How Stem Cells Are Shaping Drug Discovery / Come le cellule staminali stanno plasmando la scoperta dei farmaci

How Stem Cells Are Shaping Drug Discovery / Come le cellule staminali stanno plasmando la scoperta dei farmaci

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Stem cell biology is a rapidly advancing field of research, that has contributed to a substantially diverse array of scientific disciplines, ranging from developmental biology through to regenerative medicine. In recent years, one of the most promising applications for stem cell biology has been in drug discovery. Stem cells are increasingly being used in new and innovative ways to improve the drug discovery process – spanning academia, biotech start-ups and large pharmaceutical companies. In this list we’ll take a look at how stem cells are being used in the drug discovery process – from disease modeling, to target identification, through to compound screening, and toxicity testing. We will also discuss pivotal stem cell technologies and how these are shaping the pharmaceutical industry. 

Disease modeling

Drug discovery relies on having accurate models of human disease. Historically, disease modeling has been restricted to animal models, simple single cell organisms such as yeast, and immortalized human cancer cell lines. While contributing substantially to our understanding of various diseases, animal models do not fully approximate human physiology, and studies cannot be sufficiently scaled up for large-scale comprehensive phenotypic assays. Immortalized cell lines on the other hand can be scaled up, but are sometimes unreliable models of human disease due to substantial karyotypic abnormalities. HeLa cells for example have been reported to contain up to 80 chromosomes. Furthermore, certain cell types such as terminally differentiated neuronal subtypes are difficult to obtain from immortalized cell lines. Pluripotent stem cells have the extraordinary capacity to become any cell type in the adult body and offer a potentially unlimited source of human cell types for disease modeling. Normally they only appear for a very brief window during early embryonic development. Pioneering work by Evans, Kaufman and Thomson showed how these cells could be isolated from the inner cell mass of blastocyst stage embryos and cultured indefinitely in vitro.  Termed embryonic stem cells (ESCs), the use of these cells garnered a tremendous amount of controversy due to the ethical considerations of using human embryos Ground-breaking work by Shinya Yamanaka in 2006 helped circumvent these issues, by showing that genetic reprogramming could turn terminally differentiated adult cells back into an embryonic like state. These resulting stem cells, termed induced pluripotent stem cells (iPSCs) share many characteristics of embryonic stem cells (ESCs), including pluripotency.

The generation of iPSCs completely changed the landscape of disease modeling, making it possible to obtain an unlimited source of human cell types from patients with disease specific genetic backgrounds. By differentiating these cells into specific cell types relevant to particular diseases, it became possible to generate in vitro disease models, that on a cellular level more accurately reflect human disease. This approach has paved the way for generating evermore complex in vitro disease models and has been particularly advantageous for modeling neurodegenerative diseases, since human, terminally differentiated, specific neuronal subtypes are near impossible to obtain by other means. Now there exists a whole host of differentiation protocols to derive specific cell types from patient iPSCs. Key examples include; iPSCdopaminergic neurons for Parkinson’s disease, iPSC-cortical neurons for Alzheimer’s disease, and iPSCspinal motor neurons for amyotrophic lateral sclerosis. Two-dimensional in vitro disease models can only go so far in recapitulating human diseases, since cells in the human body do not exist in isolation. Furthermore, maturation of iPSCs into functionally mature adult cell types has often proved challenging in a 2D tissue culture environment. Three-dimensional organoid technologies have offered an innovative solution to these challenges by making it possible to grow entire miniature organ systems in a dish rather than just individual cell types. These are usually derived either from iPSCs or from tissue biopsies that contain tissue specific adult stem cell populations. Organoids can remarkably recapitulate cellular organization of many different organs. Key examples include miniature kidney organoids, brain organoids, pancreas organoids, intestinal organoids, and neuromuscular organoids.These have been particularly useful in modeling organ specific diseases where cellular interactions play a critical role, such as in Crohn’s disease, polycystic kidney disease, Alzheimer’s disease, and the tumor immune microenvironment in various forms of cancer. Furthermore, cancer organoids have also been generated directly from cancer patient biopsies, allowing personalized testing of different chemotherapeutic combinations to devise novel treatment strategies. Further to this, body-on-chip technologies have opened the doors to modeling diseases where interacting cell types made up of multiple organ systems play an important role in the disease pathogenesis. By developing micro-fabricated compartmentalized microfluidics devices, it is now possible to grow multiple organ systems in a spatially separated manner that resembles the human body. Key examples include modeling the blood brain barrier, modeling peripheral nerve/muscle connectivity, and modeling complex immune cell interactions. Work is even underway to use these approaches to generate entire “human-onchip” models of disease, where all vital organ systems in the body can be modeled simultaneously.

