Optimizing Your Experiments of Flow Cytometry / Ottimizzazione dei tuoi esperimenti di citometria a flusso
Optimizing Your Experiments of Flow Cytometry / Ottimizzazione dei tuoi esperimenti di citometria a flusso
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
One of the fundamentals of flow cytometry is the ability to measure single particles as they pass through a laser beam. However, the cytometer can measure only what is put in, and a poor sample will generally lead to poor data. It is essential to start with the best possible sample and treat your samples as gently as possible so that you have a viable cell suspension and obtain good data.
Sample Preparation
There are many considerations for sample preparation to achieve optimum results. The first one is the sample itself. For example, frozen cells will need to be treated differently than an adherent cell line. Following some basic rules, like the ones highlighted below, will help you optimize your experiments.
1. Defrost cells as quickly as possible and remove the dimethyl sulfoxide (DMSO) by resuspending the cells in a large volume of cold media or phosphate buffered saline (PBS) containing BSA or fetal calf serum (FCS) prior to centrifugation. Cells may need to go into culture after defrosting to restore epitope expression.
2. When preparing cells for flow cytometry, you may need gentler treatments that those required for passaging. Trypsin is a harsh treatment that can often destroy cells, creating lots of cell debris, as well as destroying the epitopes that you want to detect using flow cytometry.
3. Be gentle when using mechanical disaggregation of tissues such as spleen or lymph nodes. Filtering the sample can help remove any unwanted clumps of cells.
4. The extraction of some cells from secondary lymphoid tissue (for example, F4/80-positive macrophages and follicular dendritic cells [DCs]) requires additional enzymes like collagenase or liberase. However, these enzymes may inadvertently remove epitopes if applied for too long, so optimization may be required.
5. Remove any unwanted contaminating material. For example, when flushing bone marrow from bones, remove as much muscle as possible. Again, filtering can remove any unwanted bone and muscle.
6. Use the appropriate anticoagulant for peripheral blood. EDTA should not be used when detecting intracellular cytokines or some surface markers that require Ca2+ ions such as integrins.
7. Removal of contaminating red blood cells from peripheral blood samples can be performed by hypotonic lysis using Erythrolyse Red Blood Cell Lysing Buffer (#BUF04B) or a comparable lysis buffer. Care needs to be taken not to leave the samples in the buffer for too long. Alternatively, a density gradient can be used. After centrifugation, leukocytes are trapped at the interface of the higher density liquid, whereas red cells pass through. Unfortunately, granulocytes also pass through the interface, so density gradients are not recommended for this cell type.
8. Avoid vortexing and excessive centrifugation, or leaving the cells as a dry pellet. Creating too many bubbles while resuspending cells or resuspending cells at high concentrations can increase cell death. Keeping your cells on ice can improve the viability, as this slows down necrosis and cell metabolism.
9. Make sure you are using the right tubes. Many cell types (for instance, monocytes) show stronger adherence to polystyrene but adhere less to polypropylene. If cell numbers are low, avoid polystyrene tubes to reduce the loss of these cell types.
10. All sample preparation should be as short as possible, as the time taken to prepare your cells can have a significant effect on the cell viability
Autofluorescence
Cells have a natural level of fluorescence, called autofluorescence, which can be a problem in flow cytometry data analysis. Cellular autofluorescence can be due to the presence of collagen and elastin, cyclic ring compounds such as NADPH and riboflavin, aromatic amino acids, and cellular organelles like mitochondria and lysosomes. The autofluorescence in cells can vary due to variances in the levels of these cellular compounds and organelles that give rise to the fluorescence. In general, larger and more granular cells have increased autofluorescence due to an increase in the number of fluorescent compounds. Most autofluorescence is detected at shorter light wavelengths with most absorbing at 350–500 nm and emitting at 350–550 nm. It can therefore be a problem in these wavelength ranges, as the signal-to-noise ratio is decreased (there is more noise), resulting in decreased sensitivity and false positives. In addition, autofluorescence spillover into other channels can mask low expressers. The level of autofluorescence can be determined using unstained controls (Figure 1). As autofluorescence weakens at longer light wavelengths, fluorophores emitting above 600 nm have less autofluorescence interference. The use of a very bright fluorophore will also reduce the impact of autofluorescence.
