AUTOMATING NEXT-GENERATION SEQUENCING WORKFLOWS / AUTOMATIZZAZIONE DEI FLUSSI DI LAVORO DI SEQUENZA DI NUOVA GENERAZIONE

 AUTOMATING NEXT-GENERATION SEQUENCING WORKFLOWS / AUTOMATIZZAZIONE DEI FLUSSI DI LAVORO DI SEQUENZA DI NUOVA GENERAZIONE

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

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Automate next-generation sequencing (NGS) sample prep workflows on the AVENIO Edge System, Roche’s fully automated solution for NGS sample prep. Greatly reduce the complexity of automation for users at any level, and achieve a true walk-away experience. 

TRANSFORMING GENOMICS WITH NEXT-GENERATION SEQUENCING

"Progress in science depends on new techniques, new discoveries, and new ideas, probably in that order,” said Sydney Brenner, the Nobel Prize winning molecular biologist. Technological advancements in sequencing methodologies brought a seismic change in biological research. Compared to the first human genome sequencing effort, the number and scope of sequencing applications from research to clinical diagnostics have increased exponentially in the last decade because of constantly dropping sequencing costs. By 2020, researchers worldwide sequenced over 1 million human genomes and the genomes of numerous plant and animal species. Today, whole-genome, whole-exome and RNA sequencing are routine methodologies in academic and clinical laboratories. Two technologies, Sanger sequencing and next-generation sequencing (NGS), are at the forefront of genome sequencing. Both methods employ a DNA polymerase and fluorescently-tagged nucleotides for DNA template strand replication. As nucleotides incorporate into the new DNA strand one by one, the fluorescent tags identify each base, allowing researchers to read the source DNA’s sequence. However, Sanger sequencing and NGS differ in scale and sequence processing. In the Sanger method, researchers sequence only one small genome fragment per reaction, whereas NGS allows them to sequence millions of DNA fragments simultaneously in a single run, making NGS the preferred sequencing application in whole-genome, whole-exome, and single-cell RNA sequencing. NGS also makes deep sequencing possible, where researchers sequence a single genomic region thousands of times to ensure accuracy, generate quantitative data, and uncover novel or rare variants. 

The Basics of Next-Generation Sequencing 

The NGS workflow begins with nucleic acid extraction and ends with sequencing and bioinformatics analysis. Once researchers extract and quantify DNA or RNA from cells or tissues, they move on to library preparation. The main steps in nucleic acid library preparation for NGS are fragmenting appropriate lengths of DNA from sample nucleic acids, generating double-stranded DNA copies, attaching adapter oligos to the target fragments, and quality control of the final library. 

Fragmentation: Researchers fragment nucleic acids into short sequences to obtain high-fidelity reads. In most RNAseq library preparation workflows, RNA is first fragmented and then converted into cDNA before library generation. Modern technologies use several physical, enzymatic, and chemical approaches to obtain sequencing libraries consisting of DNA fragments of defined lengths. Physical methods such as acoustic shearing and sonication, or enzyme cocktails of endonucleases and transposases, are popular fragmentation practices that generate DNA fragments from 100-5,000 bp. In cases of low yield, researchers then amplify these DNA fragments to generate thousands of copies. Researchers optimize this process depending on the desired fragment length for specific downstream applications.

 Library preparation: Library DNA fragments are flanked by oligonucleotide adapters and barcodes (indices) at their 5’ and 3’ ends. By amplifying fragments and placing them as inserts between adapters, researchers obtain ideal library size, which is the sum of the number of fragments across all genes. The ideal library size depends on the downstream applications and vary according to insert size, where shorter inserts amplify more efficiently than longer inserts, but longer inserts generate more data in a single run. 

Quality Control: To obtain high-quality sequencing results, each processing step requires rigorous quality control measures. Unbound adapters often self-anneal without a library insert sequence between them, forming dimers. They exhaust valuable space and reagents in sequencing workflows without generating any useful data. In an important post-library construction quality control step, researchers use either magnetic beads or agarose gels to remove the adapter dimers.

 Automation in NGS Library Preparation

 As the number of sequencing experiments increases, more laboratory managers set up in-house library preparation facilities. Automated instruments make NGS workflows more efficient and error-free. One example is the AVENIO Edge System, an automated NGS library preparation instrument that is designed to optimize reagents, resources, laboratory space, and staff personnel. With all the necessary hardware such as a thermal cycler, robotic liquid handlers, and supply loading decks housed in a single unit, the system streamlines library preparation, minimizing human errors and the time required for manual tasks. Fully barcoded reagents and consumables are automatically loaded and calculated, requiring minimal training or knowledge of the system. The AVENIO Edge System saves time and resources needed to deal with multiple instrument vendors in manual NGS workflows.

ITALIANO

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Automatizza i flussi di lavoro di preparazione dei campioni di sequenziamento di nuova generazione (NGS) su AVENIO Edge System, la soluzione completamente automatizzata di Roche per la preparazione dei campioni NGS. Riduci notevolmente la complessità dell'automazione per gli utenti a qualsiasi livello ed ottieni una vera esperienza walk-away.

TRASFORMARE LA GENOMICA CON IL SEQUENZIAMENTO DI PROSSIMA GENERAZIONE

"Il progresso nella scienza dipende da nuove tecniche, nuove scoperte e nuove idee, probabilmente in quest'ordine", ha affermato Sydney Brenner, biologa molecolare vincitrice del Premio Nobel. I progressi tecnologici nelle metodologie di sequenziamento hanno portato un cambiamento epocale nella ricerca biologica.

