Preparing for single cell gene expression experiments / Preparazione per esperimenti di espressione genica a cellula singola

Preparing for single cell gene expression experiments / Preparazione per esperimenti di espressione genica a cellula singola

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Prior to starting your single cell experiments, we recommend you walk through a five-step process that will help guide your experimental design and determine how to best answer your research questions. / Prima di iniziare i tuoi esperimenti su una singola cellula, ti consigliamo di seguire un processo in cinque fasi che ti aiuterà a guidare il tuo progetto sperimentale ed a determinare come rispondere al meglio alle tue domande di ricerca. 

Go beyond traditional gene expression analysis to more deeply characterize cell populations, including individual cell types and states in heterogeneous tissues.

Differences in gene expression across organisms, tissues, and disease states have historically been quantified using approaches such as in situ hybridization (ISH), microarrays, or total RNA sequencing (RNA-seq). However, these methods can be low throughput, in the case of ISH, or provide only an average readout across cell populations. Single cell transcriptomic technologies, including Chromium

 Single Cell Gene Expression, allow the direct measurement of gene expression at the single cell level to quantify cell population heterogeneity and characterize cell types, cell states, and dynamic cellular transitions cell by cell. This guide will help you get started with your single cell gene expression experiments and should serve as a roadmap to help you design your experiments, optimize experimental parameters, and identify appropriate computational/analytical tools to analyze your single cell gene expression data.

01 What scientific questions do I want to answer?

Single cell gene expression analysis can provide answers to many different types of research questions, including but not limited to:

How heterogeneous is my cell population?

What novel cell types and states reside in my tissue?

Are there low abundance transcripts driving cell states or differentiation? 

How do cells respond to therapy or contribute to stratification of disease state?

02 What are the best practices for preparing and processing my sample?

Sample type & preparation 

It is critical that you obtain a clean single cell suspension free of cell debris, with minimal cell aggregates and high viability (>70%). It is also important to know the size range of the cells studied. The cell size is usually correlated with the number of transcripts expressed in the cell. A wide range of cell sizes (up to 30 μm) are compatible with Chromium Single Cell Next GEM Chips. In general, cell preparation protocols will vary depending on the tissue’s origin and the cell types being studied. Each tissue type is unique, and thus, it is critical to optimize sample preparation before starting any single cell experiment. 

Sample procurement and storage 

If samples can be processed immediately, using fresh tissue and cell isolation is preferred. If there must be a delay between collection and processing, freezing may be appropriate. In either case, fast processing or preservation is critical to maintain sample biology. If the sample needs to be shipped to another site, the best method is to cryopreserve the cells and ship on dry ice.

Cell enrichment 

When characterizing rare cell populations or samples with low viability, enriching for live cells of interest prior to generating single cell partitions can help ensure adequate numbers of your cells of interest. The Chromium system is compatible with FACS and bead- or column-based enrichment methods. 

Cells versus nuclei 

Whether to use cells or nuclei as input depends on a few factors, including sample type and sample handling logistics. If fresh tissue can be obtained, cell isolation is preferred. For frozen tissue or archival samples, nuclei must be isolated directly following the guidance in our Demonstrated Protocol. Alternatively, tissue can be dissociated and cryopreserved immediately after it is received, using this Demonstrated Protocol, enabling cells to be stored long term

Sample preparation best practices

 • Optimize sample preparation first 

• Maintain single cell viability of greater than 70%

 • Ensure cell or nuclei suspensions are clean and free of debris

 • Count cells after all cleanup, sorting, and enrichment steps are done 

03 How many cells and replicates do my experiments require?

Number of cells

Deciding on the number of cells required depends on the expected cellular heterogeneity in the sample, the number of cells available, the minimum frequency expected of desired subpopulations, and the minimum number of cells of each cell type desired for data analysis. If the sample diversity is not known, a high number of cells at low sequencing depth may be the most flexible option to obtain a representative proportion of the cell population and meaningful biological information. Often, greater cell number, rather than sequencing depth, improves cell classification ability (Ding et al. 2020). For highly heterogeneous samples, thousands of cells may be required to resolve each subpopulation fully.

Number of replicates 

Determining the number of replicates depends on the research project, the type of sample, and the number of cells required in the study. The matter of biological replicates is still an open question in the field. In some studies, one sample alone may be sufficient—with each cell representing a biological replicate and different samples from different individuals accounting for the variability of a particular biological process. In other studies, to mitigate biological variability in small cell populations across time, it can be beneficial to computationally aggregate cells from different samples to cover all aspects of the cell population being studied. Other cases may require that multiple replicates be derived from a single sample to increase the study’s total number of cells.

