Overview of cell isolation, engineering, and expansion / Panoramica dell'isolamento, dell'ingegneria e dell'espansione delle cellule
Overview of cell isolation, engineering, and expansion / Panoramica dell'isolamento, dell'ingegneria e dell'espansione delle cellule
Segnalato dal Dott, Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Figure 1. Similarities and differences associated with autologous vs allogeneic approaches to CAR T cell therapy workflow. / Somiglianze e differenze associate agli approcci autologhi rispetto a quelli allogenici al flusso di lavoro della terapia cellulare CAR T
The use of chimeric antigen receptor (CAR) technology has contributed towards significant advances in the treatment of certain types of cancer. This technology harnesses the immune defenses (e.g., T cells) to specifically target a patient’s cancerous cells with modified immune cells carrying a CAR “payload”. As with many new technologies, rapid progress is being made that overcomes the barriers and hurdles associated with earlier generations of the CAR T technology. These next sections will discuss some of the more recent improvements to the development and manufacturing of CAR T cell therapies, including approaches to T cell isolation, engineering steps to produce CAR T cells, and strategies for the expansion of engineered cells for subsequent patient treatment (Figure 1). This section will also introduce some newer approaches that use natural killer (NK) cells as immunological weapons for cancer treatment. A short introduction to the biology behind CAR T therapies is provided here as a platform to discuss the manufacturing process.What is CAR? Selection Gene transfer T cell isolation and activation Leukapheresis PBMC isolation Expansion CAR T cell expansion Infusion Formulation and cryopreservation of CAR T cells, followed by infusion Autologous CAR T cell therapy (patient’s blood) Allogeneic CAR T cell therapy (healthy donor’s blood) Same patient Multiple patients CAR gene transferred into T cells a. Genome editing of T cells b. CAR gene transferred into edited T cells A chimeric antigen receptor (CAR) is an artificial receptor that is engineered to be expressed on immune cells such as T cells and NK cells. For CAR T cell therapies, the T cells are engineered to express a CAR protein that recognizes unique tumor antigens. The CAR protein is composed of an extracellular domain derived from a monoclonal antibody and an intracellular domain derived from T cells.
The design and construction of these components is what make CAR T therapy one of the most advanced forms of adoptive cell therapies. The CAR protein is composed of three parts (Figure 2):
1. The extracellular domain—a single-chain fragment variant (scFv), which is derived from a monoclonal antibody molecule specific to a unique tumor antigen (e.g., CD19 on leukemia cells)
2. A transmembrane domain—to serve as an anchor
3. An intracytoplasmic domain—the “functional” component derived from T cells
Figure 2. Anatomy of a chimeric antigen receptor. / Anatomia di un recettore chimerico dell'antigene.
Extracellular domain (scFv)
The scFV or extracellular domain is the tumor antigenbinding domain, which specifies the CAR T target. It is located on the T cell membrane and is a singlechain antibody fragment derived from a monoclonal antibody. The scFv is made up of the variable region of a light and heavy (VL and VH) chain and is fused to the transmembrane domain with a short linker. Like any antibody, these single-chain antibodies can bind to protein, carbohydrate, and glycolipids.
