PTM site localization and isomer differentiation of phosphorylated peptides / Localizzazione del sito PTM e differenziazione isomerica di peptidi fosforilati

 PTM site localization and isomer differentiation of phosphorylated peptides / Localizzazione del sito PTM e differenziazione isomerica di peptidi fosforilati

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Tunable electron activated dissociation (EAD) MS/MS using the SCIEX ZenoTOF 7600 system.

Protein phosphorylation is an important post-translational modification (PTM) as it is involved in a large variety of dynamic cellular processes. However, PTM site localization and quantification of phosphopeptides by collision induced dissociation (CID) MS/MS can be challenging, and phosphopeptides can exhibit a partial neutral loss of the phospho group (-98 Th). Phospho-isomer differentiation and subsequent precise PTM site localization can be achieved by measuring isomerspecific ions containing the actual modification (direct evidence), or by measuring differentiating fragment ions that do not contain the modification (indirect evidence). Depending on the peptide sequence, detecting near complete fragment ion series, and more particularly the challenging fragment ions that would define the peptide C- and N- termini, can be necessary for PTM-site localization, such as for pS-56 and pS-59 of the NDUFA10 subunit of mitochondrial Complex I1. The benefits of electron activated dissociation (EAD) versus CID were first explored for malonylation PTM. 

In this study, the use and benefits of EAD fragmentation for phosphopeptide analysis, site-localization and differentiation, and MS/MS-based phosphopeptide quantification were evaluated. 

Key features of EAD for phosphoproteomics 

• Efficient electron activated dissociation (EAD) 3 generates strong and distinct PTM site localization ions, enabling phospho-isomer differentiation 

• Tunable kinetic energy (KE) for EAD MS/MS allows for selection of KE that provides the highest fragment ion abundance, while not inducing neutral loss from the phosphoryl group (-98 Th)

 • Generation of strong PTM-containing site localization ions, even small z+1 ions (z2+1, z3+1 and z4+1) and high c ions (c10, c11 and c12)  

• The optimal KE values are different between different types of modifications, phosphorylation and malonylation 

• Using the Zeno trap gives up to ~10x increase in intensity for key site-localizing fragment ions (small z+1 ions and high c ions)

• Preliminary quantification using EAD high-resolution MRM (MRMHR)  indicates good linearity over concentrations interrogated 

• Detailed characterization and MS/MS-based quantification of the modified peptides analyzed by EAD MS/MS using Skyline.

Methods

Sample preparation: Phosphorylated synthetic peptides were obtained from Princeton Biomolecules Corporation and diluted in simple matrix for analysis. Chromatography: A NanoLC 425 system plumbed for microflow chromatography (5 µL/min) was used and operated in direct injection mode. The analytical column used was a 0.3 mm x 150 mm (2.6 µm particle size) Phenomenex Omega Polar column. Column temperature was controlled at 30C. Short gradients of 8 minutes were used. 

Mass spectrometry: All data was acquired using a SCIEX ZenoTOF 7600 system and an OptiFlow Turbo V ion source6 equipped with the microflow probe and 25 µm electrodes. The system is equipped with the electron activated dissociation (EAD) cell which enabled hot electron capture dissociation (hot ECD) to be performed in a targeted manner on the phosphorylated peptides. MRMHR data were collected using a TOF MS scan of 250 msec and MS/MS accumulation times of 150 msec both in CID and EAD fragmentation modes. Electron current was also ramped to optimize and a final value of 5000 nA was used throughout study. Kinetic energies were ramped and optimized per analyte.

Data processing: MRMHR data were processed using SCIEX OS software 2.1 using both Explorer and Analytics modules, and Skyline (version 3.6). 

 EAD fragmentation enables direct PTM site localization 

Two isomeric phosphorylated peptides from bovine mitochondrial NDUFA10 subunit of Complex I (P34942), LITVDGNICpSGKSK and LITVDGNICSGKpSK, were synthetized with a phosphoserine at position S-56 and S-59 respectively (hereafter referred to as LITV-pS-56 and LITV-pS-59 respectively). In order to effectively characterize PTM peptides, it is important to detect the ‘intact’ fragment ion(s) containing the modification to confidently determine its type and localization site. Here, the modification sites of the two isomers are two amino acids apart, close to the peptide c-terminus, respectively at positions pS-56 and pS-59 on the 14 aa-long peptides making these modifications difficult to characterize. Therefore, near complete coverage of the ion series in both directions is required to localize the PTM site.

