Valutare la purezza del prodotto per terapia cellulare con Aura CL / Evaluate Cell Therapy Product Purity with Aura CL
Valutare la purezza del prodotto per terapia cellulare con Aura CL / Evaluate Cell Therapy Product Purity with Aura CL
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Figura 2: Grafico a dispersione di Dynabeads mescolato con cellule CAR-T. Nel software Particle Vue 4.0 le popolazioni di particelle possono essere raggruppate insieme. Tracciando il diametro (asse X) e l'intensità SIMI (asse Y) le popolazioni di Dynabeads (blu) possono essere differenziate dalle cellule CAR-T (azzurro) e dalle popolazioni di particelle non cellulari (gialle). / Scatterplot of Dynabeads mixed with CAR-T cells. In Particle Vue 4.0 software particle populations can be grouped together. By plotting diameter (X-axis) and SIMI intensity (Y-axis) Dynabeads populations (blue) can be differentiated from CAR-T cells (light blue) and non-cellular (yellow) particle populations.
Riassunto
Il flusso di lavoro di sviluppo CAR-T è un processo in più fasi che include la trasfezione di cellule T con un vettore virale per esprimere un antigene chimerico e l'attivazione/espansione del CAR-T utilizzando una molecola come un Dynabead coniugato a CD3/CD28. Ciascuno di questi passaggi è una potenziale fonte di contaminazione che deve essere rimossa per garantire la purezza del prodotto finale di terapia cellulare. Aura CL™ applica più metodi di rilevamento per facilitare il rilevamento e l'identificazione accurati dei contaminanti in un campione CAR-T. Questa ortogonalità incorporata utilizza la microscopia a membrana a fluorescenza (FMM), l'imaging a membrana in background (BMI) e la modalità di illuminazione laterale (SIMI) per caratterizzare completamente le particelle subvisibili, consentendo il rilevamento di cellule CAR-T, aggregati proteici, contaminanti non biologici e comprensione dei diversi componenti in un aggregato misto. Il tutto utilizzando un unico test ad alto rendimento che genera dati per 96 campioni in poche ore.
Introduzione
Con l'avvento delle terapie cellulari CAR-T di grado clinico e la recente approvazione della FDA di due terapie cellulari CAR-T autologhe, Yescarta® e Kymriah®, la capacità di differenziare le particelle contaminanti dal processo di produzione è una sfida chiave. Cellule differenziate da altri tipi di particelle subvisibili nella cellula la terapia è praticamente impossibile date le sfide insite nella caratterizzazione delle cellule utilizzando analizzatori di particelle tradizionali e tecniche di imaging del flusso, combinate con il rendimento relativamente basso della citometria a flusso. Uno studio recente che ha esaminato l'uso dei metodi farmacopei, l'oscuramento della luce (LO) e l'imaging del flusso (FI) per l'analisi cellulare ha rilevato che l'accuratezza del conteggio cellulare era rispettivamente solo del 60% e del 50%. È stato ipotizzato che le cellule sfocate nei canali fluidici alti 300 μm per questi sistemi e l'aggregazione cellulare spiegassero il massiccio calo del conteggio, del dimensionamento e dell'accuratezza morfologica.
Quantificare il contenuto di particelle subvisibili nelle terapie cellulari è incredibilmente difficile poiché le cellule stesse sono di natura subvisibile. La complessità intrinseca nella produzione e fornitura di terapie cellulari CAR-T, dalla raccolta, trasduzione virale, espansione e conservazione, si traduce in un maggiore potenziale per la formazione di aggregati cellulari e non cellulari di grandi dimensioni che influiscono sulla sicurezza clinica e sui risultati di efficacia. Come parte del processo di produzione, una pratica comune consiste nell'utilizzare Dynabeads™ ai fini dell'arricchimento e dell'isolamento delle cellule CAR-T. Le perle devono essere rimosse dal prodotto finale per garantire la purezza del prodotto per evitare di essere considerato un contaminante non biologico insieme a fibre, plastica e gomma. Con l'importanza della sicurezza clinica e dei risultati di efficacia, la sfida chiave rimane quella di poter contare,
Aura CL™ consente la valutazione della purezza del prodotto per terapia cellulare combinando l' imaging a membrana in background (BMI ) con la microscopia a membrana a fluorescenza (FMM). Questo nuovo metodo di identificazione delle particelle identifica, classifica ed esamina ulteriormente le particelle più comuni nel prodotto per terapia cellulare. Utilizza la chimica estrinseca dei coloranti fluorescenti per distinguere tra contaminanti cellulari (es. cellule CAR-T), non cellulari (es. proteine e lipidi) e non biologici (es. Dynabeads e fibre residue) e quantificarne la presenza.
