il numero di cellule che devono essere esaminate per ottenere la copertura completa dei membri nel gruppo. Allo stesso modo, se troppe guide sono sottorappresentate, la quantità di screening che deve essere eseguita diventa rapidamente proibitiva, specialmente per approcci a livello di genoma od esperimenti di scala simile. La tecnologia di sintesi del DNA di Agilent consente la progettazione razionale della sintesi parallela che consente di personalizzare la rappresentazione della libreria per ottenere la distribuzione più uniforme delle guide anche nelle librerie più complesse.
Le librerie CRISPR di Agilent sfruttano la piattaforma SurePrint per fornire una rappresentazione della guida più uniforme ed una migliore fedeltà rispetto ad altre soluzioni disponibili in commercio. Che sia predefinita o completamente personalizzata, ogni libreria SureGuide CRISPR è realizzata con la stessa eccezionale qualità.
Soluzioni SureGuide CRISPR
Qualsiasi formato, qualsiasi sito, qualsiasi specie
Le librerie CRISPR di Agilent sono disponibili in tre formati. Le librerie di plasmidi pronte per il pacchetto sono costituite da contenuti predefiniti con licenza. Queste librerie knock-out dell'intero genoma, o librerie GeCKO, prendono di mira tutti gli esoni nel genoma umano o del topo e sono state pre-convalidate da ricercatori di tutto il mondo che stanno studiando le interazioni geniche funzionali su scala -omica. Le librerie SureGuide Ready-to-Clone offrono la flessibilità aggiuntiva di progettare le tue sequenze guida ed arrivano come un pool amplificato di DNA lineare compatibile con il nostro kit di clonazione della libreria SureVector. Con le librerie pronte per la clonazione puoi specificare completamente la sequenza di ciascuna guida nella libreria. Le librerie pronte per l'amplificazione offrono la massima flessibilità nella personalizzazione. Sintetizzato utilizzando lo stesso processo di altissima qualità delle nostre librerie standard, puoi progettare completamente ogni aspetto del tuo protocollo CRISPR consentendo l'uso di sistemi di consegna alternativi, approcci di clonazione e targeting in qualsiasi organismo di tua scelta.
L'input chiave in questo flusso di lavoro è la libreria della guida CRISPR. Sia la qualità che la composizione della libreria possono influire su tutti i segmenti a valle dell'esperimento, inclusi lo sforzo di screening, il costo del sequenziamento e l'identificazione dei falsi positivi/negativi
Schermi dell'intero genoma
Gli schermi CRISPR dell'intero genoma sono progettati per fornire knock-out funzionali di tutti i geni all'interno di una cellula. Agilent offre due librerie di plasmidi dell'intero genoma in un formato raggruppato. Entrambi sono progettati, convalidati e concessi in licenza, con uno che prende di mira tutti gli esoni nelle cellule umane e l'altro che prende di mira tutti gli esoni nelle cellule di topo. Le librerie GeCKO vengono fornite in un plasmide lentivirus ottimizzato in un formato pronto per il confezionamento.
Gli schermi dell'intero genoma richiedono molto tempo e risorse per essere completati. Le librerie GeCKO di Agilent ti assicurano che puoi concentrarti sul tuo progetto sperimentale, lasciando a noi la qualità della libreria.
Librerie amplificate personalizzate
Costruisci la tua libreria
La piattaforma di Agilent è altamente personalizzabile, consentendo la sintesi di librerie CRISPR personalizzate con la stessa facilità e qualità delle nostre librerie GeCKO. Per i ricercatori che lavorano su cellule di mammifero, offriamo un sistema di clonazione combinato con librerie di oligo preamplificate in un formato pronto per la clonazione che semplifica l'ottenimento di librerie di plasmidi di qualità da catalogo con i progetti di guide personalizzate.
Prendi il controllo dei tuoi esperimenti CRISPR progettando le tue librerie per applicazioni sui mammiferi. Guide di progettazione per qualsiasi target o compatibilità con qualsiasi proteina associata a CRISPR, il tutto con la garanzia della stessa qualità e costo delle nostre librerie di catalogo.
