New Developments in Live-cell Analysis / Nuovi sviluppi nell'analisi delle cellule vive

New Developments in Live-cell Analysis /  Nuovi sviluppi nell'analisi delle cellule vive

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Toward a Deeper Understanding of the Cell

While the fundamentals of cell culture techniques have not changed substantially in the last few decades, the approaches used to analyze the cells have advanced at an unprecedented rate. These new approaches are increasing our understanding of the signaling pathways involved in governing physiological and pathophysiological cellular processes. One of the transformative shifts has been the utilization of cells and cell engineering for regenerative medicine, gene therapy, and immunotherapy to treat previously intractable diseases of various origins. As cell analysis in basic research, translational medicine, and cell therapies becomes ever more sophisticated, it is imperative that solutions provide multiparametric and data-rich information. At Agilent Technologies, we believe that cell analysis is foundational to understanding disease mechanisms and designing safe and effective next-generation cell therapies. One of the most recent additions to Agilent’s innovative cell analysis portfolio is the Agilent xCELLigence RTCA eSight system

More than meets the eye

Combining the Power of Live-cell Imaging and Real-Time Cell Analysis (RTCA) Biosensors

The Agilent xCELLigence RTCA eSight instrument is a revolutionary instrument for cell analysis, featuring non-invasive impedance-based monitoring together with live-cell imaging

It combines the best aspects of impedance biosensor technology—unbiased, sensitive, and kinetic readouts, with the exquisite cell and mechanistic insights provided by live-cell imaging. Ultimately, this results in a deeper understanding of cell behavior and processes.

Simple, Sensitive, and Incisive

Non-perturbing, multiparametric kinetic assays, enabled by the xCELLigence eSight system dramatically reduces the number of samples being monitored, allowing for precise and reproducible experiments with low margins of error. Importantly, the multiparametric aspect of the system allows the interrogation of multiple cell events within a single experiment, precluding the need to conduct multiple experiments. The non-perturbing feature of the xCELLigence RTCA eSight allows for assessment of biology in real-time, bringing important contextual information into the experiment as well as allowing for measurement of specific processes.

One Experiment—Two Simultaneous Readouts and Multiple Perspectives

The workflow of the xCELLigence RTCA eSight starts with the cultivation of the cells of interest in specialized microplates containing impedance biosensors and a view area for imaging. Cell impedance provides exquisite sensitivity and information about cell viability, growth, morphology, and junctional interaction. With brightfield and three fluorescence channels, the live-cell imaging features of the xCELLigence RTCA eSight are compatible with fluorescence probes such as those for viability, toxicity, and apoptosis. Fluoresecent reporter proteins can also be used to provide real-time, quantitative and mechanistic data about the modulation of signaling pathways by specific treatments. This combination of information enables much wider sampling and the assessment of cell processes and Normalized Cell Index biology within a single experiment.

Capture what you are missing

 

Fig. Corroborating the impedance response with live-cell images. Image panels demonstrate the progression of apoptosis 20 and 40 hours after treating A549-Blue cells with 5.5 µM MG132. White arrows denote large membrane blebs that contain phosphatidylserine in their outer leaflet / Confermare la risposta di impedenza con immagini di cellule dal vivo. I pannelli immagine dimostrano la progressione dell'apoptosi 20 e 40 ore dopo il trattamento delle cellule A549-Blue con 5,5 µM MG132. Le frecce bianche denotano grandi bolle di membrana che contengono fosfatidilserina nel loro foglio esterno

Apoptosis Assays 

The process of apoptosis encompasses a number of morphological, structural, and molecular events culminating in cell demise. The xCELLigence RTCA eSight provides multiple temporal vantage points from which apoptosis can be evaluated.

Impedance

The impedance biosensors in the bottom of the eSight microplate (E-Plate View), provide a non-invasive and sensitive readout. This readout enables the assessment of early and late apoptotic events such as modulation of cell adhesion and cell membrane integrity, as well as cell detachment

Nonperturbing fluorescence imaging 

With three distinct fluorescence channels and Agilent reagents such as eCaspase 3, eAnnexin V, and eLive, the xCELLigence RTCA eSight provides a mechanistic assessment of apoptosis. 