Qui, illustriamo le capacità dinamiche di Aura CL di identificare, contare e caratterizzare i contaminanti di particelle subvisibili introdotti nel processo di produzione della terapia cellulare dalle cellule CAR-T. Qui, dimostriamo la compatibilità del sistema con metodi di etichettatura fluorescenti ben consolidati per una facile identificazione di cellule e particelle subvisibili nella valutazione della purezza del prodotto.
Reagenti e apparecchiature
Reagenti
- Cellule CAR-T
- Human T-Activator CD3/CD28 Dynabeads (ThermoFisher Scientific, n. catalogo: 11131D)
- DAPI (2 μg/mL)
- Hoechst 33342 (10 μg/mL)
- Tioflavina T
Strumento
- Strumento Aura CL
- Piatti Black Halo Labs
Procedura
Le cellule CAR-T sono state miscelate con Dynabeads CD3/CD28 dell'attivatore T umano (ThermoFisher Scientific, n. di catalogo: 11131D) e 50 μL della sospensione risultante caricata su una piastra di membrana con sfondo che è stata quindi sottoposta a imaging utilizzando Brightfield e SIMI. Come descritto in precedenza nella nota applicativa 12 , il campione è stato successivamente colorato con DAPI (2 μg/mL) o Hoechst 33342 (10 μg/mL) per colorare specificamente il DNA cellulare e ripreso utilizzando il canale FL2. Inoltre, i campioni potrebbero anche essere controcolorati con tioflavina T, che etichetta specificamente gli aggregati proteici, e rilevati utilizzando FMM nel canale FL1.
Risultati
Imaging e analisi CAR-T
Campioni che utilizzano BMI e FMM L'analisi della terapia CAR-T su Aura CL inizia con l'immagine del pozzetto BMI, in cui immagini ad alto contrasto e ad alta risoluzione forniscono il panorama per contare e dimensionare le particelle nel prodotto di terapia cellulare. L'incorporazione di due canali di fluorescenza offre l'opportunità di esperimenti a doppio colore, combinati con BMI e SIMI, per consentire la completa caratterizzazione e identificazione di diverse particelle subvisibili. La Figura 1 evidenzia diversi tipi di particelle subvisibili che possono essere identificate utilizzando Aura CL. È stata fotografata una varietà di particelle subvisibili, comprese le cellule CAR-T (Figura 1a), le Dynabead residue nel campione (Figura 1b) e gli aggregati proteici del lisozima (Figura 1c), utilizzando campo chiaro (BF), SIMI, FL1 e FL2 seguenti l'applicazione rispettivamente di una proteina e di una colorazione del DNA.
Simile ai Dynabeads, le cellule CAR-T dimostrano un buon contrasto in campo chiaro utilizzando l'IMC. Inoltre, le cellule CAR-T hanno un'illuminazione laterale bassa e sono positive sia per la proteina (FL1) che per il DNA (FL2). Al contrario, Dynabeads ha dimostrato una maggiore intensità SIMI e una bassa intensità di colorazione di proteine (FL1) e DNA (FL2) in contrasto con gli aggregati proteici che erano polimorfici esibendo un'intensità del campo chiaro variabile, SIMI bassa, positiva per la colorazione della proteina (FL1) e negativa per il DNA macchia (FL2). Pertanto, la differenziazione tra Dynabeads, cellule e aggregati proteici in un campione complesso utilizzando Aura CL è rapida e specifica grazie all'ortogonalità incorporata dell'utilizzo delle caratteristiche morfologiche dell'imaging in campo chiaro, SIMI e dell'intensità della fluorescenza per identificare le particelle.