Live/Dead Exclusion
The presence of dead cells in your sample can greatly affect your staining and therefore the quality of your data. Dead cells have greater autofluorescence and increased nonspecific antibody binding compared with live cells, leading to false positives and reducing the dynamic range. This may make identification of weakly positive samples and rare populations difficult. Including a viability control, not relying on FSC and SSC, will improve your data. DNA binding dyes, such as propidium iodide (PI), 7-AAD, and DAPI, are not membrane permeable and are therefore excluded from live cells. They can be added after staining just before acquisition but cannot be used on fixed cells, as the fixation process renders the membrane permeable. Protein binding dyes are a second group of viability dyes that can be used to discriminate live and dead cells in your samples. These bind to primary amines and both live and dead cells. However, when a cell has a compromised membrane, as seen in dead and dying cells, a greater amount of protein is accessible, therefore the cells have higher fluorescence. Protein binding dyes have two main benefits. Firstly, they can be fixed (they can also be used unfixed) without any reduction in the resolution between live and dead cells. Secondly, they are available in a broader range of excitation and emission spectra than DNA binding dyes, making their addition to multicolor flow cytometry panels convenient. As the dead cells are excluded from the analysis, unwanted spillover from these dyes is also excluded from the analysis, but you should always include a single stain to enable compensation.
Doublet Discrimination
Doublet discrimination, as the name suggests, allows you to count single cells and exclude doublets from your analysis. As the sample passes the interrogation point, it creates a signal pulse, giving you the height, time (width), and area of the signal for each parameter. If more than one cell passes through, the cytometer will register them all as one cell. This leads to false statistics, over- or underrepresentation of subsets, and false staining patterns. Doublet exclusion is performed by plotting the height or width against the area for forward scatter or side scatter. Doublets will have double the area and width values of single cells while the height is roughly the same. Therefore, disproportions between height, width, and area can be used to identify doublets (Figure 1).
While doublet discrimination is important in all acquisitions, it is especially important in cell sorting, cell cycle, and DNA analysis. In general, when acquiring a multicolor panel of peripheral blood, a doublet of a B and T cell would be positive for both the T cell marker CD3 and the B cell marker CD19. In cell sorting, if a fluorescencepositive cell and a negative cell pass through the laser at the same time, it will produce a positive pulse, leading to false positives and poor sorting results (Figure 3).
In cell cycle analysis, it is important to distinguish between doublets and single cells that have twice the amount of DNA, as both show increased fluorescence when stained with a DNA dye. Fortunately, doublets can be distinguished from single cells. Doublets contain two cells and therefore four complete copies of DNA, whereas single cells late in their cell cycle contain only two copies of DNA. These values can be denoted as 4n and 2n, respectively, where n equals the number of DNA copies.
Collect a Statistically Relevant Number of Cells
The number of cells you need to collect during analysis to
have enough statistical power can vastly differ depending
on the sample and frequency of your cells. Theoretically,
with perfect controls, just one event can be seen as
a positive result, but in practice this is unlikely to be
publication-quality. If you have a sample with an abundant
cell type, such as T cells in human peripheral blood, which
represent around 20% of total mononuclear cells, you will
have to collect and stain fewer cells than if you are looking
at natural killer (NK) cells, which have a frequency around
5%, to collect the same number of events.
In addition, the number of markers simultaneously required
to look at cell subsets can affect the number of cells
that need to be acquired. Generally, using more markers
requires more cells, as more sequential gates are required
to identify the subsets of interest. An example of this can
be seen in Figure 31. Despite acquiring 600,000 cells after
several rounds of gating to identify resting regulatory T cells
(Tregs), the final number of positive cells was ~0.25% or
roughly 1,500 events.
Finally, performing the right controls to determine the
variation in your experiment and allow definition of a positive
or negative population is also very important and will allow
you to make accurate judgements on low numbers of
events. More detailed information on how to collect enough
events can be found in an article by Roederer (2008).
Permeabilization and Fixation for Intracellular Antigens
Staining intracellular antigens (cytokines, for example) can be difficult because antibody-based probes cannot pass easily through the plasma membrane into the cell. To accomplish this, cells should first be fixed in suspension and then permeabilized before adding the antibody. The choice of fixative is an important first step. Formaldehyde and gluteraldehyde create bonds between lysine residues, resulting in crosslinked proteins, and gluteraldehyde increases autofluorescence. Fixatives are usually used at concentrations of 0.5–4% in PBS depending on the sample. If you are going to store your samples for longer periods of time, they should be removed from the fixative and stored in PBS at 4°C.