Transmembrane domain
The transmembrane domain functions solely to stabilize the scFv portion of CAR on the T cell surface. The transmembrane domain is usually derived from CD8α but can also be based on CD4 or CD28. T cell CAR Linker ScFv Spacer Extracellular domain (tumor antigen recognition) Transmembrane domain (anchor) Intracytoplasmic domain (co-stimulation and signaling) VH VL
The intracytoplasmic domain, which is derived from the CD3 ς chain, is the functional (or signaling) end of the CAR. After the binding of the CAR scFv to the tumor antigen, the CAR intracytoplasmic (CD3 ς chain) forms a cluster, which will initiate activation signaling, ultimately leading to cytotoxicity of the tumor cells. The design of each of these parts of the CAR is critical for the success of the anti-tumor response. As expected, there have been several improvements to make CAR T cells kill more efficiently, persist longer in vivo, and be less toxic. For example, a second-generation CAR added an immunomodulator at the intracytoplasmic domain (e.g., CD28 or CD137 (4-1BB)) and improved the killing machinery. When both immunomodulators CD28 and CD137 were added (third-generation CAR), persistency improved
Autologous versus allogeneic
CAR T therapies Early CAR T cell therapy work relied on harnessing the power of T cells isolated from the cancer patient. The patient’s T cells were then modified to target cancer cells and infused back into the patient. This process, known as autologous CAR T therapy, typically took 3–4 weeks and had an approximate failure rate of 7–10%. While great success was achieved with this approach, autologous CAR T therapy manufacturing is a lengthy process that extends treatment timelines and is not scalable. The limitations of autologous CAR T therapy can be overcome by engineering third-party T cells derived from healthy donors. These so called “off-the-shelf” or allogeneic CAR T cells can be made in advance and released for immediate use when needed by the patient. Unlike autologous therapies that directly treat one patient, allogeneic therapies can treat multiple patients. It summarizes the many benefits to using an allogeneic approach compared to an autologous approach. In addition, the allogeneic approach provides a standard drug product produced from donor sources displaying an optimal immunological profile enriched with stem cell memory T cells (TSCM). This could make allogeneic CAR T cell products a first line therapy for B cell malignancy.
Issues with allogeneic CAR T therapy: overcoming patient rejection
While allogeneic CAR T therapy helps to address some of the issues encountered with autologous approaches, it still faces serious hurdles. Most importantly, allogeneic CAR T therapies can cause serious life-threatening reactions arising from patient rejection—where the patient’s own immune system recognizes the donor cells as foreign. Figure 3 illustrates the basic biology behind patient rejection of allogeneic T cells. This rejection is driven by the interaction of human leukocyte antigen (HLA) class I and T cell receptors (TCR) that are expressed on both the donor’s and patient’s T cells and can lead to three rejection scenarios:
• Graft-versus-host disease (GvHD)
• Host-versus-graft-disease (HvGD)
• A patient’s NK cells attacking allogeneic CAR+ T cells with masked HLA (a modification strategy used to avoid the first two scenarios) Issues with allogeneic CAR T therapy: overcoming patient rejection α 3 α α β Donor T cell (graft) Recipient T cell (host) β α α β2M β β HLA I HLA I TCR TCR α 2 α1 α 3 β2M α 2 α1
The interaction between the TCR and HLA I on both donor and patient T cells drives two rejection pathways. In graft vs. host disease, the donor TCR recognizes the allogeneic peptide/HLA I of the host T cell, resulting in rejection (i.e., killing) of the host cell. In host vs. graft disease, the opposite occurs—the host TCR recognizes the donor HLA I as foreign and targets it for killing. TCR is a membrane-bound protein consisting of α and β chains and is expressed as part of the CD3 complex molecule on the surface of all T cells (Figure 3). The surface-displayed HLA class I molecules appear ubiquitously on cells throughout the body and consist of α chains that are stabilized by β2-microglobulin (β2M, Figure 3). An HLA class I molecule is made up of a group of 6 genes that are designated as A, B, C, E, F, and G. These genes are further divided based on their polymorphism. The genes A, B, and C are highly polymorphic with over 6,000 alleles represented in each one of them. The nonpolymorphic genes are E, F, and G with allelic variants of less than 300
The mechanism of rejection is initiated by the recognition and interaction of the TCR αβ chains of T cells with the HLA class I molecules (Figure 4). In graft-versus-host disease, the allogeneic rejection arises when the TCR on donor T cells regards the HLA class I complex on the recipient’s cells (tissues) as foreign and attacks it. Similarly, in host-versus-graft disease, the TCR of the recipient’s T cells recognizes the HLA class I complex on donor T cells as foreign and attacks it. To remove these rejection barriers, scientists can exploit the fundamental biology of the TCR and the HLA class I complex. More specifically, the disruption of β2M through gene editing can be used to prevent mature donor HLA class I molecules from reaching the cell surface, essentially shielding the donor T cells from recipient T cell recognition and elimination. Similarly, disruption of the donor cell TCR α or β chains through gene editing can prevent the recognition and attack of donor T cells by the recipient T cells.