Additionally, genetically encoded, pathway-specific fluorescent reporters are also compatible with the xCELLigence RTCA eSight. This feature of the xCELLigence RTCA eSight provides both a qualitative and quantitative assessment of cell morphology, size, and confluence under various treatment and apoptosis assay conditions. 

Brightfield imaging 

This feature of the xCELLigence RTCA eSight provides both a qualitative and quantitative assessment of cell morphology, size, and confluence under various treatment and apoptosis assay conditions.

Immune-cell-killing Assays 

Adoptive T cell therapies such as Chimeric Antigen Receptor (CAR) T cells are being used for previously intractable cancers such as relapsed and refractory Acute Lymphocytic Leukemia (ALL). The xCELLigence RTCA eSight provides a valuable real-time assay to evaluate the interaction of CAR-T cells with tumor cells in vitro, providing additional information about tumor escape as well as immune cell exhaustion.

Impedance

The impedance biosensors provide a label-free assessment of tumor cell viability upon co-culture with effector cells such as CAR-T. This label-free assessment of CAR-T killing can be performed at low Effector: Target (E:T) ratios to assess serial killing of the cells and also evaluate possible tumor cell escape.

Nonperturbing fluorescence imaging

With three distinct fluorescence channels and Agilent reagents such as eCaspase 3, eAnnexin V, and eLive, the xCELLigence RTCA eSight provides a direct way to assess the extent of tumor cell killing via apoptosis in addition to examining other markers of T cell activation/exhaustion such as CD69 and CD107.

Brightfield imaging

This feature of the xCELLigence RTCA eSight provides both a qualitative and quantitative assessment of cell morphology, confluence, and aggregation under various treatment and immune-cell killing assay conditions

Virus-mediated Cytopathogenecity Assays 

As the public health threat from viruses continues to persist, developing novel methods to screen anti-virals will be important in the development of broad-spectrum anti-viral drugs and vaccines. The xCELLigence RTCA eSight instrument enables quantitative real-time assessment of viral infectivity and cytopathic effect (CPE) both at the phenotypic and mechanistic levels.

Impedance

The impedance biosensors provide a quantitative, label-free and real-time assessment of virus-mediated cytopathogenicity at different multiplicities of infection (MOI), as well as the kinetics of viral entry.

Nonperturbing fluorescence imaging

With three distinct fluorescence channels and various live-cell imaging reagents, the xCELLigence RTCA eSight can reveal cellular details such as barrier function disruption, activation of host cell anti-viral pathways, apoptotic death, and syncytium formation.

Brightfield imaging

This feature of the xCELLigence RTCA eSight provides both a qualitative and quantitative assessment of cell morphology, confluence, and cell aggregation under various treatment and assay conditions. Brightfield imaging can also confirm non-cytopathic effects, such as barrier disruption or the formation of syncytia, the enlarged multi-nucleate cells caused by the fusion of virusinfected cells with neighboring cells.

ITALIANO

Verso una comprensione più profonda della cellula

Sebbene i fondamenti delle tecniche di coltura cellulare non siano cambiati sostanzialmente negli ultimi decenni, gli approcci utilizzati per analizzare le cellule sono avanzati ad un ritmo senza precedenti. Questi nuovi approcci stanno aumentando la nostra comprensione delle vie di segnalazione coinvolte nel governo dei processi cellulari fisiologici e fisiopatologici. Uno dei cambiamenti trasformativi è stato l'utilizzo delle cellule e dell'ingegneria cellulare per la medicina rigenerativa, la terapia genica e l'immunoterapia per il trattamento di malattie di varia origine precedentemente intrattabili. Poiché l'analisi cellulare nella ricerca di base, nella medicina traslazionale e nelle terapie cellulari diventa sempre più sofisticata, è fondamentale che le soluzioni forniscano informazioni multiparametriche e ricche di dati. In Agilent Technologies, riteniamo che l'analisi cellulare sia fondamentale per comprendere i meccanismi della malattia e progettare terapie cellulari di prossima generazione sicure ed efficaci. Una delle aggiunte più recenti all'innovativo portafoglio di analisi cellulari di Agilent è il sistema Agilent xCELLigence RTCA eSight

Più di quanto sembri

Combinazione della potenza dei biosensori di imaging a cellule vive ed analisi cellulare in tempo reale (RTCA).