Formaldehyde will not permeabilize the samples, so a separate permeabilization step is needed. This allows probes to access intracellular structures while leaving the morphological scatter characteristics of the cells intact. Triton, digitonin, and saponin are examples of permeabilization reagents that act by disrupting the cellular membrane. The level of permeabilization is important, as the epitope access may require different levels of permeabilization (for example, cytoplasmic vs. nuclear epitopes) and the unbound antibody has to be sufficiently washed out of the cells. There are also many commercial kits available today that provide the reagents to carry out both fixation and permeabilization, for example, Leucoperm Reagent. Alcohols are also used as fixatives, typically as a cold 70% (v/v) solution, that fix by denaturing proteins. The benefits here are that they also permeabilize the cell membrane and are suitable for long-term storage at 4°C or –20ºC. Epitopes can be masked by the denaturing process with alcohol fixation, resulting in no detectable antibody staining. Optimization may be required in this case. Alcohols are most commonly used as fixatives for DNA analysis. Permeabilization and Fixation for Intracellular Antigens
Staining intracellular antigens (cytokines, for example) can be difficult because antibody-based probes cannot pass easily through the plasma membrane into the cell. To accomplish this, cells should first be fixed in suspension and then permeabilized before adding the antibody. The choice of fixative is an important first step. Formaldehyde and gluteraldehyde create bonds between lysine residues, resulting in crosslinked proteins, and gluteraldehyde increases autofluorescence. Fixatives are usually used at concentrations of 0.5–4% in PBS depending on the sample. If you are going to store your samples for longer periods of time, they should be removed from the fixative and stored in PBS at 4°C.
ITALIANO
Uno dei fondamenti della citometria a flusso è la capacità di misurare singole particelle mentre passano attraverso un raggio laser. Tuttavia, il citometro può misurare solo ciò che viene inserito e un campione scadente generalmente porterà a dati scadenti. È essenziale iniziare con il miglior campione possibile e trattare i campioni il più delicatamente possibile in modo da avere una sospensione cellulare vitale e ottenere buoni dati.
Preparazione del campione
Ci sono molte considerazioni sulla preparazione del campione per ottenere risultati ottimali. Il primo è il campione stesso. Ad esempio, le cellule congelate dovranno essere trattate in modo diverso rispetto a una linea cellulare aderente. Seguire alcune regole di base, come quelle evidenziate di seguito, ti aiuterà a ottimizzare i tuoi esperimenti.
1. Scongelare le cellule il più rapidamente possibile e rimuovere il dimetilsolfossido (DMSO) risospendendo le cellule in un grande volume di terreno freddo o soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente BSA o siero fetale di vitello (FCS) prima della centrifugazione. Le cellule potrebbero dover andare in coltura dopo lo sbrinamento per ripristinare l'espressione dell'epitopo.
2. Quando si preparano le cellule per la citometria a flusso, potrebbero essere necessari trattamenti più delicati di quelli richiesti per il passaggio. La tripsina è un trattamento duro che spesso può distruggere le cellule, creando molti detriti cellulari, oltre a distruggere gli epitopi che si desidera rilevare utilizzando la citometria a flusso.
3. Sii gentile quando usi la disaggregazione meccanica di tessuti come milza o linfonodi. Il filtraggio del campione può aiutare a rimuovere eventuali grumi di cellule indesiderati.
4. L'estrazione di alcune cellule dal tessuto linfoide secondario (ad esempio, macrofagi F4/80-positivi e cellule dendritiche follicolari [DC]) richiede enzimi aggiuntivi come la collagenasi o la liberasi. Tuttavia, questi enzimi possono rimuovere inavvertitamente gli epitopi se applicati per troppo tempo, quindi potrebbe essere necessaria l'ottimizzazione.
5. Rimuovere qualsiasi materiale contaminante indesiderato. Ad esempio, quando si lava il midollo osseo dalle ossa, rimuovere quanto più muscoli possibile. Anche in questo caso, il filtraggio può rimuovere eventuali ossa e muscoli indesiderati.
