Cell counting accuracy and precision / Accuratezza e precisione del conteggio cellulare

Cell counting accuracy and precision. The process of the ENEA patent RM2012A000637 is very useful in this type of application./ Accuratezza e precisione del conteggio cellulare. Il procedimento del brevetto ENEA RM2012A000637 è molto utile in questo tiopo dio applicazione.

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Figure 1. Comparison of cell counts performed with Invitrogen™ Countess™ II and Countess 3 cell counters using the default instrument settings. (A) A significant number of small particulates were counted using the Countess II instrument, so gating was required to remove them. (B) The small particulates were avoided using the Countess 3 instrument, and gating was not required. (C) Red arrows denote small particulates commonly observed in samples from primary cells and particulates due to precipitation of samples from trypan blue solution. / Confronto dei conteggi cellulari eseguiti con i contatori cellulari Invitrogen™ Countess™ II e Countess 3 utilizzando le impostazioni predefinite dello strumento. (A) Un numero significativo di piccoli particolati è stato contato utilizzando lo strumento Countess II, quindi è stato necessario il gating per rimuoverli. (B) I piccoli particolati sono stati evitati utilizzando lo strumento Countess 3 e non è stato richiesto il gating. (C) Le frecce rosse indicano piccoli particolati comunemente osservati nei campioni di cellule primarie e particolati a causa della precipitazione di campioni dalla soluzione blu tripan.

Why it matters and how to achieve it

Introduction

Cell counting is a cornerstone of cell biology and related research today, whether a scientist is simply splitting cells as a part of routine cell culture or preparing cell samples for experiments downstream. Accurate cell counting and cell viability can be accomplished with a variety of methods that range from manual cell counting with a hemocytometer and microscope to using complex instrumentation like flow cytometers. There are many other automated cell counting options, including Invitrogen™ Countess™ 3 and Countess™ 3 FL Automated Cell Counters. 

Sample preparation 

Accurate counting starts with a solid foundation in sample preparation. Optimal sample preparation can be broken down into two phases. In the first phase, steps are required to create the sample of interest, typically in a larger volume to be further processed for downstream purposes. In the second phase, the steps from the first phase are performed to create the counting sample. These steps can vary significantly depending on the sample source, which could be an immortalized suspension cell line, an adherent cell line, frozen stock, or a primary cell sample.

The first-phase steps are highly dependent on the sample type and downstream application, so they will not be included here. However, attention to detail in the preparation of counting samples can be critical. Below are the top three recommendations. 

• Create a homogenous cell suspension—Do not vortex cell samples. Mix gently but thoroughly by pipetting, inversion, or finger flicking immediately before removing an aliquot from the parent sample. Allowing a sample to settle prior to pipetting may result in the formation of a concentration gradient, potentially causing inconsistent counts. 

• Avoid debris introduction—Do not vortex trypan blue solution. It is notorious for containing small particulate matter, even when freshly opened. Such particulates will passively accumulate at the bottom of the tube, leaving most of the vial clean and ready for use if mixing and vortexing are avoided. Do not freeze trypan blue solution, as this will dramatically increase the amount of precipitate present.

 • Achieve a uniform focal plane—After mixing the cell sample (10 µL) and trypan blue solution (10 µL), pipette 10 µL of the stained cell suspension into the counting chamber. Allow it to settle for ~30 seconds to achieve a uniform focal plane. 

Instrument setup 

Whether you are using a Countess device, another automated cell counter, or a microscope and a hemocytometer, instrument setup is critical in order to realize accurate and consistent counts. Below are the top three instrument settings to consider to achieve accurate counts.It demonstrates two of the three critical instrument settings that are required for accurate and precise counts. 

• Uniform, consistent lighting 

• Correct focus 

• Consistent gating (not possible with manual counting)

When using a Countess 3 or Countess 3 FL instrument, we recommend selecting the default instrument profile, as this ensures all gating settings are maximized at the beginning of cell counting. Countess 3 and Countess 3 FL instruments are equipped with autofocus and auto-lighting features that optimize focus and lighting for each sample, thus removing variability that can negatively affect your counting result. It demonstrates uniform lighting and focus with human and mouse PBMC samples. These primary samples lack small particulates and other debris that are commonly found in PBMC preparations. With previous Invitrogen™ Countess™ instruments, it was commonly recommended that smaller objects be gated out to help minimize the effect of debris on count accuracy (Figure 1). Gating is largely unnecessary with Countess 3 and Countess 3 FL instruments due to the advanced focus and image analysis algorithms developed with artificial intelligence (AI). However, customers who want to tailor their count parameters can adjust various settings, including size, brightness, and circularity.

Key considerations 

When comparing cell counting methods and/or replicates, it is common to simply select the “correct” result without considering bias or accounting for the inherent error built into a method. In many cases, a single hemocytometer count is selected as the gold standard without statistical considerations. At the opposite end of cell counting complexity are flow cytometry methods. While they are extremely accurate, many do not realize that reagent titration is required for optimal flow cytometry results. 