Identificazione di Dynabead in una popolazione di cellule CAR-T
Aura CL combina BMI con FMM per distinguere tra particelle in base alle dimensioni, alle caratteristiche morfologiche e alle proprietà fluorescenti. Dimensioni e morfologia sono caratteristiche utili per differenziare tra queste tre particelle, mentre le proprietà di fluorescenza confermano definitivamente cos'è la particella.
L'utilizzo del grafico a dispersione per tracciare il diametro delle particelle (ECD) rispetto all'intensità SIMI ha consentito l'identificazione di una singola popolazione di Dynabeads (Figura 2). In combinazione con lo strumento di raggruppamento disponibile nel software Particle Vue 4.0, siamo stati in grado di tenere conto della popolazione totale di Dynabeads, della popolazione di cellule CAR-T e della popolazione di particelle non cellulari. Con la caratterizzazione SIMI, Dynabeads ha diffuso più luce, probabilmente a causa del loro indice di rifrazione più elevato e della natura solida, mentre le cellule hanno un indice di rifrazione inferiore e una natura meccanicamente conforme che produrrà una minore dispersione della luce quando la luce incidente è ad angolo obliquo.
L'identificazione dei contaminanti Dynabead residui in un campione misto è stato semplice utilizzando Aura CL. Le cellule erano positive per le proteine (FL1) e avevano un diametro delle particelle maggiore rispetto alle Dynabeads. Inoltre, il grafico a dispersione mostrato nella Figura 4 delle cellule CAR-T e Dynabeads tracciato come ECD (diametro) rispetto a FL2 (intensità di Hoescht) ha dimostrato che le cellule sono fortemente fluorescenti quando colorate con Hoechst e Dynabeads rimangono non fluorescenti. Combinando queste caratteristiche (diametro, intensità SIMI e intensità FL) è possibile distinguere facilmente Dynabeads dalle cellule. L'analisi ad alto rendimento di Aura CL e l'ortogonalità incorporata consentono la differenziazione chimica, biologica e morfologica tra le cellule CAR-T e le Dynabead, facilitando il rilevamento e l'identificazione di singole sfere.
Discriminazione tra cellule CAR-T all'interno di una fibra
L'FMM è particolarmente potente quando si analizzano le particelle nelle immediate vicinanze. L'IMC racconta solo una parte della storia quando le particelle sono particolarmente vicine o attaccate insieme. Il lungo filamento osservato potrebbe essere caratterizzato come una fibra contaminante utilizzando metodi di analisi delle particelle con solo capacità di imaging in campo chiaro. Tuttavia, quando si utilizza la capacità di Aura CL di identificare selettivamente diversi tipi di particelle con FMM, diventa chiaro che l'aggregato in questione non è una particella, ma una miscela di cellule CAR-T all'interno della fibra contaminante. Solo le cellule CAR-T all'interno della fibra emettono fluorescenza nel canale FL2, distinguendolo chiaramente dalla fibra circostante.
Generazione di conteggi specifici per l'intero set di dati utilizzando lo strumento del motore di espressioni
Lo strumento del motore di espressione situato nel software fornisce conteggi di particelle basati su parametri morfologici, SIMI e intensità di fluorescenza. Attraverso l'applicazione della logica booleana, è possibile fornire conteggi di particelle specifici per l'intero set di dati dell'esperimento consentendo una rapida analisi di alto livello e conteggi individuali per le cellule CAR-T e altre particelle. I parametri per l'espressione possono essere determinati dal grafico a dispersione delle particelle e applicati contemporaneamente all'intero set di dati. Lo strumento del motore di espressione semplifica l'analisi dei dati, generando automaticamente dati quantitativi come i conteggi per ml per ciascuna popolazione definita. I conteggi totali di particelle per ml, determinati dallo strumento del motore di espressione, sono presentati ed utilizzati per determinare la purezza del prodotto. Il campione CAR-T analizzato era puro al 69%.
