Metodi di convalida degli anticorpi / Antibody Validation Methods

 Metodi di convalida degli anticorpi / Antibody Validation Methods

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Trarre conclusioni accurate dai dati del test immunologico significa avere fiducia negli anticorpi che si utilizzano. Ma, con milioni di anticorpi disponibili sul mercato, alcuni di qualità migliore rispetto ad altri, trovare il prodotto giusto per la tua ricerca può essere un compito difficile. Questo articolo commenta ciò che rende un anticorpo ben convalidato e condivide suggerimenti per verificare le prestazioni degli anticorpi nel proprio sistema modello.

Identificazione di potenziali anticorpi

Controllare attentamente gli anticorpi prima di effettuare un acquisto è un passaggio fondamentale per ottenere un prodotto che soddisfi le tue esigenze. Funzionalità di ricerca di Biocompare ti consente di identificare rapidamente più fornitori per un anticorpo di interesse, ma dovresti quindi esaminare le schede tecniche del prodotto, le recensioni e le citazioni associate per trovare un anticorpo adatto all'uso previsto. "La scheda tecnica di un fornitore dovrebbe contenere informazioni chiare e dettagliate che coprano sia la produzione che le prestazioni degli anticorpi", riferisce Antonella Galli, Ph.D., Head of Characterization presso Abcam. “Le specifiche di produzione chiave comprendono il nome della proteina bersaglio, il numero del clone, la specie ospite, l'isotipo, il metodo di purificazione, la formulazione e la quantità. Le specifiche delle prestazioni dovrebbero includere dati di convalida convincenti che confermano il corretto utilizzo dell'anticorpo in particolari applicazioni, insieme a dettagli su come tali dati sono stati generati". Laddove le citazioni del prodotto vengono utilizzate per guidare la selezione degli anticorpi, Galli avverte di adottare un approccio critico, soprattutto per nuovi obiettivi in ​​cui i dati possono essere scarsi o conflittuali. "In questi casi, si consiglia di utilizzare un fornitore affidabile in grado di fornire dati di convalida tra le applicazioni per garantire che l'anticorpo ricevuto sia specifico, ad alta affinità, sensibile e riproducibile", afferma.

Trarre conclusioni accurate dai dati del test immunologico significa avere fiducia negli anticorpi che si utilizzano. Ma, con milioni di anticorpi disponibili sul mercato, alcuni di qualità migliore rispetto ad altri, trovare il prodotto giusto per la tua ricerca può essere un compito difficile. Questo articolo commenta ciò che rende un anticorpo ben convalidato e condivide suggerimenti per verificare le prestazioni degli anticorpi nel proprio sistema modello.

Identificazione di potenziali anticorpi

Controllare attentamente gli anticorpi prima di effettuare un acquisto è un passaggio fondamentale per ottenere un prodotto che soddisfi le tue esigenze. Funzionalità di ricerca di Biocompare ti consente di identificare rapidamente più fornitori per un anticorpo di interesse, ma dovresti quindi esaminare le schede tecniche del prodotto, le recensioni e le citazioni associate per trovare un anticorpo adatto all'uso previsto. "La scheda tecnica di un fornitore dovrebbe contenere informazioni chiare e dettagliate che coprano sia la produzione che le prestazioni degli anticorpi", riferisce Antonella Galli, Ph.D., Head of Characterization presso Abcam. “Le specifiche di produzione chiave comprendono il nome della proteina bersaglio, il numero del clone, la specie ospite, l'isotipo, il metodo di purificazione, la formulazione e la quantità. Le specifiche delle prestazioni dovrebbero includere dati di convalida convincenti che confermano il corretto utilizzo dell'anticorpo in particolari applicazioni, insieme a dettagli su come tali dati sono stati generati". Laddove le citazioni del prodotto vengono utilizzate per guidare la selezione degli anticorpi, Galli avverte di adottare un approccio critico, soprattutto per nuovi obiettivi in ​​cui i dati possono essere scarsi o conflittuali. "In questi casi, si consiglia di utilizzare un fornitore affidabile in grado di fornire dati di convalida tra le applicazioni per garantire che l'anticorpo ricevuto sia specifico, ad alta affinità, sensibile e riproducibile", afferma.