Figure 4. Off-the-shelf strategy to prevent allogeneic rejection responses. Right side: Elimination of the TCRα chain on the grafted allogeneic CAR T cells prevents graft vs. host disease (GvHD). Left side: Elimination of HLA I through disruption of β2M on the grafted allogeneic CAR T cells prevent host vs. graft disease (HvGD). / Strategia standard per prevenire le risposte di rigetto allogenico. Lato destro: l'eliminazione della catena TCRα sulle cellule CAR T allogeniche innestate previene la malattia del trapianto rispetto all'ospite (GvHD). Lato sinistro: l'eliminazione di HLA I attraverso l'interruzione di β2M sui linfociti CAR T allogenici innestati previene la malattia dell'ospite rispetto al trapianto (HvGD).
These approaches, however, can lead to a third rejection barrier caused by the loss of the HLA class I on the donor cells, rendering the donor cells susceptible to targeting by the recipient’s own NK cells (Figure 5), also known as the “missing self signal” . To overcome recipient NK cell-mediated elimination of HLA– or TCR– donor cells, researchers can genetically modify the donor cell to express an inhibitory molecule such as non-polymorphic Activating ligand Activating receptor Activating receptor Activating ligand α3 β2M NKG2A α2 CD94 NKG2A CD94 Kill α1 Inhibitory receptor HLA-E Inhibitory receptor Knock-in HLA-E (nonclassical HLA I) Loss of HLA I expression Activating NK cell promotes the killing of allogeneic CAR T cell by NK cell NK cell (host) Allogeneic CAR T cell (donor cell graft) Allogeneic CAR T cell (donor cell graft) Tumor cell Tumor cell HLA-E (Figure 5) . This modification can be performed by inserting or “knocking-in” the sequence to HLA-E fused with β2M. This step leads to the stable expression of a type of HLA class I molecule on the donor cells and prevents recipient NK-mediated killing of those cells (Figure 5)
Summary
The choice of allogeneic T cell sources allows for the use of material that features a higher quality starting blood from healthy third-party donors and improved immunological cell makeup, which can improve scalability of the final product. It also provides an approach to treat multiple patients unlike an autologous approach. The use of allogeneic T cell sources can lead to patient rejection outcomes (e.g., GvHD and HvGD), and technical advances are being utilized to mitigate some of these issues. T cells gene editing of HLA class I or TCR genes to overcome the “foreignness” seen in the host system. Clinical successes provide evidence that allogeneic CAR T cell therapies employing some of these masking techniques enable use of this approach for a wider number of patients and are fueling the growth in this space with multiple allogeneic CAR-focused companies already testing allogeneic CAR T therapy in the clinic.
ITALIANO
Introduzione
L'uso della tecnologia del recettore dell'antigene chimerico (CAR) ha contribuito a progressi significativi nel trattamento di alcuni tipi di cancro. Questa tecnologia sfrutta le difese immunitarie (ad esempio, i linfociti T) per colpire specificamente le cellule cancerose di un paziente con cellule immunitarie modificate che trasportano un "carico utile" CAR. Come per molte nuove tecnologie, si stanno compiendo rapidi progressi che superano le barriere e gli ostacoli associati alle generazioni precedenti della tecnologia CAR T. Le prossime sezioni discuteranno alcuni dei miglioramenti più recenti allo sviluppo e alla produzione di terapie con cellule CAR T, inclusi approcci all'isolamento dei linfociti T, fasi di progettazione per produrre cellule CAR T e strategie per l'espansione delle cellule ingegnerizzate per il successivo trattamento del paziente ( Figura 1). Questa sezione introdurrà anche alcuni nuovi approcci che utilizzano le cellule natural killer (NK) come armi immunologiche per il trattamento del cancro. Una breve introduzione alla biologia alla base delle terapie CAR T viene fornita qui come piattaforma per discutere il processo di produzione.
Cos'è la CAR?