Note e commenti
Aura CL è posizionato in modo univoco per determinare la purezza del prodotto. Caratterizza completamente le particelle subvisibili nei prodotti per la terapia cellulare e identifica distintamente le particelle contaminanti come Dynabeads e fibre introdotte nel processo di produzione. Qui, abbiamo dimostrato che utilizzando BMI e SIMI in combinazione con fluorescente FMMLe colorazioni non solo consentono la rapida identificazione di cellule CAR-T, aggregati proteici e particelle contaminanti non biologiche, ma anche l'identificazione di aggregati misti in un unico saggio ad alto rendimento. Il test è anche molto flessibile, consentendo l'analisi di campioni da 5 μL a 10 mL, a seconda dell'applicazione e della disponibilità del campione. Con lo strumento del motore di espressione disponibile con il software Particle Vue, è possibile acquisire rapide informazioni di alto livello sulle cellule CAR-T e altre particelle sull'intero set di dati dell'esperimento e contemporaneamente utilizzate per determinare con precisione la purezza del prodotto. Rispetto alle tecniche di imaging a flusso e citometria standard, il throughput di FMM è 100 volte superiore e utilizza l'analisi di conteggio e dimensionamento delle particelle migliore della categoria che ha le sue radici nella microscopia a membrana ben consolidata trovata in USP 788.
ENGLISH
Abstract
The CAR-T development workflow is a multi-step process that includes transfection of T cells with a viral vector to express a chimeric antigen and activation/expansion of the CAR-T using a molecule like a Dynabead conjugated to CD3/CD28. Each of these steps is a potential source of contamination that needs to be removed to ensure the purity of the final cell therapy product. Aura CL™ applies multiple detection methods to facilitate the accurate detection and identification of contaminants in a CAR-T sample. This built-in orthogonality uses fluorescence membrane microscopy (FMM), backgrounded membrane imaging (BMI), and side illumination mode (SIMI) to fully characterize subvisible particles, enabling detection of CAR-T cells, protein aggregates, non-biological contaminants, and understanding of the different components in a mixed aggregate. All using a single, high-throughput assay that generates data for 96 samples in just a few hours.
Introduction
With the advent of clinical-grade CAR-T cell therapies and the recent FDA approval of two autologous CAR-T cell therapies, Yescarta® and Kymriah®, the ability to differentiate contaminating particles from the manufacturing process is a key challenge. Differentiating cells from other types of subvisible particles in the cell therapeutic is virtually impossible given the inherent challenges in characterizing cells using traditional particle analyzers and flow imaging techniques, combined with the relatively low throughput of flow cytometry. A recent study examining the use of the pharmacopeial methods, light obscuration (LO), and flow imaging (FI) for cell analysis found that the cell counting accuracy was only 60% and 50%, respectively. It was postulated that out-of-focus cells in the tall 300 μm fluidic channels for these systems and cell clumping accounted for the massive drop in counting, sizing, and morphological accuracy.
Quantifying subvisible particle content in cellular therapies is incredibly difficult since cells themselves are subvisible in nature. The inherent complexity in the manufacture and supply of CAR-T cell therapies, from collection, viral transduction, expansion and storage, results in greater potential for the formation of large cell and non-cell aggregates affecting clinical safety and efficacy outcomes. As a part of the manufacturing process, a common practice is to use Dynabeads™ for the purposes of enrichment and isolation of CAR-T cells. The beads must be removed from the final product to ensure product purity to avoid being considered a non-biological contaminant along with fibers, plastics, and rubber. With the importance of clinical safety and efficacy outcomes, the key challenge remains being able to count, size and differentiate these sub-visible particles (e.g., Dynabeads) from the therapeutic cells, themselves a sub-visible particle.
