METHYLATION SEQUENCING: CONVERSION AND CAPTURE / SEQUENZIAMENTO DELLA METILAZIONE: CONVERSIONE E CATTURA

METHYLATION SEQUENCING: CONVERSION AND CAPTURE / SEQUENZIAMENTO DELLA METILAZIONE: CONVERSIONE E CATTURA

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

“New enzymatic conversion technologies solve many of the technical problems associated with traditional bisulfite sequencing.”

“Kits with custom target capture libraries are built using the latest oligo synthesis technologies, which produce highly uniform panels that evenly capture sequences. These improvements lead to fewer wasted reads and improved read depth for rare variants.”

Early in cancer development, DNA methylation changes occur. These altered methylation patterns show up in circulating cell-free DNA, making them attractive potential biomarkers for diagnosis and disease monitoring. Liquid biopsies allow researchers and clinicians to analyze cells or nucleic acids from tumors by sampling blood or other bodily fluids. This noninvasive approach reveals altered methylation patterns and can be repeated in the same patient, circumventing bias associated with a biopsy from a small area of a heterogenous tumor. However, the amount of cell-free DNA in a typical plasma sample is small, so accurate analysis of these specimens presents technical challenges. 

The Benefits of Enzymatic Conversion

Researchers commonly perform DNA methylation detection using bisulfite sequencing. When they expose DNA to bisulfite sodium, unmethylated cytosines chemically convert to uracil, while methylated cytosines are protected from this chemical modification. After conversion, researchers amplify their samples using PCR and sequence the amplicons with next-generation sequencing technologies. This method has a number of advantages, including single base resolution and a relatively straightforward library preparation method. Nevertheless, bisulfite treatment requires high temperatures and a harsh pH that can damage DNA by causing strand breaks and depyrimidination. Unmethylated cytosines are especially vulnerable to degradation in this system, leading to lower coverage in GC-rich areas. This is problematic given that CpG island methylation is an area of special interest for cancer researchers. New enzymatic conversion technologies solve many of the technical problems associated with traditional bisulfite sequencing. These technologies swap out the bisulfite conversion step for enzymes that modify unmethylated cytosines. In one example of enzymatic conversion, a TET enzyme first oxidizes methylated cytosines (5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine) to protect them from deamination, which occurs in the following step when an APOBEC enzyme converts unmethylated, unprotected cytosines to uracils. This two-step process yields a better quality, more accurate readout. Enzymatic conversion causes less DNA damage than bisulfite sequencing because the reactions do not require a harsh temperature or pH, an advantage that is reflected in greater library yields after a lower number of cycles at the amplification step. Running fewer PCR cycles during amplification generates higher library complexity and fewer duplicates during sequencing. Another important benefit of switching to enzymatic conversion is the evenness of genome coverage; the degradation of GC-rich areas observed with bisulfite conversion is eliminated, resulting in uniform coverage across all DNA regions, as well as detection of up to 15% more methylated cytosines.

 Getting Specific with Target Capture

Although scientists sometimes assess methylation patterns across the entire genome using whole-genome methyl-seq, it saves time and money to perform target enrichment. This strategy allows greater depth of sequencing for areas of interest by utilizing probes that hybridize with and isolate target sequences, removing unwanted sequences in the process. With probe panels, researchers can enrich their samples for related sets of sequences such as oncogenes. In the methyl-seq workflow, target enrichment can be performed before conversion when sample DNA is plentiful. Alternatively, target enrichment after conversion is preferred for low-input, sensitive assays because the PCR step after conversion increases the yield of desired sequences. However, carrying out target enrichment after conversion presents additional challenges for panel design because the unique DNA sequences generated during conversion must be considered. Because unmethylated cytosines are sequenced as thymines after conversion and PCR amplification, some converted DNA sequences become less complex and therefore more difficult to capture, driving high off-target rates. Fortunately, new commercially available custom methylation panels have increased sensitivity due to an innovative design that enables them to capture all four potential types of DNA at a target site following conversion: methylated, unmethylated, sense, and antisense. Finally, researchers can use highly optimized, commercially available methyl-seq workflows to cut down on off-target capture and save time in the lab. The custom target capture panels within these wokflows are built using the latest oligo synthesis technologies, which produce highly uniform panels that evenly capture sequences. These improvements lead to fewer wasted reads and improved read depth for rare variants. Taken together, these new technologies make it possible for scientists to quickly and accurately assess the unique methylomes of even trace amounts of cell-free DNA across multiple patient samples, representing a step forward for cancer researchers.

ITALIANO

"Le nuove tecnologie di conversione enzimatica risolvono molti dei problemi tecnici associati al tradizionale sequenziamento del bisolfito".

“I kit con librerie di acquisizione target personalizzate sono costruiti utilizzando le più recenti tecnologie di sintesi oligo, che producono pannelli altamente uniformi che acquisiscono sequenze in modo uniforme. Questi miglioramenti portano ad un minor spreco di letture ed ad una maggiore profondità di lettura per le varianti rare".

All'inizio dello sviluppo del cancro, si verificano cambiamenti nella metilazione del DNA. Questi modelli di metilazione alterati si manifestano nel DNA libero da cellule circolanti, rendendoli potenziali biomarcatori interessanti per la diagnosi ed il monitoraggio della malattia. Le biopsie liquide consentono a ricercatori e medici di analizzare cellule od acidi nucleici da tumori prelevando sangue od altri fluidi corporei. Questo approccio non invasivo rivela schemi di metilazione alterati e può essere ripetuto nello stesso paziente, aggirando il bias associato ad una biopsia da una piccola area di un tumore eterogeneo. Tuttavia, la quantità di DNA privo di cellule in un tipico campione di plasma è piccola, quindi un'analisi accurata di questi campioni presenta sfide tecniche.