Selezione
Trasferimento genico
Isolamento e attivazione dei linfociti T Leucoaferesi
Isolamento PBMC Espansione
Espansione dei linfociti CAR T
Infusione Formulazione e crioconservazione dei linfociti CAR T, seguita da infusione Terapia con cellule CAR T autologhe (sangue del paziente) Terapia con cellule CAR T allogeniche (sangue di donatore sano)
Stesso paziente
Multiplo pazienti CAR gene trasferito nei linfociti T a.
Modifica del genoma dei linfociti T b.
Gene CAR trasferito in cellule T modificate Un recettore dell'antigene chimerico (CAR) è un recettore artificiale progettato per essere espresso su cellule immunitarie come cellule T e cellule NK.
Per le terapie con cellule CAR T, le cellule T sono progettate per esprimere una proteina CAR che riconosce antigeni tumorali unici. La proteina CAR è composta da un dominio extracellulare derivato da un anticorpo monoclonale e da un dominio intracellulare derivato da cellule T.
La progettazione e la costruzione di questi componenti è ciò che rende la terapia CAR T una delle forme più avanzate di terapie cellulari adottive. La proteina CAR è composta da tre parti (Figura 2):
1. Il dominio extracellulare: una variante del frammento a catena singola (scFv), che è derivata da una molecola di anticorpo monoclonale specifica per un antigene tumorale unico (ad es. CD19 sulle cellule leucemiche)
2. Un dominio transmembrana, che funge da ancora
3. Un dominio intracitoplasmatico: il componente "funzionale" derivato dai linfociti T
Dominio extracellulare (scFv)
Il dominio scFV o extracellulare è il dominio di legame dell'antigene tumorale, che specifica il bersaglio CAR T. Si trova sulla membrana dei linfociti T ed è un frammento di anticorpo a catena singola derivato da un anticorpo monoclonale. Il scFv è costituito dalla regione variabile di una catena leggera e pesante (VL e VH) ed è fusa al dominio transmembrana con un linker corto. Come qualsiasi anticorpo, questi anticorpi a catena singola possono legarsi a proteine, carboidrati e glicolipidi.
Dominio transmembrana
Il dominio transmembrana funziona esclusivamente per stabilizzare la porzione scFv di CAR sulla superficie delle cellule T. Il dominio transmembrana è solitamente derivato da CD8α ma può anche essere basato su CD4 o CD28.
T cell CAR Linker ScFv Spacer Dominio extracellulare (riconoscimento dell'antigene tumorale)
Dominio transmembrana (ancora)
Dominio intracitoplasmatico (co-stimolazione e segnalazione) VH VL Figura 2. Anatomia di un recettore dell'antigene chimerico.
Dominio intracitoplasmatico
Il dominio intracitoplasmatico, che è derivato dalla catena CD3 ς, è l'estremità funzionale (o di segnalazione) del CAR. Dopo il legame del CAR scFv all'antigene tumorale, il CAR intracitoplasmatico (catena CD3 ς) forma un cluster, che avvierà la segnalazione di attivazione, portando infine alla citotossicità delle cellule tumorali. Il progetto di ciascuna di queste parti della CAR è fondamentale per il successo della risposta antitumorale. Come previsto, ci sono stati diversi miglioramenti per fare in modo che le cellule CAR T uccidano in modo più efficiente, persistano più a lungo in vivo e siano meno tossiche. Ad esempio, una CAR di seconda generazione ha aggiunto un immunomodulatore nel dominio intracitoplasmatico (ad esempio CD28 o CD137 (4-1BB)) e ha migliorato il meccanismo di uccisione. Quando sono stati aggiunti entrambi gli immunomodulatori CD28 e CD137 (CAR di terza generazione), la persistenza è migliorata
Autologo vs allogenico
Terapie CAR T Il lavoro iniziale della terapia con cellule CAR T si basava sullo sfruttamento del potere dei linfociti T isolati dal malato di cancro. Le cellule T del paziente sono state quindi modificate per colpire le cellule tumorali e reinfuse nel paziente. Questo processo, noto come terapia CAR T autologa, richiedeva in genere 3-4 settimane e aveva un tasso di fallimento approssimativo del 7-10%. Sebbene questo approccio abbia ottenuto un grande successo, la produzione della terapia CAR T autologa è un processo lungo che estende le tempistiche del trattamento e non è scalabile. I limiti della terapia CAR T autologa possono essere superati ingegnerizzando cellule T di terze parti derivate da donatori sani. Queste cosiddette cellule CAR T "off-the-shelf" o allogeniche possono essere prodotte in anticipo e rilasciate per l'uso immediato quando necessario da parte del paziente. A differenza delle terapie autologhe che trattano direttamente un paziente, le terapie allogeniche possono trattare più pazienti. Esso riassume i numerosi vantaggi dell'utilizzo di un approccio allogenico rispetto a un approccio autologo. Inoltre, l'approccio allogenico fornisce un farmaco standard prodotto da fonti di donatori che mostrano un profilo immunologico ottimale arricchito con cellule T di memoria delle cellule staminali (TSCM). Ciò potrebbe rendere i prodotti a base di cellule CAR T allogeniche una terapia di prima linea per la malignità delle cellule B.