Compound screening 

Translating complex stem cell derived in vitro models into large scale, reproducible phenotypic assays that allow the screening of thousands of compounds, is a vital yet challenging step in stem cell-based drug discovery. Differentiating iPSCs into disease relevant cell types can often be highly variable between cell lines and experiments. To overcome this, many groups have now begun introducing sortable markers in order to purify desired cell types. This can make a huge difference for large-scale screens where reproducibility is key. Another approach has been direct lineage conversion where iPSCs are equipped with inducible systems to directly forward-program them from iPSCs into a desired cell type. In certain instances this conversion can be close to 100% and reduce the need for lengthy differentiation protocols.

With such advances in improving reproducibility, many groups and companies are now beginning to use stem cell-based phenotypic assays for large-scale primary drug screening endeavors. Examples of academically led large-scale stem cell-derived phenotypic screens include; an ALS motor neuron survival screen, a neurite outgrowth screen, calcium flux assay in sensory neurons to model pain, and a highthroughput vascular development screen. Indeed, many major pharmaceutical companies and biotech start-ups are now also making use of stem cell-derived phenotypic assays. 

Target identification 

Target identification is the process of identifying a molecular target that has the potential to be modulated by a therapeutic agent. Identifying novel drug targets using stem cells can come via several different routes. Stem cell-based models of disease offer many academic groups a faster, cheaper and often more accurate way to investigate novel disease mechanisms, resulting in a greater understanding of the molecular basis of disease. Building on this, a number of large-scale academic collaborations have been set up to amass a wealth of biomedical data from iPSCs. A key example of this is the Human Induced Pluripotent Stem Cell Initiative, where genomic, transcriptomic, proteomic and phenotypic data was collated from thousands of healthy and disease associated iPSC lines. This open source platform aims to provide researchers with a global resource that can be used to identify novel disease specific molecular targets. Finally, as mentioned, stem cell-derived phenotypic screens offer a holistic and empirical method for identifying novel compounds that revert disease associated phenotypes. Using downstream deconvolution strategies, it is then possible to identify novel molecular targets for these diseases. This approach is particularly useful when trying to identify novel targets for diseases where the mechanistic landscape is not completely understood. 

Toxicity screening

While stem cell-based models are incredibly useful in early stage disease specific phenotypic screens, stem cells can also be an incredibly useful tool for identifying off-target adverse effects of drugs already in development. Identifying such effects early on in the drug development pipeline can be much more costeffective than identifying these effects later in animal studies – or in some cases during clinical studies. Indeed, there are now several stem cell-derived toxicity screens that have been shown to work, by identifying adverse side-effects of already available drugs. These include cardiac toxicity screens, and liver toxicity screens. It is hoped that screening for toxicity early on in the drug development process will make it easier to re-design compounds to reduce their toxicity. 

Summary 

Stem cells are fast becoming an invaluable tool in the drug discovery process. Stem cells offer the remarkable capacity to generate an unlimited source of disease relevant cell types from which to identify novel molecular targets, perform large-scale phenotypic screens and also identify off-target toxicities.

ITALIANO

La biologia delle cellule staminali è un campo di ricerca in rapido progresso, che ha contribuito ad una gamma sostanzialmente diversificata di discipline scientifiche, che vanno dalla biologia dello sviluppo alla medicina rigenerativa. Negli ultimi anni, una delle applicazioni più promettenti per la biologia delle cellule staminali è stata la scoperta di farmaci. Le cellule staminali vengono sempre più utilizzate in modi nuovi ed innovativi per migliorare il processo di scoperta di farmaci, dal mondo accademico, alle start-up biotecnologiche ed alle grandi aziende farmaceutiche. In questo elenco daremo un'occhiata a come le cellule staminali vengono utilizzate nel processo di scoperta di farmaci: dalla modellazione della malattia, all'identificazione del bersaglio, fino allo screening dei composti ed ai test di tossicità. Discuteremo anche delle tecnologie fondamentali delle cellule staminali e di come queste stiano plasmando l'industria farmaceutica.