Evidenziando anche il valore dell'impiego di strategie multiple per la convalida degli anticorpi, Joanna Porankiewicz-Asplund, Ph.D., responsabile del supporto tecnico presso Agrisera, commenta che la convalida diretta e indiretta sono distinte. "Per gli anticorpi contro bersagli vitali per la funzione cellulare, come le proteine ​​fotosintetiche, non è possibile ottenere mutanti vitali", afferma. “Di conseguenza, in questa situazione, devono essere utilizzati metodi di validazione indiretta. Questi includono il controllo che l'anticorpo rilevi una banda del peso molecolare corretto su un Western blot, tenendo conto di qualsiasi elaborazione o modifica, e confermando che la stessa banda non è presente quando la membrana viene incubata con sieri preimmuni; determinare se una forma ricombinante della proteina è riconosciuta; eseguire studi sulla concorrenza con un peptide libero; eseguire test con campioni da condizioni specifiche note per aumentare o ridurre l'espressione della proteina bersaglio; e valutare le cross-reattività”. Consiglia inoltre che la selezione di anticorpi forniti solo con una garanzia di titolo nell'ELISA indiretto (in cui i pozzetti della micropiastra sono rivestiti con la proteina o il peptide immunizzante) potrebbe non essere una scelta sensata. "Di per sé, l'ELISA indiretto non è sufficiente per confermare la futura reattività di un dato anticorpo nel materiale del campione endogeno", afferma.

Secondo Eileen Gonzalez, Ph.D., Associate Product Manager for Antibody Applications presso BioLegend, è essenziale visualizzare i dati di convalida specifici dell'applicazione. "Nonostante siano allevati contro gli stessi bersagli antigenici, gli anticorpi non si comportano sempre con la stessa efficienza in diversi formati di test", spiega. “Per questo motivo, è importante reperire anticorpi che hanno dimostrato di funzionare nell'applicazione scelta e che, idealmente, sono stati convalidati con gli stessi tessuti o cellule del tipo di campione. Un buon produttore avrà completato i test su campioni che mostrano livelli variabili di espressione target endogena ed avrà eseguito controlli di knockout quando possibile. Quando un prodotto che è stato convalidato per l'applicazione e/o il tipo di campione scelto non sembra essere disponibile, un produttore che offre un supporto personalizzato può essere in grado di fornire ulteriori indicazioni. Ciò potrebbe includere suggerire se è probabile che un anticorpo funzioni in una particolare applicazione o se sono attualmente in corso test su ulteriori tipi di campioni".

Sforzo sostenuto dai produttori di anticorpi

Con i ricercatori che mettono sempre più in discussione la qualità degli anticorpi, i produttori stanno lavorando duramente per migliorare i loro processi di convalida. "In Abcam, convalidiamo i nostri anticorpi il più vicino possibile alle esigenze dei nostri clienti in modo che possano utilizzarli facilmente nei propri sistemi modello", riferisce Galli. "Ciò include l'esecuzione di studi di convalida in cellule primarie e microarray di tessuti, e di recente abbiamo anche lanciato un pacchetto di convalida degli anticorpi incentrato sul cliente per gli anticorpi ricombinanti immuno-oncologici chiave, che riteniamo saranno di particolare interesse per i clienti biofarmaceutici".