Batch effects

Batch effects can be introduced at any stage of the workflow and are primarily due to logistical constraints that result from different preparation times, operators, and handling protocols. The 10x Genomics Chromium system demonstrates minimal technical variability across a variety of technical replicates. A number of computational tools, including Seurat, scran, and scrone, can correct batch effects. Cell Ranger can also perform batch correction for libraries generated with multiple versions of our Single Cell 3’ Gene Expression chemistry, as described 

04 What depth of sequencing do I need? 

The sequencing depth per experiment for gene expression libraries is dependent on total mRNA content in individual cells, and the diversity of mRNA species. In general, at the same transcript diversity, cells expressing a low amount of mRNA will require less sequencing depth than cells expressing a large amount of mRNA. When sequencing cost or capacity is limiting, there is often a trade-off between breadth versus depth, i.e. sequencing a higher number of cells at low depth versus sequencing a lower number of cells with more reads. 10x Genomics single cell libraries are compatible with short-read sequencers and are available in a dual indexing configuration. Our single cell gene expression workflows use unique molecular identifiers (UMIs) to barcode each transcript molecule before amplification takes place, resulting in a digital gene expression profile that accounts for PCR amplification bias. 

05 How do I analyze and visualize my data? 

Process and analyze sequencing data Single Cell Gene Expression from 10x Genomics comes with free, easy-to-use software for data analysis and visualization. Cell Ranger is our suite of analysis pipelines that will align reads, filter, count barcodes and UMIs, generate Feature Barcode matrices, and perform clustering and gene expression analysis to turn your raw sequencing data into results. Cell Ranger can aggregate outputs from multiple experiments, normalize to the same sequencing depth, and re-analyze the combined data. Cell Ranger will also provide actionable quality control metrics for your data, letting you know how clean your sample was and how robust your results are. The primary output of Cell Ranger is a count matrix, consisting of columns for every cell barcode and rows for all measured features, such as genes for transcriptome analysis. For each feature, the number of unique molecules detected is provided as a digital readout. Data processed by Cell Ranger can then be exported to third-party analysis tools or visualized directly in Loupe Browser, our visualization software. Cell Ranger can be downloaded and run as a command-line tool in a Linux environment or in the 10x Genomics Cloud using an intuitive point-and-click interface. 

Interactively explore single cell results

 Loupe Browser is a desktop application designed for quick, interactive single cell data visualization. Built to accelerate data exploration, Loupe Browser allows you to determine cell types, discover rare cell populations, explore biological substructure, and identify new marker genes. A number of community-developed analysis tools can be used to extend your data analysis. Data can be exported from Cell Ranger and imported into commonly used tools such as  Seurat, Scanpy, Monocle, or Bioconductor.

ITALIANO

Vai oltre l'analisi dell'espressione genica tradizionale per caratterizzare in modo più approfondito le popolazioni cellulari, inclusi i singoli tipi di cellule e gli stati in tessuti eterogenei.

Le differenze nell'espressione genica tra organismi, tessuti e stati patologici sono state storicamente quantificate utilizzando approcci come l'ibridazione in situ (ISH), i microarray o il sequenziamento dell'RNA totale (RNA-seq). Tuttavia, questi metodi possono essere a bassa produttività, nel caso di ISH, o fornire solo una lettura media tra le popolazioni cellulari. Tecnologie trascrittomiche unicellulari, incluso Chromium.

 Single Cell Gene Expression, consentono la misurazione diretta dell'espressione genica a livello di singola cellula per quantificare l'eterogeneità della popolazione cellulare e caratterizzare i tipi cellulari, gli stati cellulari e le transizioni cellulari dinamiche cellula per cellula. Questa guida ti aiuterà ad iniziare con i tuoi esperimenti di espressione genica unicellulare e dovrebbe fungere da tabella di marcia per aiutarti a progettare i tuoi esperimenti, ottimizzare i parametri sperimentali e identificare strumenti computazionali / analitici appropriati per analizzare i dati di espressione genica di un singolo cellula.

01 A quali domande scientifiche voglio rispondere?

L'analisi dell'espressione genica di una singola cellula può fornire risposte a molti diversi tipi di domande di ricerca, inclusi ma non limitati a:

Quanto è eterogenea la mia popolazione cellulare?

Quali nuovi tipi e stati cellulari risiedono nel mio tessuto?

Ci sono trascrizioni di bassa abbondanza che guidano gli stati cellulari o la differenziazione?