However, in CID small y-ions and large b-ions are often challenging to detect, and in addition CID MS/MS induces some neutral loss of H3PO4 (-98 m/z) from the labile phosphorylation group (Figure 1 and 4B-D). Fortunately, MRMHR analysis using EAD MS/MS enabled detection of PTM-containing, site-specific ions, such as c10 to c12 for LITV-pS-56 and z2+1 to z4+1 for LITVpS-59, in blue with very good intensity, providing direct evidence for the phosphorylation site on each peptide. Additional differentiating, non-PTM containing ions were also observed, such as z2+1 to z4+1 for LITV-pS-56 and c10 to c12 for LITV-pS-59, in black. Altogether, these results allow confident discrimination of both isomers. MRMHR assays using EAD MS/MS uniquely provided quantification of phosphopeptides using PTM-site specific ions which have very strong signal. Whereas, when using CID MS/MS, the required differentiating ions are very low abundance which negatively impacts quantification sensitivity in addition to not providing definitive discrimination between the two peptide isomers. 

Targeted EAD MRMHR for detailed characterization

 MRMHR is a MS/MS-based targeted acquisition strategy for accurate quantification that offers the possibility to process and refine data post-acquisition using dedicated tools as Skyline. First, near complete c- and z+1-ion series were extracted for the two isomeric peptides in Skyline. When extracting all possible fragment ions (PTM-site specific as well as ions that are in common between the two phospho-site isomers) two chromatographic peaks are detected that correspond to the two isomers that were obtained. However, when only PTM site specific fragment ions are extracted for the corresponding peptide isomers in each case, for pS-56 and for pS-59 in, it is possible to unambiguously differentiate these isoforms with the pS-56 isomer eluting at 6.45 min and the pS-59 isomer eluting at 6.6 min.

Targeted EAD MRMHR data processing in Skyline offers a detailed characterization of the modified peptides of interest. Currently, Skyline computes c- and z+1-ions that can be visualized and used for precise MS/MS quantification. 

Tunable kinetic energy for EAD MS/MS preserves labile phospho-groups 

The kinetic energy during EAD MS/MS can be tuned on the ZenoTOF 7600 system so that the fragmentation parameters can be customized to favor both the preservation of the labile phospho-group and to generate optimal sensitivity. In this experiment, kinetic energies (KE) were ramped from 0 to 11. For the two phosphopeptide isomers, the optimal KE value was 2, which generated high intensity differentiating and site-specific fragment ions that contained the intact PTM, while generating very limited background noise. Increased KE values, above 7, resulted in some neutral loss for the differentiating ions for LITV-pS-56. To note, the KE-dependent abundance patterns vary slightly for the illustrated, site specific ions between the isomeric peptides. The neutral loss of -98 Th is only observed on the c-ions when using the very high KE values. Thus, the tunable KE allows for the generation of methods that will both preserve the site-specific fragment ions (KE 2) and induce neutral loss (KE 11) for complete characterization of a modified peptide. 

Preliminary linear response for quantification 

To get an initial appreciation of the quantitative performances of MRMHR assays using EAD MS/MS, 4-point concentration curves were designed (4, 20, 100 and 500 pg on-column), and each point was injected in triplicate. Six differentiating ions were investigated for each peptide, and each showed good linear response (R2 ≥ 0.93). Although the explored dynamic range is limited (2.1 orders of magnitude), this first assessment suggests utility of EAD MS/MS for quantification 

Zeno trap improves sensitivity

 Finally, to explore the impact of the Zeno trap on quality of EAD MS/MS spectra and sensitivity performances, EAD MS/MS analyses were performed with and without the Zeno trap activated. Analysis with Zeno trap on significantly increases sensitivity and thus generates higher intensity c and z+1 ions, strengthening the confidence for PTM site localization and isomer differentiation. Differentiating fragment ion peaks were extracted, and the ratios of the areas obtained with Zeno trap on and off were determined. Sensitivity gains ranging between 7.4 and 14.9 were achieved for the various fragment ions. All the ions benefited from the activation of the Zeno trap, and more particularly the smaller ones, as the average gain was 12.7 for the three investigated small z+1 ions and 9.0 for the high c ions. 

Conclusions 

In this work, the performance of electron activated dissociation (EAD) on the SCIEX ZenoTOF 7600 system was investigated for the characterization and the quantification of phosphorylated isomeric peptides. 