6. Utilizzare l'anticoagulante appropriato per il sangue periferico. L'EDTA non deve essere utilizzato per rilevare citochine intracellulari o alcuni marcatori di superficie che richiedono ioni Ca2+ come le integrine.
7. La rimozione dei globuli rossi contaminanti dai campioni di sangue periferico può essere eseguita mediante lisi ipotonica utilizzando Erythrolyse Red Blood Cell Lysing Buffer (#BUF04B) o un tampone di lisi comparabile. È necessario prestare attenzione a non lasciare i campioni nel buffer per troppo tempo. In alternativa, è possibile utilizzare un gradiente di densità. Dopo la centrifugazione, i leucociti vengono intrappolati all'interfaccia del liquido a densità più elevata, mentre i globuli rossi passano attraverso. Sfortunatamente, anche i granulociti passano attraverso l'interfaccia, quindi i gradienti di densità non sono raccomandati per questo tipo di cellula.
8. Evitare il vortex e la centrifugazione eccessiva o lasciare le cellule come pellet secco. La creazione di troppe bolle durante la risospensione delle cellule o la risospensione delle cellule ad alte concentrazioni può aumentare la morte cellulare. Mantenere le cellule in ghiaccio può migliorare la vitalità, poiché ciò rallenta la necrosi e il metabolismo cellulare.
9. Assicurati di utilizzare i tubi giusti. Molti tipi cellulari (ad esempio i monociti) mostrano una maggiore aderenza al polistirene ma aderiscono meno al polipropilene. Se il numero di cellule è basso, evitare i tubi di polistirene per ridurre la perdita di questi tipi di cellule.
10. Tutta la preparazione del campione dovrebbe essere la più breve possibile, poiché il tempo impiegato per preparare le cellule può avere un effetto significativo sulla vitalità cellulare
Autofluorescenza
Le cellule hanno un livello naturale di fluorescenza, chiamato autofluorescenza, che può essere un problema nell'analisi dei dati di citometria a flusso. L'autofluorescenza cellulare può essere dovuta alla presenza di collagene ed elastina, composti ad anello ciclico come NADPH e riboflavina, aminoacidi aromatici e organelli cellulari come mitocondri e lisosomi. L'autofluorescenza nelle cellule può variare a causa delle variazioni nei livelli di questi composti cellulari e organelli che danno origine alla fluorescenza. In generale, le cellule più grandi e granulari hanno una maggiore autofluorescenza a causa dell'aumento del numero di composti fluorescenti. La maggior parte dell'autofluorescenza viene rilevata a lunghezze d'onda della luce più brevi con la maggior parte che assorbe a 350–500 nm ed emette a 350–550 nm. Può quindi essere un problema in queste gamme di lunghezze d'onda, poiché il rapporto segnale-rumore è ridotto (c'è più rumore), con conseguente diminuzione della sensibilità e falsi positivi. Inoltre, lo spillover dell'autofluorescenza in altri canali può mascherare i bassi espressi. Il livello di autofluorescenza può essere determinato utilizzando controlli non colorati (Figura 2). Poiché l'autofluorescenza si indebolisce a lunghezze d'onda della luce più lunghe, i fluorofori che emettono al di sopra di 600 nm hanno una minore interferenza dell'autofluorescenza. L'uso di un fluoroforo molto luminoso ridurrà anche l'impatto dell'autofluorescenza.