In che modo le cellule rispondono alla terapia o contribuiscono alla stratificazione dello stato patologico?

02 Quali sono le migliori pratiche per la preparazione e l'elaborazione del mio campione?

Tipo e preparazione del campione

È fondamentale ottenere una sospensione unicellulare pulita, priva di detriti cellulari, con aggregati cellulari minimi ed elevata vitalità (>70%). È anche importante conoscere l'intervallo di dimensioni delle cellule studiate. La dimensione della cella è solitamente correlata al numero di trascrizioni espresse nella cella. Un'ampia gamma di dimensioni delle cellule (fino a 30 μm) è compatibile con i chip Chromium Single Cell Next GEM. In generale, i protocolli di preparazione cellulare variano a seconda dell'origine del tessuto e dei tipi cellulari studiati. Ogni tipo di tessuto è unico e, quindi, è fondamentale ottimizzare la preparazione del campione prima di iniziare qualsiasi esperimento su una singola cellula. Ti consigliamo di iniziare esaminando la nostra Guida alla preparazione cellulare. Trova altre risposte alle domande più comuni sulla preparazione dei campioni nella nostra pagina Domande frequenti sulla preparazione dei campioni. 

Acquisto e conservazione dei campioni

Se i campioni possono essere elaborati immediatamente, è preferibile utilizzare tessuto fresco ed isolamento cellulare. Se deve esserci un ritardo tra la raccolta e la lavorazione, il congelamento può essere appropriato. In entrambi i casi, una rapida elaborazione o conservazione è fondamentale per mantenere la biologia del campione. Se il campione deve essere spedito ad un altro sito, il metodo migliore è crioconservare le cellule e spedire su ghiaccio secco.

Arricchimento cellulare

Quando si caratterizzano popolazioni cellulari rare o campioni con bassa vitalità, l'arricchimento per le cellule vive di interesse prima di generare partizioni di singole cellule può aiutare a garantire un numero adeguato di cellule di interesse. Il sistema Chromium è compatibile con FACS e metodi di arricchimento basati su perline o colonne. 

Cellule contro nuclei

L'utilizzo di cellule o nuclei come input dipende da alcuni fattori, tra cui il tipo di campione e la logistica di gestione del campione. Se è possibile ottenere tessuto fresco, è preferibile l'isolamento cellulare. Per i campioni di tessuto o archivio congelati, i nuclei devono essere isolati direttamente seguendo le indicazioni nel nostro protocollo dimostrato. In alternativa, il tessuto può essere dissociato e crioconservato immediatamente dopo essere stato ricevuto, utilizzando questo protocollo dimostrato, consentendo alle cellule di essere conservate a lungo termine

Esempi di best practice per la preparazione

 • Ottimizzare prima la preparazione del campione

• Mantenere la vitalità delle singole cellule superiore al 70%

 • Assicurarsi che le sospensioni di cellule o nuclei siano pulite e prive di detriti

 • Contare le celle al termine di tutte le fasi di pulizia, ordinamento e arricchimento

03 Quante cellule e repliche richiedono i miei esperimenti?

Numero di celle

La decisione sul numero di cellule richieste dipende dall'eterogeneità cellulare prevista nel campione, dal numero di cellule disponibili, dalla frequenza minima prevista per le sottopopolazioni desiderate e dal numero minimo di cellule di ciascun tipo di cellula desiderato per l'analisi dei dati. Se la diversità del campione non è nota, un numero elevato di cellule a bassa profondità di sequenziamento può essere l'opzione più flessibile per ottenere una proporzione rappresentativa della popolazione cellulare ed informazioni biologiche significative. Spesso, un numero maggiore di cellule, piuttosto che una profondità di sequenziamento, migliora la capacità di classificazione delle cellule (Ding et al. 2020). Per campioni altamente eterogenei, potrebbero essere necessarie migliaia di cellule per risolvere completamente ciascuna sottopopolazione.

Numero di repliche

La determinazione del numero di repliche dipende dal progetto di ricerca, dal tipo di campione e dal numero di cellule richieste nello studio. La questione delle repliche biologiche è ancora una questione aperta nel campo. In alcuni studi, un solo campione può essere sufficiente, con ciascuna cellula che rappresenta una replica biologica e diversi campioni di individui diversi che spiegano la variabilità di un particolare processo biologico. In altri studi, per mitigare la variabilità biologica nelle popolazioni di piccole cellule nel tempo, può essere utile aggregare computazionalmente cellule da campioni diversi per coprire tutti gli aspetti della popolazione cellulare studiata. Altri casi possono richiedere che più repliche siano derivate da un singolo campione per aumentare il numero totale di cellule dello studio.

