Quantitation on Octet® BLI Platforms / Quantificazione su piattaforme Octet® BLI

Quantitation on Octet® BLI Platforms / Quantificazione su piattaforme Octet® BLI

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Figure. Octet® quantitation assay formats and features / Formati e caratteristiche del test di quantificazione Octet®

Octet® platforms offer an excellent solution to replace assays that are currently performed as ELISA. Similar to ELISA, Octet® assays are carried out on an immobilized surface (solid support in ELISA), and the analyte is bound from solution. However, Octet® assays are fully automated, require much less user intervention, and provide a simplified workflow. In addition, they provide researchers with the flexibility to choose the most efficient assay format based on assay needs such as sensitivity, dynamic range, and workflow. 

Advantages of Octet® quantitation assays over ELISA: 

- Multiple assay formats – depending on the required sensitivity of the assay, several assay formats can be adapted: a single step, sandwich or the 3-step assay which provides the highest sensitivity. 

- Quantitation assays are easily developed for a variety of analytes such as IgG, recombinant proteins, vaccines and viruses, and more. 

- Detection of low affinity analytes that can often be washed away during ELISA procedures due to their faster off rates.

- Real-time data generation to assess experimental progression. 

- Faster time to results which is advantageous in detecting less stable analytes. 

- Samples and reagents can be fully recovered and reused.

- Lower assay costs as biosensors can be regenerated.

Selecting an assay format 

The choice of an assay format is dependent on the concentration range of analyte to be quantified. Direct binding quantitation assays (1-step) typically can measure concentrations from low mg/mL up to low ng/mL depending on the analyte. Larger analytes provide higher sensitivity compared to lower molecular weight analytes. 1-step assays are simpler, faster and eliminate the need for secondary reagents and steps needed for detection.

In addition, they enable researchers to reuse biosensors after regeneration in most cases. Multi-step assays (2- and 3-step) are used when enhanced sensitivities are required up to low pg/mL concentrations. Since Octet® detection relies on the optical thickness generated at the biolayer, increasing the binding layer by 2 or 3 step analytes increases the binding signal and sensitivity. The 2-step format typically includes the capture of the analyte by the biosensor followed by sandwiching the analyte by a second antibody. For higher signal amplification, an enzyme-linked sandwich assay (3-step assays) captures analyte bound by two separately-labeled capture molecules to the biosensor in the first step, binds an HRP-conjugated antibody to the complex in the second step, and precipitates a substrate directly onto the biosensor surface further increasing the mass added in the third step.

ITALIANO

Le piattaforme Octet® offrono un'eccellente soluzione per sostituire i test attualmente eseguiti come ELISA. Analogamente all'ELISA, i saggi Octet® vengono eseguiti su una superficie immobilizzata (supporto solido in ELISA) e l'analita viene legato dalla soluzione. Tuttavia, i test Octet® sono completamente automatizzati, richiedono molto meno intervento da parte dell'utente e forniscono un flusso di lavoro semplificato. Inoltre, offrono ai ricercatori la flessibilità di scegliere il formato di analisi più efficiente in base alle esigenze di analisi quali sensibilità, gamma dinamica e flusso di lavoro.

Vantaggi dei saggi di quantificazione Octet® rispetto a ELISA:

- Formati di dosaggio multipli: a seconda della sensibilità richiesta del dosaggio, è possibile adattare diversi formati di dosaggio: un dosaggio a fase singola, sandwich o il dosaggio a 3 fasi che fornisce la massima sensibilità.

- I saggi di quantificazione sono facilmente sviluppati per una varietà di analiti come IgG, proteine ​​ricombinanti, vaccini e virus e altro ancora.

- Rilevazione di analiti a bassa affinità che spesso possono essere lavati via durante le procedure ELISA a causa delle loro velocità di eliminazione più veloci.

- Generazione di dati in tempo reale per valutare la progressione sperimentale.

- Tempi più rapidi per ottenere risultati che sono vantaggiosi nel rilevamento di analiti meno stabili.

- Campioni e reagenti possono essere completamente recuperati e riutilizzati.

- Costi di analisi inferiori poiché i biosensori possono essere rigenerati.

Selezione di un formato di analisi

La scelta del formato del test dipende dall'intervallo di concentrazione dell'analita da quantificare. I saggi di quantificazione a legame diretto (1 fase) in genere possono misurare concentrazioni da bassi mg/mL fino a bassi ng/mL a seconda dell'analita. Gli analiti più grandi forniscono una sensibilità maggiore rispetto agli analiti a peso molecolare inferiore. I test in 1 fase sono più semplici, veloci ed eliminano la necessità di reagenti secondari e passaggi necessari per il rilevamento.

Inoltre, consentono ai ricercatori di riutilizzare i biosensori dopo la rigenerazione nella maggior parte dei casi. I saggi multifase (2 e 3 fasi) vengono utilizzati quando sono richieste sensibilità potenziate fino a basse concentrazioni di pg/mL. Poiché il rilevamento di Octet® si basa sullo spessore ottico generato nel biostrato, l'aumento dello strato legante di 2 o 3 passaggi di analiti aumenta il segnale di legame e la sensibilità. Il formato a 2 fasi include tipicamente la cattura dell'analita da parte del biosensore seguita dall'inserimento dell'analita da parte di un secondo anticorpo. Per una maggiore amplificazione del segnale, un test sandwich legato a un enzima (saggi in 3 fasi) cattura l'analita legato al biosensore da due molecole di cattura etichettate separatamente, nella seconda fase lega un anticorpo coniugato con HRP al complesso e nella seconda fase precipita un substrato direttamente sulla superficie del biosensore aumentando ulteriormente la massa aggiunta nel terzo passaggio.

Da:

https://offers.the-scientist.com/hubfs/TS_PPL_Sartorius_QC%20Octet_white%20paper/Octet-Label-Free-Detection-eBook-4007-en-L-Sartorius%20(1).pdf