Modellazione delle malattie

La scoperta di farmaci si basa sull'avere modelli accurati delle malattie umane. Storicamente, la modellazione delle malattie è stata limitata a modelli animali, semplici organismi unicellulari come il lievito e linee cellulari di cancro umano immortalate. Pur contribuendo in modo sostanziale alla nostra comprensione di varie malattie, i modelli animali non si avvicinano completamente alla fisiologia umana e gli studi non possono essere sufficientemente ampliati per saggi fenotipici completi su larga scala. Le linee cellulari immortalate d'altra parte possono essere ampliate, ma a volte sono modelli inaffidabili di malattie umane a causa di sostanziali anomalie cariotipiche. È stato riportato che le cellule HeLa, ad esempio, contengono fino a 80 cromosomi. Inoltre, alcuni tipi cellulari come i sottotipi neuronali differenziati terminali sono difficili da ottenere da linee cellulari immortalate. Le cellule staminali pluripotenti hanno la straordinaria capacità di diventare qualsiasi tipo di cellula nel corpo adulto ed offrono una fonte potenzialmente illimitata di tipi di cellule umane per la modellazione delle malattie. Normalmente compaiono solo per una finestra molto breve durante lo sviluppo embrionale precoce. Il lavoro pionieristico di Evans, Kaufman e Thomson ha mostrato come queste cellule potrebbero essere isolate dalla massa cellulare interna degli embrioni allo stadio di blastocisti e coltivate a tempo indeterminato in vitro. Denominate cellule staminali embrionali (ESC), l'uso di queste cellule ha suscitato un'enorme quantità di polemiche a causa delle considerazioni etiche sull'utilizzo di embrioni umani Il lavoro rivoluzionario di Shinya Yamanaka nel 2006 ha aiutato ad aggirare questi problemi, dimostrando che la riprogrammazione genetica potrebbe trasformarsi in terminale cellule adulte differenziate di nuovo in uno stato simile all'embrione. Queste cellule staminali risultanti, denominate cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) condividono molte caratteristiche delle cellule staminali embrionali (ESC), inclusa la pluripotenza.

La generazione di iPSC ha completamente cambiato il panorama della modellazione delle malattie, consentendo di ottenere una fonte illimitata di tipi cellulari umani da pazienti con background genetici specifici della malattia. Differenziando queste cellule in specifici tipi cellulari rilevanti per particolari malattie, è diventato possibile generare modelli di malattia in vitro, che a livello cellulare riflettono più accuratamente la malattia umana. Questo approccio ha aperto la strada alla generazione di modelli di malattie in vitro sempre più complessi ed è stato particolarmente vantaggioso per la modellazione di malattie neurodegenerative, poiché è quasi impossibile ottenere sottotipi neuronali specifici umani, differenziati in modo terminale con altri mezzi. Ora esiste tutta una serie di protocolli di differenziazione per derivare tipi cellulari specifici dalle iPSC dei pazienti. Gli esempi chiave includono; Neuroni iPSC-dopaminergici per il morbo di Parkinson, neuroni iPSC-corticali per il morbo di Alzheimer e motoneuroni iPSC spinali per la sclerosi laterale amiotrofica. I modelli di malattia in vitro bidimensionali possono arrivare solo così lontano nella ricapitolazione delle malattie umane, poiché le cellule nel corpo umano non esistono isolatamente. Inoltre, la maturazione delle iPSC in tipi cellulari adulti funzionalmente maturi si è spesso rivelata impegnativa in un ambiente di coltura tissutale 2D. Le tecnologie organoidi tridimensionali hanno offerto una soluzione innovativa a queste sfide, consentendo di far crescere interi sistemi di organi in miniatura in un piatto piuttosto che solo singoli tipi di cellule. Questi sono solitamente derivati ​​​​da iPSC o da biopsie tissutali che contengono popolazioni di cellule staminali adulte specifiche del tessuto. Gli organoidi possono ricapitolare notevolmente l'organizzazione cellulare di molti organi diversi. Esempi chiave includono organoidi renali in miniatura, organoidi cerebrali, organoidi del pancreas, organoidi intestinali e organoidi neuromuscolari. Questi sono stati particolarmente utili nella modellazione di malattie specifiche dell'organo in cui le interazioni cellulari svolgono un ruolo critico, come nel morbo di Crohn, nel rene policistico, nel morbo di Alzheimer ed il microambiente immunitario del tumore in varie forme di cancro. Inoltre, gli organoidi del cancro sono stati generati anche direttamente dalle biopsie dei pazienti oncologici, consentendo test personalizzati di diverse combinazioni chemioterapiche per ideare nuove strategie di trattamento.

Inoltre, le tecnologie body-on-chip hanno aperto le porte alla modellazione di malattie in cui i tipi cellulari interagenti costituiti da più sistemi di organi svolgono un ruolo importante nella patogenesi della malattia. Sviluppando dispositivi microfluidici compartimentati microfabbricati, è ora possibile far crescere più sistemi di organi in modo spazialmente separato che ricorda il corpo umano. Esempi chiave includono la modellazione della barriera ematoencefalica, la modellazione della connettività nervosa/muscolare periferica e la modellazione delle interazioni complesse delle cellule immunitarie. È anche in corso il lavoro per utilizzare questi approcci per generare interi modelli di malattia "su chip umano", in cui tutti i sistemi di organi vitali del corpo possono essere modellati simultaneamente.