• Specifically tuning the kinetic energy (KE) for the phosphorylated peptide isomers is an added value for determination of PTM site localization, for differentiating isomers, and for improving quantification accuracy

 • For the two phosphorylated isomers investigated, an optimal kinetic energy value of 2eV allowed preservation of the labile group and generated fragment ions with site localization evidence

 • Activation of the Zeno trap provided large improvements in sensitivity, leading to highly confident PTM characterization 

• Using MRMHR and collecting full scan EAD MS/MS fragmentation offers the possibility to refine the extracted chromatographic peaks post-acquisition, using dedicated processing tools such as Skyline 

• Preliminary quantitative assessment of EAD MRMHR workflows shows promising performances for the robust and accurate quantification of labile PTMs

ITALIANO

 Elettroni sintonizzabili (EAD)MS/MS  a dissociazione attivata utilizzando il sistema SCIEX ZenoTOF 7600.

La fosforilazione proteica è un'importante modifica post-traduzionale (PTM) poiché è coinvolta in un'ampia varietà di processi cellulari dinamici. Tuttavia, la localizzazione del sito PTM e la quantificazione dei fosfopeptidi mediante dissociazione indotta da collisione (CID) MS/MS possono essere impegnativi ed i fosfopeptidi possono mostrare una parziale perdita neutra del gruppo fosforo (-98 Th). 

La differenziazione del fosfoisomero e la successiva localizzazione precisa del sito PTM possono essere ottenute misurando ioni isomeri specifici contenenti la modifica effettiva (evidenza diretta) o misurando ioni frammento differenziante che non contengono la modifica (evidenza indiretta). A seconda della sequenza peptidica, per la localizzazione del sito PTM può essere necessario rilevare una serie di frammenti ionici quasi completi, e più in particolare gli ioni di frammenti impegnativi che definirebbero i terminali C- e N- del peptide, come per pS-56 e pS- 59 della subunità NDUFA10 del complesso mitocondriale I1. I vantaggi della dissociazione attivata da elettroni (EAD) rispetto a CID sono stati esplorati per la prima volta per la malonilazione PTM.

In questo studio sono stati valutati l'uso ed i vantaggi della frammentazione EAD per l'analisi dei fosfopeptidi, la localizzazione e la differenziazione del sito e la quantificazione dei fosfopeptidi basata su MS/MS.

Caratteristiche principali dell'EAD per la fosfoproteomica

• L'efficiente dissociazione attivata da elettroni (EAD)  genera ioni di localizzazione del sito PTM forti e distinti, consentendo la differenziazione degli isomeri fosforici

• L'energia cinetica sintonizzabile (KE) per EAD MS/MS consente la selezione di KE che fornisce la più alta abbondanza di ioni di frammento, pur non inducendo una perdita neutra dal gruppo fosforile (-98 Th) 

• Generazione di forti ioni di localizzazione del sito contenenti PTM, anche piccoli ioni z+1 (z2+1, z3+1 e z4+1) ed alti c (c10, c11 e c12)

• I valori ottimali di KE sono diversi tra i diversi tipi di modificazioni, fosforilazione e malonilazione

• L'uso della trappola Zeno fornisce un aumento di intensità fino a circa 10 volte per i frammenti di ioni chiave di localizzazione del sito (ioni z+1 piccoli e ioni c alti)

• La quantificazione preliminare mediante MRM ad alta risoluzione EAD (MRMHR) indica una buona linearità rispetto alle concentrazioni interrogate

• Caratterizzazione dettagliata e quantificazione basata su MS/MS dei peptidi modificati analizzati mediante EAD MS/MS utilizzando Skyline.

 Metodi

Preparazione del campione: peptidi sintetici fosforilati sono stati ottenuti da Princeton Biomolecules Corporation e diluiti in matrice semplice per l'analisi. 

Cromatografia: è stato utilizzato un sistema NanoLC 425 predisposto per cromatografia a microflusso (5 µl/min) che ha operato in modalità di iniezione diretta. La colonna analitica utilizzata era una colonna Phenomenex Omega Polar di 0,3 mm x 150 mm (dimensione delle particelle di 2,6 µm). La temperatura della colonna è stata controllata a 30°C. Sono stati utilizzati brevi gradienti di 8 minuti. Spettrometria di massa: tutti i dati sono stati acquisiti utilizzando un sistema SCIEX ZenoTOF 7600 e una sorgente ionica OptiFlow Turbo V6 dotata di sonda a microflusso ed elettrodi da 25 µm. Il sistema è dotato della cella di dissociazione attivata da elettroni (EAD) che ha consentito di eseguire la dissociazione a cattura di elettroni caldi (ECD a caldo) in modo mirato sui peptidi fosforilati. I dati MRMHR sono stati raccolti utilizzando una scansione TOF MS di 250 msec e tempi di accumulo MS/MS di 150 msec sia in modalità di frammentazione CID che EAD. Anche la corrente elettronica è stata aumentata per ottimizzare ed è stato utilizzato un valore finale di 5000 nA durante lo studio. Le energie cinetiche sono state incrementate e ottimizzate per analita.