Aura CL™ enables cell therapy product purity assessment by combining Backgrounded Membrane Imaging (BMI) with Fluorescence Membrane Microscopy (FMM). This novel particle identification method identifies, categorizes, and further scrutinizes the most common particles in the cell therapy product. It uses established extrinsic fluorescent dye chemistries to distinguish between cellular (e.g., CAR-T cells), non-cellular (e.g., proteins and lipids), and nonbiological contaminants (e.g., residual Dynabeads and fibers) and quantify their presence.
Here, we illustrate the dynamic capabilities of Aura CL to identify, count, and characterize subvisible particle contaminants introduced in the cell therapy manufacturing process from CAR-T cells. Here, we demonstrate the system’s compatibility with well established fluorescent labeling methods for easy identification of cell and subvisible particles in assessing product purity.
Reagents and Equipment
Reagents
- CAR-T cells
- Human T-Activator CD3/CD28 Dynabeads (ThermoFisher Scientific, catalog no: 11131D)
- DAPI (2 μg/mL)
- Hoechst 33342 (10 μg/mL)
- Thioflavin T
Instrument
- Aura CL instrument
- Black Halo Labs plates
Procedure
CAR-T cells were mixed with Human T-Activator CD3/CD28 Dynabeads (ThermoFisher Scientific, catalog no: 11131D) and 50 μL of the resultant suspension loaded onto a backgrounded membrane plate that was then imaged using Brightfield and SIMI. As previously described in Application Note 12, the sample was subsequently stained with DAPI (2 μg/mL) or Hoechst 33342 (10 μg/mL) to specifically stain for cellular DNA and imaged using the FL2 channel. In addition, samples could also be counterstained with Thioflavin T, which specifically labels protein aggregates, and detected using FMM in the FL1 channel.
Results
Imaging and Analyzing CAR-T
Samples Using BMI and FMM Analysis of the CAR-T therapy on Aura CL begins with the BMI well image, where high contrast, high resolution images provide the landscape to count and size the particles in your cell therapy product. The incorporation of two fluorescence channels provides the opportunity for dual-color experiments, combined with BMI and SIMI, to enable the complete characterization and identification of different subvisible particles. Figure 1 highlights different types of subvisible particle that can be identified using Aura CL. A variety of subvisible particles were imaged, including CAR-T cells (Figure 1a), residual Dynabeads in the sample (Figure 1b), and lysozyme protein aggregates (Figure 1c), using brightfield (BF), SIMI, FL1, and FL2 following the application of a protein and DNA stain, respectively.
Similar to the Dynabeads, CAR-T cells demonstrate good contrast in brightfield using BMI. In addition, CAR-T cells have low side illumination and are positive for both protein (FL1) and DNA (FL2). Conversely, Dynabeads demonstrated higher SIMI intensity and low protein (FL1) and DNA (FL2) staining intensity in contrast to protein aggregates which were polymorphic exhibiting variable brightfield intensity, low SIMI, positive for the protein stain (FL1), and negative for the DNA stain (FL2). Thus, differentiating between Dynabeads, cells, and protein aggregates in a complex sample using Aura CL is fast and specific due to the builtin orthogonality of using morphology characteristics from brightfield imaging, SIMI, and fluorescence intensity to identify particles. Differentiating particles with other methodologies is more challenging since LO doesn’t produce images and neither LO or FI offer SIMI or fluoresence detection.
Identification of Dynabeads in a CAR-T Cell Population
Aura CL combines BMI with FMM to distinguish between particles based on size, morphological features, and fluorescent properties. Size and morphology are useful features to differentiate between these three particles, whereas fluorescence properties definitively confirm what the particle is.