Esclusione dal vivo/morto
La presenza di cellule morte nel campione può influire notevolmente sulla colorazione e quindi sulla qualità dei dati. Come discusso nel Capitolo 4, le cellule morte hanno una maggiore autofluorescenza e un maggiore legame anticorpale non specifico rispetto alle cellule vive, portando a falsi positivi e riducendo l'intervallo dinamico. Ciò può rendere difficile l'identificazione di campioni debolmente positivi e popolazioni rare. Includere un controllo di fattibilità, senza fare affidamento su FSC e SSC, migliorerà i tuoi dati. I coloranti leganti il DNA, come ioduro di propidio (PI), 7-AAD e DAPI, non sono permeabili alla membrana e sono quindi esclusi dalle cellule vive. Possono essere aggiunti dopo la colorazione appena prima dell'acquisizione, ma non possono essere utilizzati su cellule fisse, poiché il processo di fissazione rende la membrana permeabile. I coloranti leganti le proteine sono un secondo gruppo di coloranti di vitalità che possono essere utilizzati per discriminare le cellule vive e morte nei campioni. Questi si legano alle ammine primarie e alle cellule sia vive che morte. Tuttavia, quando una cellula ha una membrana compromessa, come si vede nelle cellule morte e morenti, è disponibile una maggiore quantità di proteine, quindi le cellule hanno una maggiore fluorescenza. I coloranti che legano le proteine hanno due vantaggi principali. In primo luogo, possono essere riparati (possono essere utilizzati anche non fissati) senza alcuna riduzione della risoluzione tra cellule vive e morte. In secondo luogo, sono disponibili in una gamma più ampia di spettri di eccitazione ed emissione rispetto ai coloranti leganti il DNA, rendendo conveniente la loro aggiunta ai pannelli di citometria a flusso multicolori. Poiché le cellule morte sono escluse dall'analisi, anche lo spillover indesiderato di questi coloranti è escluso dall'analisi, ma dovresti sempre includere un singolo colorante per consentire la compensazione.
Discriminazione del doppietto
La discriminazione dei doppietti, come suggerisce il nome, ti consente di contare singole celle ed escludere i doppietti dalla tua analisi. Quando il campione supera il punto di interrogazione, crea un impulso di segnale, fornendo l'altezza, il tempo (larghezza) e l'area del segnale per ciascun parametro. Se più di una cellula passa, il citometro le registrerà tutte come una cellula. Ciò porta a false statistiche, sovra o sottorappresentazione di sottoinsiemi e falsi schemi di colorazione. L'esclusione del doppietto viene eseguita tracciando l'altezza o la larghezza rispetto all'area per la dispersione in avanti o la dispersione laterale. I doppietti avranno il doppio dei valori di area e larghezza delle singole celle mentre l'altezza è più o meno la stessa. Pertanto, le sproporzioni tra altezza, larghezza e area possono essere utilizzate per identificare i doppietti (Figura 1).
Sebbene la discriminazione del doppietto sia importante in tutte le acquisizioni, è particolarmente importante nell'ordinamento cellulare, nel ciclo cellulare e nell'analisi del DNA. In generale, quando si acquisisce un pannello multicolore di sangue periferico, un doppietto di una cellula B e T sarebbe positivo sia per il marker delle cellule T CD3 che per il marker delle cellule B CD19. Nello smistamento cellulare, se una cella positiva e una negativa alla fluorescenza passano contemporaneamente attraverso il laser, produrrà un impulso positivo, portando a falsi positivi e risultati di smistamento scadenti (Figura 3).
Nell'analisi del ciclo cellulare, è importante distinguere tra doppietti e singole cellule che hanno il doppio della quantità di DNA, poiché entrambi mostrano una maggiore fluorescenza quando colorati con un colorante al DNA. Fortunatamente, i doppietti possono essere distinti dalle singole cellule. I doppietti contengono due cellule e quindi quattro copie complete di DNA, mentre le singole cellule alla fine del loro ciclo cellulare contengono solo due copie di DNA. Questi valori possono essere indicati rispettivamente come 4n e 2n, dove n è uguale al numero di copie del DNA.
Raccogli un numero di celle statisticamente rilevante
Il numero di cellule che devi raccogliere durante l'analisi per avere una potenza statistica sufficiente può variare notevolmente a seconda del campione e della frequenza delle tue cellule. Teoricamente, con controlli perfetti, un solo evento può essere visto come un risultato positivo, ma in pratica è improbabile che questo sia di qualità di pubblicazione. Se si dispone di un campione con un tipo cellulare abbondante, come i linfociti T nel sangue periferico umano, che rappresentano circa il 20% del totale delle cellule mononucleate, sarà necessario raccogliere e colorare meno cellule rispetto a un killer naturale (NK) celle, che hanno una frequenza intorno al 5%, per raccogliere lo stesso numero di eventi. Esso mostra un esempio di come la frequenza delle cellule può influenzare il numero di cellule raccolte.