Librerie personalizzate pronte per l'amplificazione
Flessibilità illimitata
Oltre alle librerie pronte per la clonazione, Agilent offre librerie di guide completamente personalizzabili in cui l'utente può definire la propria sequenza del promotore e la propria strategia di clonazione, secondo necessità. Queste librerie hanno sequenze completamente specificate per la tua applicazione e sono disponibili in un formato pronto per l'amplificazione insieme a tutti i reagenti necessari per mantenere la qualità e la rappresentazione della libreria quando si genera una libreria CRISPR per qualsiasi configurazione di screening che si possa immaginare.
In Agilent utilizziamo la nostra piattaforma avanzata di sintesi del DNA per offrire librerie CRISPR completamente personalizzate compatibili con qualsiasi applicazione od approccio sperimentale
Clonazione della libreria SureVector
Costruzione affidabile di librerie Agilent ha sviluppato un metodo proprietario per clonare librerie di oligo complesse. Questo approccio, utilizzando la nostra tecnologia SureVector, utilizza un assemblaggio di DNA basato sull'omologia in un unico passaggio per generare una libreria di plasmidi da un pool di oligo amplificato. Il kit di clonazione della libreria SureVector include gli enzimi ed i tamponi necessari per l'assemblaggio, un frammento di controllo specifico per l'uomo od il topo ed una spina dorsale di lentivirus. Per applicazioni completamente personalizzate, progettare i tuoi costrutti in modo che siano compatibili con SureVector è semplice, poiché richiede solo 30-60 sovrapposizioni di coppie di basi con il vettore scelto.
Il kit di clonazione della libreria SureVector consente di generare in modo affidabile librerie di plasmidi, mantenendo la massima uniformità di rappresentazione nelle librerie CRISPR personalizzate non amplificate o preamplificate.
Istruzioni per ordinare GeCKov2
Librerie Le librerie GeCKOv2 sono disponibili sia per applicazioni mouse (G7554A) che umane (G7555A) I kit includono anche un controllo appropriato per l'organismo per cui la biblioteca è progettata. Se hai bisogno di ulteriori informazioni, comprese le sequenze di ciascun componente della libreria, contatta il tuo rappresentante Agilent locale o il supporto tecnico.
Istruzioni per ordinare librerie personalizzate
Le librerie personalizzate pronte per la clonazione (G7555A) sono disponibili in tre dimensioni, fino a 10.000 guide, fino a 30.000 guide e fino a 60.000 guide. Gli elementi del promotore sono inclusi nel costrutto e sono un promotore U6 ottimizzato per applicazioni umane (è possibile ordinare promotori alternativi in un formato non amplificato).
Fornirai al tuo rappresentante Agilent:
(1) un file di testo contenente la sequenza variabile della guida corrispondente ai tuoi obiettivi,
(2) un elenco di regioni genomiche preferibilmente in formato .bed o
(3) un elenco di nomi di geni bersaglio utilizzando la nomenclatura "gene NCBI".
Le opzioni 2 e 3 sono disponibili solo per S. Pyogenes Cas9.
Le librerie personalizzate pronte per l'amplificazione (G7555B) sono disponibili in quattro dimensioni, fino a 5.000 guide, fino a 25.000 guide, fino a 50.000 guide e fino a 100.000 guide. Per ordinare una libreria personalizzata dovrai fornire la sequenza completa del costrutto che intendi clonare.
Da:
https://f.hubspotusercontent40.net/hubfs/547446/Technology%20Networks/Landing%20Pages/Agilent/2022/February/CRISPR%20Brochure%205991-9158EN.pdf?__hstc=8807082.074aceb79027e793890018c0152531d2.1643566337753.1650119699066.1650136941238.29&__hssc=8807082.1.1650136941238&__hsfp=1416964087&hsCtaTracking=79c2c8c4-6d12-4f80-bbf2-7d2f228da9d3%7C8fe55c63-d36d-4631-b0dc-f5869047d44d
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