Agrisera si concentra fortemente sul miglioramento della convalida degli anticorpi per la biologia delle cellule vegetali ed algali, dove viene studiata una vasta gamma di specie, tessuti e tipi di campioni. "Avere accesso a materiale adatto, da organi come cellule fogliari, radicali, algali o diatomee, ed ai mutanti disponibili è essenziale per convalidare correttamente un anticorpo", spiega Porankiewicz-Asplund. “Grazie alla collaborazione con laboratori di tutto il mondo, siamo stati in grado di utilizzare i tipi di campioni più rilevanti per la convalida degli anticorpi contro le proteine ​​vegetali e algali, il che, a sua volta, ci ha consentito di sviluppare metodi per migliorare le possibilità di rilevamento del bersaglio. Ad esempio, sono necessari tamponi di estrazione altamente specifici per alcune proteine ​​bersaglio, che possono anche richiedere che l'isolamento sia effettuato sotto luce blu od utilizzando una particolare tecnica di estrazione.

BioLegend utilizza regolarmente metodi di test aggiuntivi oltre alle strategie di convalida esistenti. "Spesso, adatteremo i tipi di campioni che utilizziamo per la convalida per allinearli meglio con ciò che è noto sull'obiettivo", riferisce Gonzalez. “Ad esempio, se è stato dimostrato che il tessuto renale murino ha un'espressione 10 volte superiore di una determinata proteina rispetto al tessuto cerebrale, è normale che i nostri gruppi di sviluppo prodotto controllino la specificità dell'anticorpo contro entrambi i tipi di tessuto. Inoltre, generiamo spesso cellule knockout su richiesta, utilizzando le tecnologie RNAi, shRNA o CRISPR-Cas9".

Infine, Cartwright osserva che per aiutare i ricercatori ad eseguire la propria convalida, Bio-Techne offre un numero crescente di prodotti per supportare questo tipo di studi indipendenti. "I nostri prodotti standard per la convalida esterna degli anticorpi includono lisati cellulari, vetrini per tessuti e sonde e kit RNAscope ® ", afferma. "Inoltre, ci sforziamo continuamente di sviluppare anticorpi di alta qualità ed aumentare la gamma di prodotti disponibili per la loro convalida, non solo per l'uso da parte dei nostri gruppi interni, ma anche dai nostri clienti".

ENGLISH

Drawing accurate conclusions from immunoassay data means having confidence in the antibodies that you use. But, with millions of antibodies available on the market—some of better quality than others—finding the right product for your research can be a difficult task. This article comments on what makes a well-validated antibody and shares tips for verifying antibody performance in your own model system.

Identifying potential antibodies

Carefully scrutinizing antibodies before making a purchase is a critical step in obtaining a product that meets your needs. Biocompare’s search functionality allows you to quickly identify multiple vendors for an antibody of interest, but you should then examine the associated product datasheets, reviews, and citations to home in on a suitable antibody for your intended use. “A vendor’s datasheet should contain clear, detailed information covering both antibody production and performance,” reports Antonella Galli, Ph.D., Head of Characterization at Abcam. “Key manufacturing specifics comprise the name of the target protein, clone number, host species, isotype, purification method, formulation, and quantity. Performance specifics should include convincing validation data confirming the antibody’s successful use in particular applications, along with details of how those data were generated.” Where product citations are used to guide antibody selection, Galli cautions adopting a critical approach, especially for novel targets where data may be scarce or conflictual. “In these instances, using a reliable vendor that can provide validation data across applications is recommended to ensure the antibody you receive is specific, high-affinity, sensitive, and reproducible,” she says.

Seeing data from multiple validation strategies is essential

So, what makes convincing validation data? Emily Cartwright, Senior Product Marketing Specialist for Antibodies at Bio-Techne, explains that where validation involves using multiple strategies, it provides a more complete picture of how an antibody will perform. “At Bio-Techne, we validate our antibodies for specificity based on the 5-Pillar Model from the International Working Group for Antibody Validation,” she says. “This comprises genetic strategies such as knockout and knockdown; biological or chemical modulation of protein expression; using an independent antibody targeting a different epitope; using a tagged or overexpressed protein; and non-antibody based, orthogonal methods such as RNAscope® ISH technology, which detects RNA and can be combined with protein detection by antibodies in the same cell. By sharing details of these tests on our product datasheets, we offer visual proof of antibody specificity, as well as provide a useful starting point from which researchers can perform similar validation experiments in their own model systems.” 

