qPCR STANDARDIZING AUTOMATION / AUTOMAZIONE DELLA STANDARDIZZAZIONE DELLA qPCR
qPCR STANDARDIZING AUTOMATION / AUTOMAZIONE DELLA STANDARDIZZAZIONE DELLA qPCR
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
How qPCR is Automated
Automating qPCR workflows largely involves automating liquid and plate handling procedures. This greatly reduces volume and concentration variability from well to well and plate to plate. Automated liquid handling is also much faster than manual pipetting. Furthermore, programmable plate handler-thermocycler systems can handle plate loading, run initiation, and plate removal automatically, effectively allowing 24/7 workflow runtime. Automation facilitates greatly increased qPCR throughput, which in turn allows for much higher volumes of data to be generated. This data needs to be processed and analyzed in a manner that minimizes user-introduced variation. Here, software packages designed for qPCR data analysis rapidly process, analyze, cluster/collate, and visualize generated results, ensuring that data analysis does not become a bottleneck. Modern software is also aligned with the data distribution needs of the modern laboratory, whether it is transferring data from reader instruments for analysis, or transferring analyzed information to laboratory information management systems (LIMS) for organization, storage, and future recall. The ability to integrate with LIMS is also critical for the rapid dissemination of qPCR data to necessary parties and agencies, and is pivotal to the viability of qPCR-based diagnostics for public health applications. The creation of best practices and standardization guidelines such as MIQE and RDML, paradoxically, creates another potential source of variation, as not all scientists may adhere to these standardization guidelines to the same degree. This creates a need to “standardize standardization.” Automation is useful in this area, as many of the instruments and software programs that drive automation are developed with MIQE and RDML-compliance in mind. By building in best practices, automation is further driving qPCR standardization.
Pushing Boundaries
The precision and throughput offered
by automation-powered qPCR standardization is important for many scientific fields,
but it has perhaps had the greatest impact
on the scientific response to the COVID19 pandemic. COVID-19 has reaffirmed
how important qPCR is to the scientific and
medical communities, with qPCR diagnostic testing the gold standard for detecting
SARS-CoV-2 infection. At the same time, it
has reinforced the need for qPCR to be fast,
accurate, reproducible, and scalable.
In a showcase of what qPCR can accomplish in tandem with automation-guided
workflows and data handling, Stephen
Bustin and his colleagues created CoV2-ID, a qPCR assay for detecting SARS-CoV-2
that was designed, developed, optimized,
and validated based on MIQE guidelines.
CoV2-ID is a multiplex assay that probes
three viral genes and two controls simultaneously per run, increasing sensitivity by
roughly three-fold by using the same fluorophore to detect all three targets. CoV2-ID
can be performed in as little as 16 minutes on
instruments capable of executing 1-second
thermocycling step durations. As such, this
assay represents not only a breakthrough for
SARS-CoV-2 testing, but a demonstration of
how qPCR might be incorporated into pointof-care therapeutics. In addition to improving SARS-CoV-2
testing, other researchers are pushing the
sensitivity and throughput limits of qPCR
for applications, such as identifying and validating novel biomarkers and drug discovery and development. Standardization,
promoted through best practice guidelines
like MIQE and put into practice by a combination of researcher efforts and technology,
allows scientists to make the most of qPCR’s
current capabilities and push the technology
further into the future.
ITALIANO
L'obiettivo principale della standardizzazione qPCR, sia per i protocolli sperimentali che per la raccolta, l'analisi, l'archiviazione e la diffusione dei dati, è migliorare la riproducibilità. Anche con le linee guida sulle migliori pratiche in atto, rimangono molti punti all'interno di un tipico flusso di lavoro qPCR in cui i ricercatori possono introdurre variabilità nonostante i loro migliori sforzi e preparativi. Ad esempio, le discrepanze nei parametri di campionamento e sottocampionamento, le variazioni di pipettaggio meccaniche e tecniche e gli spostamenti ambientali tra le analisi influiscono sulla riproducibilità della qPCR. L'implementazione dell'automazione in tandem con l'adozione delle migliori pratiche può migliorare ulteriormente l'accuratezza, la coerenza e la riproducibilità dei dati qPCR riducendo al minimo la variabilità.