Lo strumento Agilent xCELLigence RTCA eSight è uno strumento rivoluzionario per l'analisi cellulare, caratterizzato dal monitoraggio non invasivo basato sull'impedenza insieme all'imaging delle cellule vive

Combina i migliori aspetti della tecnologia dei biosensori di impedenza: letture imparziali, sensibili e cinetiche, con le squisite conoscenze cellulari e meccanicistiche fornite dall'imaging delle cellule vive. In definitiva, ciò si traduce in una comprensione più profonda del comportamento e dei processi cellulari.

Semplice, Sensibile e Incisivo

I saggi cinetici multiparametrici non perturbatori, abilitati dal sistema xCELLigence eSight, riducono drasticamente il numero di campioni monitorati, consentendo esperimenti precisi e riproducibili con bassi margini di errore. È importante sottolineare che l'aspetto multiparametrico del sistema consente l'interrogazione di più eventi cellulari all'interno di un singolo esperimento, precludendo la necessità di condurre più esperimenti. La caratteristica non disturbante di xCELLigence RTCA eSight consente la valutazione della biologia in tempo reale, portando importanti informazioni contestuali nell'esperimento e consentendo la misurazione di processi specifici.

Un esperimento: due letture simultanee e prospettive multiple

Il flusso di lavoro di xCELLigence RTCA eSight inizia con la coltivazione delle cellule di interesse in micropiastre specializzate contenenti biosensori di impedenza ed un'area di visualizzazione per l'imaging. L'impedenza cellulare fornisce una sensibilità ed informazioni squisite sulla vitalità cellulare, la crescita, la morfologia e l'interazione giunzionale. Con campo chiaro e tre canali di fluorescenza, le funzioni di imaging delle cellule vive di xCELLigence RTCA eSight sono compatibili con le sonde di fluorescenza come quelle per la vitalità, la tossicità e l'apoptosi. Le proteine ​​reporter fluorescenti possono anche essere utilizzate per fornire dati quantitativi e meccanicistici in tempo reale sulla modulazione delle vie di segnalazione mediante trattamenti specifici. Questa combinazione di informazioni consente un campionamento molto più ampio e la valutazione dei processi cellulari e della biologia dell'indice cellulare normalizzato all'interno di un singolo esperimento.

Cattura ciò che ti manca

Saggi di apoptosi

Il processo di apoptosi comprende una serie di eventi morfologici, strutturali e molecolari che culminano nella morte cellulare. xCELLigence RTCA eSight fornisce più punti di osservazione temporale da cui è possibile valutare l'apoptosi.

Impedenza

I biosensori di impedenza nella parte inferiore della micropiastra eSight (E-Plate View), forniscono una lettura non invasiva e sensibile. Questa lettura consente la valutazione di eventi apoptotici precoci e tardivi come la modulazione dell'adesione cellulare e l'integrità della membrana cellulare, nonché il distacco cellulare

Imaging a fluorescenza non disturbante

Con tre distinti canali di fluorescenza e reagenti Agilent come eCaspase 3, eAnnexin V ed eLive, xCELLigence RTCA eSight fornisce una valutazione meccanicistica dell'apoptosi.

Inoltre, i reporter fluorescenti specifici del percorso codificati geneticamente sono anche compatibili con xCELLigence RTCA eSight. Questa caratteristica di xCELLigence RTCA eSight fornisce una valutazione qualitativa e quantitativa della morfologia, delle dimensioni e della confluenza delle cellule in varie condizioni di trattamento e test di apoptosi.