Using the scatterplot to plot particle diameter (ECD) against SIMI intensity allowed for the identification of a single population of Dynabeads (Figure 2). In combination with the grouping tool available in Particle Vue 4.0 software, we were able to account for the total Dynabeads population, CAR-T cell population and non-cellular particle population. With SIMI characterization, Dynabeads scattered more light, likely due to their higher refractive index and solid nature, whereas cells have a lower refractive index and mechanically compliant nature which will produce less light scattering when incident light is at an oblique angle.
Identifying residual Dynabead contaminants in a mixed sample was simple using Aura CL. As seen in Figure 3, cells were positive for protein (FL1) and had a greater particle diameter compared to the Dynabeads. Additionally, the scatterplot shown in Figure 4 of CAR-T cells and Dynabeads plotted as ECD (diameter) versus FL2 (Hoescht intensity) demonstrated that the cells fluoresce strongly when stained by Hoechst and Dynabeads remain nonfluorescent. Combining these characteristics (diameter, SIMI intensity and FL intensity) it is possible to easily distinguish Dynabeads from cells. Aura CL’s high throughput analysis and built-in orthogonality enables chemical, biological, and morphological differentiation between CAR-T cells and Dynabeads, making single bead detection and identification easy. Aura CL achieves definitive identification and better detection of potentially dangerous product impurities and contaminants such as Dynabeads during lot analysis, validation, and release.
Discriminating between CAR-T Cells Inside a Fiber
FMM is particularly powerful when analyzing particles in close proximity. BMI only tells part of the story when particles are particularly close or stuck together. The long filament observed could be characterized as one contaminant fiber using particle analysis methods with only brightfield imaging capabilities. However, when you utilize the ability of Aura CL to selectively identify different types of particles with FMM, it becomes clear that the aggregate in question is not one particle, but a mixture CAR-T cells within the contaminant fiber. Only the CAR-T cells within the fiber fluoresce in the FL2 channel, clearly distinguishing it from the surrounding fiber. This adds to the lack of cell counting accuracy observed with techniques that don’t have the ability to clearly identify CAR-T cells from other particles in the sample using FMM.
Generating Specific Counts for the Whole Dataset using the Expression Engine Tool
The expression engine tool located in the software provides particle counts based on morphological, SIMI, and Fluorescence Intensity metrics. Through the application of Boolean logic, it is possible to provide specific particle counts for whole experiment dataset enabling rapid high-level insight and individual counts for CAR-T cells and other particles. The parameters for the expression can be determined from the scatterplot of the particles and simultaneously applied to the whole dataset. The expression engine tool streamlines data analysis, automatically generating quantitative data like the counts per mL for each population defined. Total particle counts per mL, determined by the expression engine tool, are presented and used to determine the product purity. The CAR-T sample analyzed was 69% pure. Of the 31% non-cellular contaminated detected, 64% could be attributed to the Dynabeads.
Notes and Comments
Aura CL is uniquely positioned to determine product purity. It fully characterize subvisible particles in cell therapy products and distinctly identifies contaminating particles such as Dynabeads and fibers introduced in the manufacturing process. Here, we showed that using BMI and SIMI in combination with FMM fluorescent stains not only allows for the rapid identification of CAR-T cells, protein aggregates, and non-biological contaminant particles, but also the identification of mixed aggregates in a single, high throughput assay. The assay is also very flexible, enabling analysis of 5 μL to 10 mL of samples, depending on your application and sample availability. With the expression engine tool available with Particle Vue software, rapid high-level insight about CAR-T cells and other particles can be captured on the whole experiment dataset and simultaneously used to accurately determine product purity. Compared to standard flow imaging and cytometry techniques, the throughput of FMM is 100x higher and uses best-in-class particle sizing and counting analysis that has its roots in the well-established membrane microscopy found in USP 788.
Da:
https://genprotocols.genengnews.com/protocols/evaluate-cell-therapy-product-purity-with-aura-cl/1073?utm_medium=newsletter&utm_source=GEN+Protocols&utm_content=01&utm_campaign=GEN+Protocols_20220628&oly_enc_id=2237J3762301I6G
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