Problemi con la terapia CAR T allogenica: superare il rigetto del paziente
Sebbene la terapia CAR T allogenica aiuti ad affrontare alcuni dei problemi incontrati con gli approcci autologhi, deve comunque affrontare seri ostacoli. Ancora più importante, le terapie CAR T allogeniche possono causare gravi reazioni pericolose per la vita derivanti dal rigetto del paziente, in cui il sistema immunitario del paziente riconosce le cellule del donatore come estranee. La figura 3 illustra la biologia di base alla base del rigetto del paziente delle cellule T allogeniche. Questo rigetto è guidato dall'interazione dell'antigene leucocitario umano (HLA) di classe I e dei recettori dei linfociti T (TCR) che sono espressi sui linfociti T del donatore e del paziente e possono portare a tre scenari di rigetto:
• Malattia del trapianto contro l'ospite (GvHD)
• Malattia dell'ospite contro il trapianto (HvGD)
• Le cellule NK di un paziente che attaccano le cellule T CAR+ allogeniche con HLA mascherato (una strategia di modifica utilizzata per evitare i primi due scenari) Problemi con la terapia CAR T allogenica: superamento del rigetto del paziente α 3 α α β Cellula T del donatore (trapianto) Cellula T ricevente ( ospite) β α α β2M β β HLA I HLA I TCR TCR α 2 α1 α 3 β2M α 2 α1
L'interazione tra il TCR e l'HLA I sia sul donatore che sui linfociti T del paziente guida due vie di rigetto. Nella malattia del trapianto contro l'ospite, il TCR del donatore riconosce il peptide allogenico/HLA I della cellula T ospite, determinando il rigetto (cioè l'uccisione) della cellula ospite. Nella malattia dell'ospite rispetto al trapianto, si verifica l'opposto: il TCR ospite riconosce il donatore HLA I come estraneo e lo prende di mira per ucciderlo. Il TCR è una proteina legata alla membrana costituita da catene α e β ed è espressa come parte della molecola del complesso CD3 sulla superficie di tutte le cellule T (Figura 3). Le molecole HLA di classe I visualizzate in superficie appaiono onnipresenti sulle cellule di tutto il corpo e sono costituite da catene α stabilizzate dalla β2-microglobulina (β2M, Figura 3). Una molecola HLA di classe I è costituita da un gruppo di 6 geni designati come A, B, C, E, F e G. Questi geni sono ulteriormente divisi in base al loro polimorfismo. I geni A, B e C sono altamente polimorfici con oltre 6.000 alleli rappresentati in ciascuno di essi. I geni non polimorfici sono E, F e G con varianti alleliche inferiori a 300.