Effetti batch

Gli effetti batch possono essere introdotti in qualsiasi fase del flusso di lavoro e sono principalmente dovuti a vincoli logistici derivanti da tempi di preparazione, operatori e protocolli di manipolazione diversi. Il sistema 10x Genomics Chromium dimostra una variabilità tecnica minima su una varietà di repliche tecniche. Numerosi strumenti di calcolo, inclusi Seurat, scran e scrone, possono correggere gli effetti batch. Cell Ranger può anche eseguire la correzione batch per le librerie generate con più versioni della nostra chimica di espressione genica Single Cell 3', come descritto

04 Di quale profondità di sequenziamento ho bisogno?

La profondità di sequenziamento per esperimento per le librerie di espressione genica dipende dal contenuto totale di mRNA nelle singole cellule e dalla diversità delle specie di mRNA. In generale, alla stessa diversità di trascrizione, le cellule che esprimono una bassa quantità di mRNA richiederanno una profondità di sequenziamento inferiore rispetto alle cellule che esprimono una grande quantità di mRNA. Quando il costo o la capacità del sequenziamento sono limitanti, spesso c'è un compromesso tra ampiezza e profondità, ad es. sequenziare un numero maggiore di cellule a bassa profondità rispetto al sequenziamento di un numero inferiore di cellule con più letture. Le librerie a cella singola 10x Genomics sono compatibili con i sequenziatori a lettura breve e sono disponibili in una configurazione a doppia indicizzazione. I nostri flussi di lavoro di espressione genica a cellula singola utilizzano identificatori molecolari univoci (UMI) per codificare a barre ogni molecola di trascrizione prima che avvenga l'amplificazione, risultando in un profilo di espressione genica digitale che tiene conto del bias di amplificazione della PCR.

05 Come analizzo e visualizzo i miei dati?

Elabora e analizza i dati di sequenziamento Single Cell Gene Expression di 10x Genomics viene fornito con un software gratuito e facile da usare per l'analisi e la visualizzazione dei dati. Cell Ranger è la nostra suite di pipeline di analisi che allineerà le letture, filtrerà, conterà codici a barre e UMI, genererà matrici di codici a barre di funzionalità ed eseguirà analisi di clustering e di espressione genica per trasformare i dati di sequenziamento grezzi in risultati. Cell Ranger può aggregare gli output di più esperimenti, normalizzare alla stessa profondità di sequenziamento e rianalizzare i dati combinati. Cell Ranger fornirà anche metriche di controllo della qualità utilizzabili per i tuoi dati, facendoti sapere quanto era pulito il tuo campione e quanto sono robusti i tuoi risultati. L'output principale di Cell Ranger è una matrice di conteggio, costituita da colonne per ogni codice a barre cellulare e righe per tutte le caratteristiche misurate, come i geni per l'analisi del trascrittoma. Per ogni caratteristica, il numero di molecole uniche rilevate viene fornito come lettura digitale. I dati elaborati da Cell Ranger possono quindi essere esportati in strumenti di analisi di terze parti o visualizzati direttamente in Loupe Browser, il nostro software di visualizzazione. Cell Ranger può essere scaricato ed eseguito come strumento da riga di comando in un ambiente Linux o nel 10x Genomics Cloud utilizzando un'interfaccia intuitiva punta e clicca.

Esplora in modo interattivo i risultati delle singole cellule

 Loupe Browser è un'applicazione desktop progettata per la visualizzazione rapida e interattiva dei dati a cella singola. Creato per accelerare l'esplorazione dei dati, Loupe Browser consente di determinare i tipi cellulari, scoprire popolazioni cellulari rare, esplorare la sottostruttura biologica e identificare nuovi geni marcatori . Per estendere l'analisi dei dati è possibile utilizzare una serie di strumenti di analisi sviluppati dalla comunità. I dati possono essere esportati da Cell Ranger ed importati in strumenti di uso comune come Seurat, Scanpy, Monocle o Bioconductor.

Da:

https://offers.the-scientist.com/hubfs/TS_PPL_10x%20Genomics_Single%20Cell%20Gene%20Expression_Guide/10x_BR027_Getting_Started_Guide_digital%20(1).pdf?hsCtaTracking=7ad65104-9546-40bd-b3ff-54f24a44d1f4%7C7afd87a9-1aae-44bb-8ecf-295c59a2327f