Inoltre, il numero di marcatori richiesti contemporaneamente per esaminare i sottoinsiemi di cellule può influenzare il numero di cellule che devono essere acquisite. In genere, l'utilizzo di più marcatori richiede più cellule, poiché sono necessarie più porte sequenziali per identificare i sottoinsiemi di interesse. Nonostante l'acquisizione di 600.000 cellule dopo diversi cicli di gating per identificare le cellule T regolatorie a riposo (Treg), il numero finale di cellule positive era di circa 0,25% o circa 1.500 eventi. Infine, anche eseguire i controlli giusti per determinare la variazione nel tuo esperimento e consentire la definizione di una popolazione positiva o negativa è molto importante e ti consentirà di esprimere giudizi accurati su un basso numero di eventi. Informazioni più dettagliate su come raccogliere un numero sufficiente di eventi possono essere trovate in un articolo di Roederer (2008).
Permeabilizzazione e fissazione per antigeni intracellulari
La colorazione degli antigeni intracellulari (citochine, per esempio) può essere difficile perché le sonde a base di anticorpi non possono passare facilmente attraverso la membrana plasmatica nella cellula. Per ottenere ciò, le cellule devono essere prima fissate in sospensione e quindi permeabilizzate prima di aggiungere l'anticorpo. La scelta del fissativo è un primo passo importante. La formaldeide e la gluteraldeide creano legami tra i residui di lisina, risultando in proteine reticolate, e la gluteraldeide aumenta l'autofluorescenza. I fissativi vengono solitamente utilizzati a concentrazioni dello 0,5–4% in PBS a seconda del campione. Se hai intenzione di conservare i tuoi campioni per periodi di tempo più lunghi, dovrebbero essere rimossi dal fissativo e conservati in PBS a 4°C.
La formaldeide non permeabilizzerà i campioni, quindi è necessaria una fase di permeabilizzazione separata. Ciò consente alle sonde di accedere alle strutture intracellulari lasciando intatte le caratteristiche di dispersione morfologica delle cellule. Tritone, digitonina e saponina sono esempi di reagenti di permeabilizzazione che agiscono distruggendo la membrana cellulare. Il livello di permeabilizzazione è importante, poiché l'accesso all'epitopo può richiedere diversi livelli di permeabilizzazione (ad esempio, epitopi citoplasmatici rispetto a quelli nucleari) e l'anticorpo non legato deve essere sufficientemente lavato via dalle cellule. Oggi sono disponibili anche molti kit commerciali che forniscono i reagenti per effettuare sia la fissazione che la permeabilizzazione, ad esempio il Leucoperm Reagent. Gli alcoli sono anche usati come fissativi, tipicamente come una soluzione fredda al 70% (v/v), che si fissano denaturando le proteine. I vantaggi qui sono che permeabilizzano anche la membrana cellulare e sono adatti per la conservazione a lungo termine a 4°C o –20ºC. Gli epitopi possono essere mascherati dal processo di denaturazione con fissazione dell'alcol, risultando in una colorazione anticorpale non rilevabile. In questo caso potrebbe essere necessaria l'ottimizzazione. Gli alcoli sono più comunemente usati come fissativi per l'analisi del DNA. Permeabilizzazione e fissazione per antigeni intracellulari
La colorazione degli antigeni intracellulari (citochine, per esempio) può essere difficile perché le sonde a base di anticorpi non possono passare facilmente attraverso la membrana plasmatica nella cellula. Per ottenere ciò, le cellule devono essere prima fissate in sospensione e quindi permeabilizzate prima di aggiungere l'anticorpo. La scelta del fissativo è un primo passo importante. La formaldeide e la gluteraldeide creano legami tra i residui di lisina, risultando in proteine reticolate, e la gluteraldeide aumenta l'autofluorescenza. I fissativi vengono solitamente utilizzati a concentrazioni dello 0,5–4% in PBS a seconda del campione. Se hai intenzione di conservare i tuoi campioni per periodi di tempo più lunghi, dovrebbero essere rimossi dal fissativo e conservati in PBS a 4°C.
Da:
https://offers.the-scientist.com/hubfs/TS_PPL_Bio-Rad%20EU_Evergreen%20Flow%20Cytometry_Guide_406213/flow-cytometry-basics-guide.pdf?hsCtaTracking=ae192164-1471-4fb9-9577-ce6d1cadc0e5%7Ccdaea2a5-8e3e-43c3-8d2c-a82844d2313f
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