Rispetto al primo sforzo di sequenziamento del genoma umano, il numero e la portata delle applicazioni di sequenziamento dalla ricerca alla diagnostica clinica sono aumentati in modo esponenziale nell'ultimo decennio a causa del costante calo dei costi di sequenziamento.Entro il 2020, i ricercatori di tutto il mondo hanno sequenziato oltre 1 milione di genomi umani ed i genomi di numerose piante e specie di animali. Oggi, il sequenziamento dell'intero genoma, dell'intero esoma e dell'RNA sono metodologie di routine nei laboratori accademici e clinici. Due tecnologie, il sequenziamento di Sanger e il sequenziamento di nuova generazione (NGS), sono all'avanguardia nel sequenziamento del genoma. Entrambi i metodi utilizzano un DNA polimerasi e nucleotidi marcati con fluorescenza per la replicazione del filamento del modello di DNA Come nucleotidi incorporati nel nuovo filamento di DNA uno per uno, i tag fluorescenti identificano ciascuna base, consentendo ai ricercatori di leggere la sequenza del DNA di origine. Tuttavia, il sequenziamento di Sanger e l'NGS differiscono nell'elaborazione della scala e della sequenza. Nel metodo Sanger, i ricercatori sequenziano solo un piccolo frammento di genoma per reazione, mentre NGS consente loro di sequenziare milioni di frammenti di DNA contemporaneamente in una singola corsa, rendendo NGS l'applicazione di sequenziamento preferita nell'intero genoma, nell'intero esoma e nella singola cellula

 Sequenziamento dell'RNA.

 NGS rende anche possibile il sequenziamento profondo, in cui i ricercatori sequenziano una singola regione genomica migliaia di volte per garantire l'accuratezza, generare dati quantitativi e scoprire varianti nuove o rare.

Le basi del sequenziamento di nuova generazione 

Il flusso di lavoro NGS inizia con l'estrazione dell'acido nucleico e termina con il sequenziamento e l'analisi bioinformatica. Una volta che i ricercatori estraggono e quantificano il DNA o l'RNA dalle cellule o dai tessuti, passano alla preparazione della libreria. I passaggi principali nella preparazione della libreria di acidi nucleici per NGS sono la frammentazione di lunghezze appropriate di DNA dagli acidi nucleici del campione, la generazione di copie di DNA a doppio filamento, il collegamento di oligo adattatori ai frammenti target ed il controllo di qualità della libreria finale.

Frammentazione: i ricercatori frammentano gli acidi nucleici in brevi sequenze per ottenere letture ad alta fedeltà. Nella maggior parte dei flussi di lavoro di preparazione delle librerie RNAseq, l'RNA viene prima frammentato e quindi convertito in cDNA prima della generazione delle librerie. Le moderne tecnologie utilizzano diversi approcci fisici, enzimatici e chimici per ottenere librerie di sequenziamento costituite da frammenti di DNA di lunghezze definite. Metodi fisici come taglio acustico e sonicazione, o cocktail enzimatici di endonucleasi e trasposasi, sono pratiche di frammentazione popolari che generano frammenti di DNA da 100 a 5.000 bp. In caso di bassa resa, i ricercatori amplificano quindi questi frammenti di DNA per generare migliaia di copie. I ricercatori ottimizzano questo processo in base alla lunghezza del frammento desiderata per specifiche applicazioni a valle.

 Preparazione della libreria: i frammenti di DNA della libreria sono fiancheggiati da adattatori oligonucleotidici e codici a barre (indici) alle estremità 5' e 3'. Amplificando i frammenti e posizionandoli come inserti tra gli adattatori, i ricercatori ottengono la dimensione ideale della libreria, che è la somma del numero di frammenti in tutti i geni. La dimensione ideale della libreria dipende dalle applicazioni a valle e varia in base alla dimensione dell'inserto, dove gli inserti più corti amplificano in modo più efficiente rispetto agli inserti più lunghi, ma gli inserti più lunghi generano più dati in una singola analisi.

Controllo di qualità: per ottenere risultati di sequenziamento di alta qualità, ogni fase di elaborazione richiede rigorose misure di controllo della qualità. Gli adattatori non legati spesso si ricottono automaticamente senza una sequenza di inserimento di libreria tra di loro, formando dimeri. Esauriscono spazio e reagenti preziosi nei flussi di lavoro di sequenziamento senza generare dati utili. In un'importante fase di controllo della qualità della costruzione post-biblioteca, i ricercatori utilizzano sfere magnetiche o gel di agarosio per rimuovere i dimeri dell'adattatore.

 Automazione nella preparazione della libreria NGS

Con l'aumentare del numero di esperimenti di sequenziamento, sempre più responsabili di laboratorio istituiscono strutture interne per la preparazione delle biblioteche. Gli strumenti automatizzati rendono i flussi di lavoro NGS più efficienti e privi di errori. Un esempio è AVENIO Edge System, uno strumento automatizzato per la preparazione delle librerie NGS progettato per ottimizzare i reagenti, le risorse, lo spazio di laboratorio e il personale. Con tutto l'hardware necessario, come un termociclatore, manipolatori robotici di liquidi e piani di caricamento delle forniture alloggiati in una singola unità, il sistema semplifica la preparazione delle librerie, riducendo al minimo gli errori umani e il tempo necessario per le attività manuali. I reagenti ed i materiali di consumo completamente codificati a barre vengono caricati e calcolati automaticamente, richiedendo una formazione o una conoscenza minima del sistema. AVENIO Edge System consente di risparmiare tempo e risorse necessarie per gestire più fornitori di strumenti nei flussi di lavoro NGS manuali.

Da:

https://offers.the-scientist.com/hubfs/TS_PPL_Roche_NGS%20Workflow_Custom%20eBook_405054/TS_Roche_NGS_Automation_eBook_JL_final.pdf?_ga=2.11562547.662072449.1669067190-47781878.1664043971