Minimizing PCR Inhibition. Nucleic Acid Purification Goes Green / Ridurre al minimo l'inibizione della PCR. La purificazione degli acidi nucleici diventa verde

Minimizing PCR Inhibition. Nucleic Acid Purification Goes Green / Ridurre al minimo l'inibizione della PCR. La purificazione degli acidi nucleici diventa verde

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Nucleic acid purification with GenEluteTM-E kits. Take advantage of single spin purification methods to save time and reduce waste compared to silica-based kits. 

• Simplified Workflow to reduce handling and removal of wash steps.

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 • Superior Performance for reliable purification, fewer PCR inhibitors, and improved downstream results.

PICKING COLONIES FOR PCR

Colony PCR is a quick and easy way to screen bacterial or yeast clones after genetic manipulation. By performing PCR on a small batch of cells, researchers can quickly identify colonies that have taken up a target sequence. While this is a simple procedure, false negative results are common, yet avoidable. 

From Plate to PCR

 Traditionally, researchers screen clones by inoculating colonies into individual tubes containing a growth medium and performing plasmid purifications on each sample after one to two days of incubation. Then, they cut the isolated plasmids with restriction enzymes and run the reactions on agarose gels to determine the presence and size of the inserted DNA. A simpler, higher-throughput way to screen for insert DNA during cloning experiments is to use colony PCR. Because PCR is highly sensitive, it can amplify target sequences from small amounts of template DNA, such as from a portion of a microbial colony on an agar plate, which allows researchers to avoid plasmid purification and restriction digestion steps. For most colonies, researchers can pick up a portion with a sterile toothpick or micropipette tip and mix the cells directly into a PCR reaction mixture. They should also re-streak the rest of the colony on a fresh plate or inoculate growth medium to save the clone for future use. Once the PCR tubes are in the thermal cycler, an initial high temperature heating step lyses the cells and frees the plasmid DNA to be used as a template for the reaction. Because PCR is highly sensitive, DNA from a small number of cells is enough to amplify sufficient quantities of target sequence. After PCR and gel electrophoresis, scientists identify positive colonies and perform DNA extraction to isolate the plasmid for further sequencing or cloning steps. 

Optimizing Colony PCR 

While colony PCR seems straightforward, there is room for error. Positive controls such as bacteria transformed with the same backbone plasmid for vector-specific primers and negative controls such as untransformed bacteria for insertion-specific primers help researchers assess problems with PCR. When performing colony PCR, it is easy to overload the reaction with too many cells. The PCR master mix may be a little cloudy after sample addition, but it should not be opaque. For especially thick colonies, researchers can resuspend and dilute their colonies in water or a PCR-compatible buffer, such as TrisEDTA (TE), and use that suspension for their PCR. For more challenging samples, researchers may extend the cell lysis PCR step to help break down bacterial cell membranes or yeast cell walls. Alternatively, they can make cell suspensions and lyse cells with high heat prior to adding the PCR mix. Colony PCRs can also fail due to PCR inhibitors that often come from the cells, including proteins that degrade polymerases or destroy or sequester nucleic acids. The medium that the colonies were taken from can also harbor PCR inhibitors. Commonly-used DNA polymerases, such as Taq, are especially susceptible to PCR inhibition by these factors. PCR mixes formulated for successful colony PCR help scientists avoid false negative results and speed up the cloning process. These PCR kits contain polymerases that tolerate inhibitors found in media and cell debris and that work with common microbial cloning and expression strains. Additionally, the PCR components often come formulated in master mixes with all of the reagents combined, including gel running dye, which enables scientists to avoid multiple pipetting steps and reduces the risk of contamination. 

Colony PCR Tips 

• Use sterile tools and save a portion of each tested colony for future applications

 • Avoid overloading the reaction and lyse cells thoroughly with high heat 

• Perform PCR with a specialized polymerase that tolerates inhibitors

ITALIANO

Purificazione degli acidi nucleici con i kit GenEluteTM-E. Sfrutta i metodi di purificazione a centrifuga singola per risparmiare tempo e ridurre gli sprechi rispetto ai kit a base di silice.

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RACCOLTA COLONIE PER PCR

Colony PCR è un modo semplice e veloce per eseguire lo screening di cloni batterici o di lievito dopo la manipolazione genetica. Eseguendo la PCR su un piccolo lotto di cellule, i ricercatori possono identificare rapidamente le colonie che hanno preso una sequenza bersaglio. Sebbene questa sia una procedura semplice, i risultati falsi negativi sono comuni, ma evitabili.