Elaborazione dei dati: i dati MRMHR sono stati elaborati utilizzando il software SCIEX OS 2.1 utilizzando i moduli Explorer e Analytics e Skyline (versione 3.6).

 La frammentazione EAD consente la localizzazione diretta del sito PTM

Due peptidi fosforilati isomerici dalla subunità mitocondriale bovina NDUFA10 del complesso I (P34942), LITVDGNICpSGKSK e LITVDGNICSGKpSK, sono stati sintetizzati con una fosfoserina rispettivamente in posizione S-56 e S-59 (di seguito denominata LITV-pS-56 e LITV-pS- 59 rispettivamente). Al fine di caratterizzare efficacemente i peptidi PTM, è importante rilevare lo ione o gli ioni del frammento "intatto" contenenti la modifica per determinarne con sicurezza il tipo e il sito di localizzazione. Qui, i siti di modifica dei due isomeri sono distanti due aminoacidi, vicini al peptide c-terminale, rispettivamente nelle posizioni pS-56 e pS-59 sui peptidi lunghi 14 aa, rendendo queste modifiche difficili da caratterizzare. Pertanto, per localizzare il sito PTM è necessaria una copertura quasi completa della serie di ioni in entrambe le direzioni.

Tuttavia, nei CID piccoli ioni y e grandi ioni b sono spesso difficili da rilevare e inoltre CID MS/MS induce una perdita neutra di H3PO4 (-98 m/z) dal gruppo di fosforilazione labile (Figura 1 e 4B- D). Fortunatamente, l'analisi MRMHR mediante EAD MS/MS ha consentito il rilevamento di ioni specifici del sito contenenti PTM, come da c10 a c12 per LITV-pS-56 e da z2+1 a z4+1 per LITVpS-59, in blu con intensità molto buona, fornendo prove dirette del sito di fosforilazione su ciascun peptide. Sono stati osservati anche ulteriori ioni differenzianti, non contenenti PTM, come da z2+1 a z4+1 per LITV-pS-56 e da c10 a c12 per LITV-pS-59. Complessivamente, questi risultati consentono una discriminazione sicura di entrambi gli isomeri. I saggi MRMHR che utilizzano EAD MS/MS hanno fornito in modo univoco la quantificazione dei fosfopeptidi utilizzando ioni specifici del sito PTM che hanno un segnale molto forte. Considerando che, quando si utilizza CID MS/MS, gli ioni di differenziazione richiesti sono un'abbondanza molto bassa che influiscono negativamente sulla sensibilità di quantificazione oltre a non fornire una discriminazione definitiva tra i due isomeri peptidici.

EAD MRMHR mirato per una caratterizzazione dettagliata

 MRMHR è una strategia di acquisizione mirata basata su MS/MS per una quantificazione accurata che offre la possibilità di elaborare e perfezionare i dati dopo l'acquisizione utilizzando strumenti dedicati come Skyline. In primo luogo, sono state estratte serie quasi complete di ioni c e z+1 per i due peptidi isomerici in Skyline. Quando si estraggono tutti i possibili frammenti di ioni (specifici per il sito PTM e ioni che sono in comune tra i due isomeri del fosfo-sito) vengono rilevati due picchi cromatografici che corrispondono ai due isomeri ottenuti. Tuttavia, quando vengono estratti solo gli ioni di frammento specifici del sito PTM per gli isomeri peptidici corrispondenti in ciascun caso, per pS-56 e per pS-59 in, è possibile differenziare inequivocabilmente queste isoforme con l'isomero pS-56 che eluisce a 6,45 min e l'isomero pS-59 eluendo a 6,6 min.

L'elaborazione mirata dei dati EAD MRMHR in Skyline offre una caratterizzazione dettagliata dei peptidi modificati di interesse. Attualmente, Skyline calcola gli ioni c e z+1 che possono essere visualizzati e utilizzati per una precisa quantificazione MS/MS.