Imaging in campo chiaro

Questa caratteristica di xCELLigence RTCA eSight fornisce una valutazione qualitativa e quantitativa della morfologia, delle dimensioni e della confluenza delle cellule in varie condizioni di trattamento e test di apoptosi.

Saggi di uccisione delle cellule immunitarie

Terapie adottive con cellule T come le cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR) vengono utilizzate per tumori precedentemente intrattabili come la leucemia linfocitica acuta (ALL) recidivante e refrattaria. xCELLigence RTCA eSight fornisce un prezioso test in tempo reale per valutare l'interazione delle cellule CAR-T con le cellule tumorali in vitro, fornendo informazioni aggiuntive sulla fuga del tumore e sull'esaurimento delle cellule immunitarie.

Impedenza

I biosensori di impedenza forniscono una valutazione senza etichetta della vitalità delle cellule tumorali in co-coltura con cellule effettrici come CAR-T. Questa valutazione senza etichetta dell'uccisione di CAR-T può essere eseguita a bassi rapporti Effector: Target (E:T) per valutare l'uccisione seriale delle cellule e anche valutare la possibile fuga delle cellule tumorali.

Imaging a fluorescenza non disturbante

Con tre distinti canali di fluorescenza e reagenti Agilent come eCaspase 3, eAnnexin V ed eLive, xCELLigence RTCA eSight fornisce un modo diretto per valutare l'entità dell'uccisione delle cellule tumorali tramite l'apoptosi oltre ad esaminare altri marcatori di attivazione/esaurimento delle cellule T come come CD69 e CD107.

Imaging in campo chiaro

Questa caratteristica di xCELLigence RTCA eSight fornisce una valutazione sia qualitativa che quantitativa della morfologia cellulare, confluenza e aggregazione in varie condizioni di trattamento e test di uccisione delle cellule immunitarie

Saggi di citopatogenesi mediata da virus

Poiché la minaccia alla salute pubblica dei virus continua a persistere, lo sviluppo di nuovi metodi per lo screening degli antivirali sarà importante nello sviluppo di farmaci e vaccini antivirali ad ampio spettro. Lo strumento xCELLigence RTCA eSight consente una valutazione quantitativa in tempo reale dell'infettività virale e dell'effetto citopatico (CPE) sia a livello fenotipico che meccanicistico.

Impedenza

I biosensori di impedenza forniscono una valutazione quantitativa, senza etichetta e in tempo reale della citopatogenicità mediata da virus a diverse molteplicità di infezione (MOI), nonché della cinetica dell'ingresso virale.

Imaging a fluorescenza non disturbante

Con tre distinti canali di fluorescenza e vari reagenti di imaging delle cellule vive, xCELLigence RTCA eSight può rivelare dettagli cellulari come l'interruzione della funzione di barriera, l'attivazione di percorsi antivirali delle cellule ospiti, la morte apoptotica e la formazione di sincizio.

Imaging in campo chiaro

Questa caratteristica di xCELLigence RTCA eSight fornisce una valutazione sia qualitativa che quantitativa della morfologia cellulare, della confluenza e dell'aggregazione cellulare in varie condizioni di trattamento e analisi. L'imaging in campo chiaro può anche confermare effetti non citopatici, come l'interruzione della barriera o la formazione di sincizi, le cellule multinucleate ingrandite causate dalla fusione di cellule infettate da virus con cellule vicine.

Da:

https://f.hubspotusercontent40.net/hubfs/547446/Technology%20Networks/Landing%20Pages/Agilent/Agilent%20ACEA/October%202020/eSight-eBook-agilent-5994-2260en-20200731.pdf?__hstc=8807082.074aceb79027e793890018c0152531d2.1643566337753.1656961087039.1657017326025.64&__hssc=8807082.1.1657017326025&__hsfp=1067976316&hsCtaTracking=9b3d4b4b-a7aa-42d1-a966-6c4d08a0cbc1%7Cb0a8c8ba-ac87-47ba-9667-f9ecebbdc97a