Dalla piastra alla PCR

Tradizionalmente, i ricercatori selezionano i cloni inoculando le colonie in singole provette contenenti un mezzo di crescita ed eseguendo purificazioni di plasmidi su ciascun campione dopo uno o due giorni di incubazione. Quindi, tagliano i plasmidi isolati con enzimi di restrizione ed eseguono le reazioni su gel di agarosio per determinare la presenza e la dimensione del DNA inserito. Un modo più semplice e con una maggiore produttività per lo screening dell'inserto del DNA durante gli esperimenti di clonazione consiste nell'utilizzare la PCR di colonia. Poiché la PCR è altamente sensibile, può amplificare le sequenze bersaglio da piccole quantità di DNA stampo, ad esempio da una porzione di una colonia microbica su una piastra di agar, che consente ai ricercatori di evitare la purificazione del plasmide e le fasi di digestione di restrizione. Per la maggior parte delle colonie, i ricercatori possono prelevare una porzione con uno stuzzicadenti sterile o una punta di micropipetta e mescolare le cellule direttamente in una miscela di reazione PCR. Dovrebbero anche strisciare nuovamente il resto della colonia su una piastra fresca od inoculare un mezzo di crescita per salvare il clone per un uso futuro. Una volta che le provette per PCR sono nel termociclatore, una fase iniziale di riscaldamento ad alta temperatura lisa le cellule e libera il DNA plasmidico da utilizzare come stampo per la reazione. Poiché la PCR è altamente sensibile, il DNA di un piccolo numero di cellule è sufficiente per amplificare quantità sufficienti di sequenza bersaglio. Dopo la PCR e l'elettroforesi su gel, gli scienziati identificano le colonie positive ed eseguono l'estrazione del DNA per isolare il plasmide per ulteriori fasi di sequenziamento o clonazione.

Ottimizzazione della PCR della colonia

Sebbene la PCR della colonia sembri semplice, c'è spazio per gli errori. I controlli positivi come i batteri trasformati con lo stesso plasmide della spina dorsale per i primer specifici del vettore ed i controlli negativi come i batteri non trasformati per i primer specifici per l'inserimento aiutano i ricercatori a valutare i problemi con la PCR. Quando si esegue la PCR in colonia, è facile sovraccaricare la reazione con troppe cellule. La master mix PCR potrebbe essere un po' torbida dopo l'aggiunta del campione, ma non dovrebbe essere opaca. Per colonie particolarmente spesse, i ricercatori possono risospendere e diluire le loro colonie in acqua o in un tampone compatibile con la PCR, come TrisEDTA (TE), ed utilizzare quella sospensione per la loro PCR. Per campioni più impegnativi, i ricercatori possono estendere la fase della PCR di lisi cellulare per aiutare ad abbattere le membrane cellulari batteriche o le pareti cellulari del lievito. In alternativa, possono produrre sospensioni cellulari e lisare le cellule a calore elevato prima di aggiungere la miscela PCR. Le colonie PCR possono anche fallire a causa degli inibitori della PCR che spesso provengono dalle cellule, comprese le proteine ​​che degradano le polimerasi o distruggono o sequestrano gli acidi nucleici. Il terreno da cui sono state prelevate le colonie può anche ospitare inibitori della PCR. DNA comunemente usato le polimerasi, come Taq, sono particolarmente suscettibili all'inibizione della PCR da parte di questi fattori. Le miscele PCR formulate per la PCR di colonie di successo aiutano gli scienziati ad evitare risultati falsi negativi ed ad accelerare il processo di clonazione. Questi kit PCR contengono polimerasi che tollerano gli inibitori presenti nei terreni e nei detriti cellulari e che funzionano con clonazione microbica comune e ceppi di espressione. Inoltre, i componenti della PCR vengono spesso formulati in master mix con tutti i reagenti combinati, incluso il colorante in gel, che consente agli scienziati di evitare più fasi di pipettaggio e riduce il rischio di contaminazione.

Suggerimenti per la PCR sulla colonia

• Utilizzare strumenti sterili e conservare una parte di ciascuna colonia testata per applicazioni future

 • Evitare di sovraccaricare la reazione e lisare bene le cellule con calore elevato

• Eseguire la PCR con una polimerasi specializzata che tollera gli inibitori

Da:

https://offers.the-scientist.com/hubfs/TS_PPL_MilliporeSigma_PCR_Custom%20eBook/44598_TS__Merck-PCR_ebook_JL-4_FINAL.pdf?hsCtaTracking=1f69cf41-b20c-4197-8731-c7a75dbdf409%7Ce10466a2-2a19-48d7-97f6-bc7f550e5169