 Screening composto

La traduzione di modelli in vitro derivati ​​da cellule staminali complesse in saggi fenotipici riproducibili su larga scala che consentono lo screening di migliaia di composti, è un passo fondamentale ma impegnativo nella scoperta di farmaci basati sulle cellule staminali. La differenziazione delle iPSC in tipi cellulari rilevanti per la malattia può spesso essere molto variabile tra le linee cellulari e gli esperimenti. Per ovviare a questo, molti gruppi hanno ora iniziato ad introdurre marcatori ordinabili per purificare i tipi cellulari desiderati. Questo può fare un'enorme differenza per gli schermi su larga scala in cui la riproducibilità è fondamentale. Un altro approccio è stato la conversione diretta del lignaggio in cui gli iPSC sono dotati di sistemi inducibili per programmarli direttamente dagli iPSC in un tipo di cellula desiderato. In alcuni casi questa conversione può essere vicina al 100% e ridurre la necessità di lunghi protocolli di differenziazione.

Con tali progressi nel miglioramento della riproducibilità, molti gruppi ed aziende stanno ora iniziando ad utilizzare saggi fenotipici basati su cellule staminali per attività di screening di farmaci primari su larga scala. Esempi di schermi fenotipici derivati ​​da cellule staminali su larga scala guidati da studi accademici includono; uno schermo di sopravvivenza del motoneurone ALS, uno schermo di crescita dei neuriti, un test del flusso di calcio nei neuroni sensoriali per modellare il dolore ed uno schermo di sviluppo vascolare ad alto rendimento. In effetti, anche molte delle principali aziende farmaceutiche e start-up biotecnologiche stanno facendo uso di saggi fenotipici derivati ​​dalle cellule staminali.

Identificazione del bersaglio

L'identificazione del bersaglio è il processo di identificazione di un bersaglio molecolare che ha il potenziale per essere modulato da un agente terapeutico. L'identificazione di nuovi bersagli farmacologici utilizzando le cellule staminali può avvenire attraverso diverse vie. I modelli di malattia basati sulle cellule staminali offrono a molti gruppi accademici un modo più rapido, più economico e spesso più accurato per studiare i nuovi meccanismi della malattia, con conseguente maggiore comprensione delle basi molecolari della malattia. Sulla base di ciò, sono state avviate numerose collaborazioni accademiche su larga scala per accumulare una vasta gamma di dati biomedici dagli iPSC. Un esempio chiave di ciò è la Human Induced Pluripotent Stem Cell Initiative, in cui i dati genomici, trascrittomici, proteomici e fenotipici sono stati raccolti da migliaia di linee iPSC sane ed associate a malattie. Questa piattaforma open source mira a fornire ai ricercatori una risorsa globale che può essere utilizzata per identificare nuovi bersagli molecolari specifici per malattie. Infine, come accennato, gli schermi fenotipici derivati ​​dalle cellule staminali offrono un metodo olistico ed empirico per identificare nuovi composti che ripristinano i fenotipi associati alla malattia. Utilizzando strategie di deconvoluzione a valle, è quindi possibile identificare nuovi bersagli molecolari per queste malattie. Questo approccio è particolarmente utile quando si cerca di identificare nuovi bersagli per malattie in cui il panorama meccanicistico non è completamente compreso.

Screening della tossicità

 Mentre i modelli basati sulle cellule staminali sono incredibilmente utili negli screening fenotipici della malattia in fase iniziale, le cellule staminali possono anche essere uno strumento incredibilmente utile per identificare gli effetti avversi fuori bersaglio di farmaci già in fase di sviluppo. L'identificazione di tali effetti all'inizio della orgnizzazione di sviluppo del farmaco può essere molto più conveniente rispetto all'identificazione di questi effetti successivamente negli studi sugli animali o, in alcuni casi, durante gli studi clinici. In effetti, ora ci sono diversi schermi di tossicità derivati ​​​​da cellule staminali che hanno dimostrato di funzionare, identificando gli effetti collaterali negativi di farmaci già disponibili. Questi includono schermi di tossicità cardiaca e schermi di tossicità epatica. Si spera che lo screening per la tossicità nelle prime fasi del processo di sviluppo del farmaco renda più facile riprogettare i composti per ridurne la tossicità.

Riepilogo

Le cellule staminali stanno rapidamente diventando uno strumento prezioso nel processo di scoperta di farmaci. Le cellule staminali offrono la notevole capacità di generare una fonte illimitata di tipi cellulari rilevanti per la malattia da cui identificare nuovi bersagli molecolari, eseguire screening fenotipici su larga scala ed anche identificare tossicità fuori bersaglio.

Da:

https://547446.fs1.hubspotusercontent-na1.net/hubfs/547446/Technology%20Networks/Re-Purposing%20Content/Cell%20Culture/49951_TN_StemCellDrugDiscovery_AMV.pdf?utm_source=Thank+you+Page&utm_medium=Website&utm_campaign=Article+Links