L'energia cinetica regolabile per EAD MS/MS preserva i fosfogruppi labili

L'energia cinetica durante EAD MS/MS può essere regolata sul sistema ZenoTOF 7600 in modo che i parametri di frammentazione possano essere personalizzati per favorire sia la conservazione del gruppo fosforo labile sia per generare una sensibilità ottimale. In questo esperimento, le energie cinetiche (KE) sono state aumentate da 0 a 11. Per i due isomeri fosfopeptidici, il valore KE ottimale era 2, che ha generato differenziazione ad alta intensità e ioni di frammento sito-specifici che contenevano il PTM intatto, generando al contempo ioni molto limitati rumore di fondo. L'aumento dei valori di KE, superiori a 7, ha comportato una perdita neutra per gli ioni differenzianti per LITV-pS-56. Da notare, i modelli di abbondanza dipendenti dal KE variano leggermente per gli ioni specifici del sito illustrati tra i peptidi isomerici. La perdita neutra di -98 Th si osserva solo sugli ioni c quando si utilizzano valori KE molto elevati. Pertanto, il KE sintonizzabile consente la generazione di metodi che conserveranno sia gli ioni del frammento sito-specifico (KE 2) sia indurranno la perdita neutra (KE 11) per la caratterizzazione completa di un peptide modificato.

Risposta lineare preliminare per la quantificazione

Per ottenere un apprezzamento iniziale delle prestazioni quantitative dei test MRMHR utilizzando EAD MS/MS, sono state progettate curve di concentrazione a 4 punti (4, 20, 100 e 500 pg in colonna) e ciascun punto è stato iniettato in triplicato. Sono stati studiati sei ioni differenzianti per ciascun peptide e ciascuno ha mostrato una buona risposta lineare (R2 ≥ 0,93). Sebbene la gamma dinamica esplorata sia limitata (2,1 ordini di grandezza), questa prima valutazione suggerisce l'utilità di EAD MS/MS per la quantificazione

Zeno trap migliora la sensibilità

Infine, per esplorare l'impatto della trappola Zeno sulla qualità degli spettri EAD MS/MS e sulle prestazioni di sensibilità, sono state eseguite analisi EAD MS/MS con e senza la trappola Zeno attivata. L'analisi con la trappola Zeno attiva aumenta significativamente la sensibilità e quindi genera ioni c e z+1 di maggiore intensità, rafforzando la fiducia per la localizzazione del sito PTM e la differenziazione degli isomeri. Sono stati estratti i picchi di ioni del frammento differenziante e sono stati determinati i rapporti delle aree ottenute con Zeno trap on e off. Sono stati ottenuti guadagni di sensibilità compresi tra 7,4 e 14,9 per i vari frammenti di ioni. Tutti gli ioni hanno beneficiato dell'attivazione della trappola Zeno, e più in particolare quelli più piccoli, in quanto il guadagno medio è stato di 12,7 per i tre ioni piccoli z+1 studiati e di 9,0 per gli ioni c alti.

Conclusioni

In questo lavoro, sono state studiate le prestazioni della dissociazione attivata da elettroni (EAD) sul sistema SCIEX ZenoTOF 7600 per la caratterizzazione e la quantificazione dei peptidi isomerici fosforilati.

• L'ottimizzazione specifica dell'energia cinetica (KE) per gli isomeri peptidici fosforilati è un valore aggiunto per la determinazione della localizzazione del sito PTM, per la differenziazione degli isomeri e per migliorare l'accuratezza della quantificazione

 • Per i due isomeri fosforilati studiati, un valore di energia cinetica ottimale di 2eV ha consentito la conservazione del gruppo labile e ha generato ioni frammento con evidenza di localizzazione del sito

 • L'attivazione della trappola Zeno ha fornito ampi miglioramenti nella sensibilità, portando ad una caratterizzazione PTM altamente affidabile

• L'utilizzo di MRMHR e la raccolta della frammentazione MS/MS EAD a scansione completa offre la possibilità di perfezionare i picchi cromatografici estratti dopo l'acquisizione, utilizzando strumenti di elaborazione dedicati come Skyline

• La valutazione quantitativa preliminare dei flussi di lavoro EAD MRMHR mostra prestazioni promettenti per la quantificazione solida e accurata di PTM labili

Da:

https://f.hubspotusercontent40.net/hubfs/547446/Technology%20Networks/TN%20Editorial%20Calendar/Article/SCIEX%20-%20Article%20Sponsorship/2022/Feb/Landing%20Page/EAD-for-Phospho_7600_RUO-MKT-02-13174-A.pdf?__hstc=8807082.074aceb79027e793890018c0152531d2.1643566337753.1650333391468.1651364927218.34&__hssc=8807082.1.1651364927218&__hsfp=1392618001&hsCtaTracking=45f2dabe-8bf4-41d1-b792-6a160c25b64b%7C541748aa-9d7c-4e1f-9aeb-684cd1c6e20f