I vantaggi della conversione enzimatica

I ricercatori eseguono comunemente il rilevamento della metilazione del DNA utilizzando il sequenziamento del bisolfito. Quando espongono il DNA al bisolfito di sodio, le citosine non metilate si convertono chimicamente in uracile, mentre le citosine metilate sono protette da questa modificazione chimica. Dopo la conversione, i ricercatori amplificano i loro campioni utilizzando la PCR e sequenziano gli ampliconi con tecnologie di sequenziamento di nuova generazione. Questo metodo presenta una serie di vantaggi, tra cui una risoluzione di base singola ed un metodo di preparazione della libreria relativamente semplice. Tuttavia, il trattamento con bisolfito richiede temperature elevate e un pH rigido che può danneggiare il DNA causando rotture del filamento e depirimidinazione. Le citosine non metilate sono particolarmente vulnerabili alla degradazione in questo sistema, portando ad una minore copertura nelle aree ricche di GC. Questo è problematico dato che la metilazione dell'isola CpG è un'area di particolare interesse per i ricercatori sul cancro. Le nuove tecnologie di conversione enzimatica risolvono molti dei problemi tecnici associati al tradizionale sequenziamento del bisolfito. Queste tecnologie sostituiscono la fase di conversione del bisolfito con enzimi che modificano le citosine non metilate. In un esempio di conversione enzimatica, un enzima TET prima ossida le citosine metilate (5-metilcitosina e 5-idrossimetilcitosina) per proteggerle dalla deaminazione, che si verifica nella fase successiva quando un enzima APOBEC converte le citosine non metilate e non protette in uracili. Questo processo in due fasi produce una migliore qualità, una lettura più accurata. La conversione enzimatica provoca meno danni al DNA rispetto al sequenziamento del bisolfito perché le reazioni non richiedono una temperatura o un pH rigidi, un vantaggio che si riflette in maggiori rese della libreria dopo un numero inferiore di cicli nella fase di amplificazione. L'esecuzione di un minor numero di cicli PCR durante l'amplificazione genera una maggiore complessità della libreria e meno duplicati durante il sequenziamento. Un altro importante vantaggio del passaggio alla conversione enzimatica è l'uniformità della copertura del genoma; la degradazione delle aree ricche di GC osservata con la conversione del bisolfito viene eliminata, con conseguente copertura uniforme in tutte le regioni del DNA e rilevamento fino al 15% in più di citosine metilate.

 Diventare specifici con Target Capture

Sebbene gli scienziati a volte valutino i modelli di metilazione nell'intero genoma utilizzando il metil-seq dell'intero genoma, si risparmia tempo e denaro per eseguire l'arricchimento del bersaglio. Questa strategia consente una maggiore profondità di sequenziamento per le aree di interesse utilizzando sonde che si ibridano con ed isolano le sequenze target, rimuovendo le sequenze indesiderate nel processo. Con i pannelli delle sonde, i ricercatori possono arricchire i loro campioni per insiemi correlati di sequenze come gli oncogeni. Nel flusso di lavoro metil-seq, l'arricchimento del target può essere eseguito prima della conversione quando il DNA del campione è abbondante. In alternativa, l'arricchimento del target dopo la conversione è preferito per saggi sensibili a basso input poiché la fase PCR dopo la conversione aumenta la resa delle sequenze desiderate. Tuttavia, l'esecuzione dell'arricchimento del target dopo la conversione presenta ulteriori sfide per la progettazione del pannello poiché è necessario considerare le sequenze di DNA uniche generate durante la conversione. Poiché le citosine non metilate vengono sequenziate come timine dopo la conversione e l'amplificazione della PCR, alcune sequenze di DNA convertite diventano meno complesse e quindi più difficili da catturare, determinando tassi di fuori bersaglio elevati. Fortunatamente, i nuovi pannelli di metilazione personalizzati disponibili in commercio hanno una maggiore sensibilità grazie ad un progetto innovativo che consente loro di catturare tutti e quattro i potenziali tipi di DNA in un sito bersaglio dopo la conversione: metilato, non metilato, sensibile ed antisenso. Infine, i ricercatori possono utilizzare flussi di lavoro metil-seq altamente ottimizzati e disponibili in commercio per ridurre l'acquisizione fuori bersaglio e risparmiare tempo in laboratorio. I pannelli di acquisizione target personalizzati all'interno di questi flussi wok sono costruiti utilizzando le più recenti tecnologie di sintesi oligo, che producono pannelli altamente uniformi che acquisiscono sequenze in modo uniforme. Questi miglioramenti portano ad un minor numero di letture sprecate ed ad una maggiore profondità di lettura per le varianti rare. Nel loro insieme, queste nuove tecnologie consentono agli scienziati di valutare in modo rapido ed accurato i metilomi unici anche di tracce di DNA privo di cellule su più campioni di pazienti, rappresentando un passo avanti per i ricercatori sul cancro.

Da:

https://f.hubspotusercontent40.net/hubfs/547446/Technology%20Networks/Landing%20Pages/Twist%20Bio/February%202022/TheScientist_eBook_MethylSeq_TwistBio_1OCT21.pdf?__hstc=8807082.074aceb79027e793890018c0152531d2.1643566337753.1656453587914.1656890798726.61&__hssc=8807082.1.1656890798726&__hsfp=1067976316&hsCtaTracking=3e26d59c-323d-48cf-9d4e-95c22ce49954%7C2b320e2a-5273-4838-9047-b5d525def7c4