Also highlighting the value of employing multiple strategies for antibody validation, Joanna Porankiewicz-Asplund, Ph.D., Technical Support Manager at Agrisera, comments that direct and indirect validation are distinct. “For antibodies to targets that are vital to cellular function, such as photosynthetic proteins, obtaining viable mutants is not possible,” she says. “Consequently, in this situation, indirect validation methods must be used. These include checking that the antibody detects a band of the correct molecular weight on a Western blot—taking any processing or modifications into account—and confirming that the same band is not present when the membrane is incubated with pre-immune sera; determining whether a recombinant form of the protein is recognized; performing competition studies with a free peptide; running tests with samples from specific conditions known to up- or downregulate target protein expression; and assessing cross-reactivities.” She also advises that selecting antibodies supplied only with a titer guarantee in indirect ELISA (where the microplate wells are coated with the immunizing protein or peptide) may not be a sensible choice. “On its own, indirect ELISA is not enough to confirm future reactivity of a given antibody in endogenous sample material,” she says.

According to Eileen Gonzalez, Ph.D., Associate Product Manager for Antibody Applications at BioLegend, seeing application-specific validation data is essential. “Despite being raised against the same antigen targets, antibodies do not always perform with the same efficiency across different assay formats,” she explains. “For this reason, it is important to source antibodies that are proven to work in your chosen application and that have, ideally, been validated with the same tissues or cells as your sample type. A good manufacturer will have completed testing across samples exhibiting varying levels of endogenous target expression and will have run knockout controls whenever possible. When a product that has been validated for your chosen application and/or sample type does not appear to be available, a manufacturer offering personalized support may be able to provide further guidance. This could include suggesting whether an antibody is likely to work in a particular application or if testing in additional sample types is currently underway.”

Sustained effort by antibody manufacturers

With researchers increasingly questioning antibody quality, manufacturers are working hard to enhance their validation processes. “At Abcam, we validate our antibodies as closely as possible to our customers’ needs so that they can easily use them in their own model systems,” reports Galli. “This includes performing validation studies in primary cells and tissue microarrays, and we also recently launched a customer-centric antibody validation package for key immuno-oncology recombinant antibodies, which we believe will be of particular interest to biopharma customers.”

Agrisera has a strong focus on improving antibody validation for plant and algal cell biology, where a vast array of species, tissues, and sample types is being investigated. “Having access to suitable material—from organs like leaf, root, algal, or diatom cells—and available mutants is essential for properly validating an antibody,” explains Porankiewicz-Asplund. “Through collaboration with laboratories worldwide, we have been able to use the most relevant sample types for validating antibodies to plant and algal proteins which, in turn, has enabled us to develop methods for improved chances of target detection. For example, highly specific extraction buffers are required for certain target proteins, which may also require that isolation be carried out under blue light or using a particular extraction technique.”

BioLegend regularly employs additional testing methods alongside its existing validation strategies. “Often, we will adapt the types of samples we use for validation to better align with what is known about the target,” reports Gonzalez. “For instance, if it has been shown that murine kidney tissue has 10-fold higher expression of a given protein compared to brain tissue, it is common for our product development teams to check the antibody specificity against both tissue types. We also frequently generate knockout cells on demand, using RNAi, shRNA, or CRISPR-Cas9 technologies.”

Lastly, Cartwright notes that to aid researchers in performing their own validation, Bio-Techne offers a growing number of products to support these types of independent studies. “Our off-the-shelf products for externally validating antibodies include cell lysates, tissue slides, and RNAscope® probes and kits,” she says. “Moreover, we continually strive to develop high-quality antibodies and increase the range of products available for their validation—not only for use by our in-house teams but also by our customers.”

Da:

https://www.biocompare.com/Editorial-Articles/587206-Antibody-Validation-Methods/