Come viene automatizzata la qPCR
L'automazione dei flussi di lavoro qPCR implica in gran parte l'automazione delle procedure di manipolazione di liquidi e lastre. Ciò riduce notevolmente la variabilità del volume e della concentrazione da pozzo a pozzo e da piastra a piastra. Anche la gestione automatizzata dei liquidi è molto più veloce del pipettaggio manuale. Inoltre, i sistemi programmabili di gestione delle lastre e termociclatori possono gestire automaticamente il caricamento delle lastre, l'inizio della corsa e la rimozione delle lastre, consentendo in modo efficace un flusso di lavoro 24 ore su 24, 7 giorni su 7. L'automazione facilita notevolmente il throughput qPCR, che a sua volta consente di generare volumi di dati molto più elevati. Questi dati devono essere elaborati e analizzati in modo da ridurre al minimo le variazioni introdotte dall'utente. Qui, i pacchetti software progettati per l'analisi dei dati qPCR elaborano, analizzano, raggruppano/raccolgono e visualizzano i risultati generati, assicurando che l'analisi dei dati non diventi un collo di bottiglia. Il software moderno è anche allineato con le esigenze di distribuzione dei dati del moderno laboratorio, sia che si tratti di trasferire dati da strumenti di lettura per l'analisi, sia di trasferire informazioni analizzate a sistemi di gestione delle informazioni di laboratorio (LIMS) per l'organizzazione, l'archiviazione e il richiamo futuro. La capacità di integrarsi con LIMS è fondamentale anche per la rapida diffusione dei dati qPCR alle parti e alle agenzie necessarie ed è fondamentale per la fattibilità della diagnostica basata su qPCR per le applicazioni di salute pubblica. La creazione di migliori pratiche e linee guida di standardizzazione come MIQE e RDML, paradossalmente, crea un'altra potenziale fonte di variazione, poiché non tutti gli scienziati potrebbero aderire a queste linee guida di standardizzazione nella stessa misura. Ciò crea la necessità di "standardizzare la standardizzazione". L'automazione è utile in quest'area, poiché molti degli strumenti e dei programmi software che guidano l'automazione sono sviluppati tenendo conto della conformità a MIQE e RDML. Basandosi sulle migliori pratiche, l'automazione sta guidando ulteriormente la standardizzazione della qPCR.
Superare i confini
La precisione e il throughput offerti dalla standardizzazione qPCR basata sull'automazione sono importanti per molti campi scientifici, ma forse hanno avuto il maggiore impatto sulla risposta scientifica alla pandemia di COVID19. COVID-19 ha riaffermato quanto sia importante la qPCR per le comunità scientifiche e mediche, con la diagnostica qPCR che testa il gold standard per rilevare l'infezione da SARS-CoV-2. Allo stesso tempo, ha rafforzato la necessità che la qPCR sia veloce, accurata, riproducibile e scalabile. In una vetrina di ciò che qPCR può realizzare in tandem con flussi di lavoro guidati dall'automazione e gestione dei dati, Stephen Bustin ed i suoi colleghi hanno creato CoV2-ID,4 un test qPCR per rilevare SARS-CoV-2 che è stato progettato, sviluppato, ottimizzato e convalidato sulla base delle linee guida MIQE. CoV2-ID è un test multiplex che sonda tre geni virali e due controlli contemporaneamente per corsa, aumentando la sensibilità di circa tre volte utilizzando lo stesso fluoroforo per rilevare tutti e tre i bersagli. CoV2-ID può essere eseguito in appena 16 minuti su strumenti in grado di eseguire fasi di termociclaggio della durata di 1 secondo. In quanto tale, questo test rappresenta non solo una svolta per i test SARS-CoV-2, ma una dimostrazione di come la qPCR potrebbe essere incorporata nelle terapie point-of-care. Oltre a migliorare i test SARS-CoV-2, altri ricercatori stanno spingendo il limiti di sensibilità e throughput della qPCR per applicazioni, come l'identificazione e la convalida di nuovi biomarcatori e la scoperta e lo sviluppo di farmaci. La standardizzazione, promossa attraverso linee guida sulle migliori pratiche come MIQE e messa in pratica da una combinazione di sforzi e tecnologia dei ricercatori, consente agli scienziati di sfruttare al meglio le capacità attuali di qPCR e spingere la tecnologia ulteriormente nel futuro.
Da:
https://offers.the-scientist.com/hubfs/TS_PPL_Bio-Rad_Lab%20Automation_Custom%20eBook_402465/40738_TS_Bio-Rad_Ebook-qPCR-Automation_JR_V14-FINALv2.pdf?hsCtaTracking=36069b2e-c3b7-41dc-9d51-e9e4bba7810a%7Ca59dc43a-518f-4dcd-9560-29a4607e1be7
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