Il meccanismo di rigetto è avviato dal riconoscimento e dall'interazione delle catene TCR αβ dei linfociti T con le molecole HLA di classe I (Figura 4). Nella malattia del trapianto contro l'ospite, il rigetto allogenico si verifica quando il TCR sulle cellule T del donatore considera il complesso HLA di classe I sulle cellule (tessuti) del ricevente come estraneo e lo attacca. Allo stesso modo, nella malattia dell'ospite contro l'innesto, il TCR dei linfociti T del ricevente riconosce il complesso HLA di classe I sui linfociti T del donatore come estraneo e lo attacca. Per rimuovere queste barriere di rigetto, gli scienziati possono sfruttare la biologia fondamentale del complesso TCR e HLA di classe I. Più specificamente, l'interruzione di β2M attraverso l'editing genetico può essere utilizzata per impedire alle molecole HLA di classe I di un donatore maturo di raggiungere la superficie cellulare, schermando essenzialmente le cellule T del donatore dal riconoscimento e dall'eliminazione delle cellule T riceventi. Allo stesso modo, l'interruzione delle catene TCR α o β delle cellule donatrici attraverso l'editing genetico può impedire il riconoscimento e l'attacco delle cellule T del donatore da parte delle cellule T riceventi.
Questi approcci, tuttavia, possono portare a una terza barriera di rigetto causata dalla perdita dell'HLA di classe I sulle cellule del donatore, rendendo le cellule del donatore suscettibili al targeting delle cellule NK del ricevente (Figura 5), noto anche come "mancante autosegnalazione”. Per superare l'eliminazione mediata dalle cellule NK del ricevente delle cellule del donatore HLA o TCR, i ricercatori possono modificare geneticamente la cellula del donatore per esprimere una molecola inibitoria come il ligando attivatore non polimorfico Recettore attivatore Recettore attivatore Il legante attivatore α3 β2M NKG2A α2 CD94 NKG2A CD94 Uccidi α1 Recettore inibitorio HLA-E Recettore inibitorio Knock-in HLA-E (HLA I non classico) Perdita dell'espressione HLA I L'attivazione delle cellule NK promuove l'uccisione di cellule CAR T allogeniche da parte delle cellule NK Cellule NK (ospite) Cellule CAR T allogeniche (cellule donatrici innesto) Cellula CAR T allogenica (trapianto di cellule del donatore) Cellula tumorale Cellula tumorale HLA-E (Figura 5) . Questa modifica può essere eseguita inserendo o "spingendo" la sequenza a HLA-E fusa con β2M. Questo passaggio porta all'espressione stabile di un tipo di molecola HLA di classe I sulle cellule del donatore e impedisce l'uccisione mediata da NK del ricevente di quelle cellule (Figura 5)
Riepilogo
La scelta di sorgenti di cellule T allogeniche consente l'uso di materiale che presenta una qualità superiore del sangue di partenza da donatori sani di terze parti ed una migliore composizione cellulare immunologica, che può migliorare la scalabilità del prodotto finale. Fornisce inoltre un approccio per il trattamento di più pazienti a differenza di un approccio autologo. L'uso di fonti di cellule T allogeniche può portare a risultati di rigetto del paziente (ad es. GvHD e HvGD) e vengono utilizzati progressi tecnici per mitigare alcuni di questi problemi.
Modifica dei geni delle cellule T dei geni HLA di classe I o TCR per superare la "estraneità" osservata nel sistema ospite.
I successi clinici forniscono la prova che le terapie allogeniche con cellule CAR T che impiegano alcune di queste tecniche di mascheramento consentono l'uso di questo approccio per un numero più ampio di pazienti e stanno alimentando la crescita in questo spazio con più aziende allogeniche focalizzate sulle CAR che stanno già testando la terapia CAR T allogenica nel clinica.
Da:
https://547446.fs1.hubspotusercontent-na1.net/hubfs/547446/Technology%20Networks/Landing%20Pages/Thermo/Mariskka/2022%20SQL%20Campaign/cell-therapy-handbook-thermo-fisher-1.pdf?__hstc=8807082.074aceb79027e793890018c0152531d2.1643566337753.1662136971846.1662227813798.105&__hssc=8807082.1.1662227813798&__hsfp=1418904915&hsCtaTracking=5ecb48c7-b247-4faf-be12-b0ce69caca78%7Ce6d6986c-d41a-473f-ba60-61a59c5d0605
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