Figure 2 demonstrates changing results due to reagent titration. This is an important example of how obtaining an accurate bright-field count with a Countess 3 instrument can have a dramatic downstream effect when using fluorescence flow cytometry. / La Figura 2 mostra i risultati variabili dovuti alla titolazione del reagente. Questo è un esempio importante di come l'ottenimento di un accurato conteggio del campo chiaro con uno strumento Countess 3 possa avere un notevole effetto a valle quando si utilizza la citometria a flusso di fluorescenza.

 A similar pattern can be observed in results obtained with samples that contain high or low amounts of debris. The benefit of image-based techniques is the direct sample feedback offered by the created images. Both novice and expert users can believe results obtained through direct observation.  Repeatable intersample and intra-sample counts were observed using the Countess 3 FL instrument. Each sample was drawn from the same stock of Jurkat cells, pipetted into a chamber slide, and read four times on a Countess 3 FL instrument using the default instrument profile. Based on the data, remarkable consistency was observed between replicate counts. Overall agreement between separately pipetted samples was achieved by following the recommendations outlined. If sample preparation was inconsistent,  Figure 2. Suboptimal dye vs. cell concentration examples as shown by flow cytometry. Different concentrations of live Jurkat cells were labeled with a constant concentration (10 μM) of Invitrogen™ Vybrant™ DyeCycle™ Orange Stain. Using the same concentration of stain produced poor cell cycle histograms for both low and high cell concentrations. Staining with the optimal cell concentration of 1 x 106 cells/mL gave the optimal cell cycle histogram at the same dye concentration. significant differences would be observed between samples 1 and 2. If instrument focus, lighting, or gating was inconsistent between sample or count replicates, the coefficient of variation (CV, %) would be significantly higher. 

Summary

 Regardless of the downstream application, obtaining an accurate and precise cell count is critical. Incorrect cell counts can easily lead to suboptimal culture conditions in simple cell-splitting applications or failed experiments due to incorrect labeling of titration reagents in flow cytometry or imaging applications. Today’s automated cell counters allow scientists to count cell samples more quickly and easily than ever before due to significant advances in hardware and software technologies and AI-based image analysis. However, a steady hand and solid sample preparation practices can be the difference between success and failure.

ITALIANO

Perché è importante e come ottenerlo

Introduzione

Il conteggio delle cellule è una pietra miliare della biologia cellulare e della ricerca correlata oggi, sia che uno scienziato stia semplicemente dividendo le cellule come parte della coltura cellulare di routine o preparando campioni di cellule per esperimenti a valle. Il conteggio e la vitalità cellulare accurati possono essere ottenuti con una varietà di metodi che vanno dal conteggio manuale delle cellule con un emocitometro e un microscopio all'utilizzo di strumentazione complessa come i citometri a flusso. Esistono molte altre opzioni di conteggio cellulare automatizzato, tra cui i contaglobuli automatici Invitrogen™ Countess™ 3 e Countess™ 3 FL.

Preparazione del campione

Un conteggio accurato inizia con una solida base nella preparazione del campione. La preparazione ottimale del campione può essere suddivisa in due fasi. Nella prima fase, sono necessarie fasi per creare il campione di interesse, tipicamente in un volume maggiore da elaborare ulteriormente per scopi a valle. Nella seconda fase, vengono eseguiti i passaggi della prima fase per creare il campione di conteggio. Questi passaggi possono variare in modo significativo a seconda della fonte del campione, che potrebbe essere una linea cellulare di sospensione immortalata, una linea cellulare aderente, stock congelato od un campione di cellule primarie.

I passaggi della prima fase dipendono fortemente dal tipo di campione e dall'applicazione a valle, quindi non saranno inclusi qui. Tuttavia, l'attenzione ai dettagli nella preparazione del conteggio dei campioni può essere fondamentale.

 Di seguito sono riportati i primi tre consigli.

• Creare una sospensione cellulare omogenea: non agitare i campioni di cellule su vortex. Miscelare delicatamente ma accuratamente pipettando, capovolgendo o muovendo le dita immediatamente prima di prelevare un'aliquota dal campione originario. Se si consente a un campione di depositarsi prima del pipettaggio, si può verificare la formazione di un gradiente di concentrazione, che potrebbe causare conteggi incoerenti.

• Evitare l'introduzione di detriti: non agitare con vortex la soluzione trypan blue. È noto per contenere piccole particelle, anche se appena aperto. Tali particelle si accumuleranno passivamente sul fondo della provetta, lasciando la maggior parte della fiala pulita e pronta per l'uso se si evita la miscelazione e il vortex. Non congelare la soluzione blu tripan, in quanto ciò aumenterà notevolmente la quantità di precipitato presente.

  • Ottenere un piano focale uniforme: dopo aver miscelato il campione di cellule (10 µL) e la soluzione di tripan blu (10 µL), pipettare 10 µL della sospensione cellulare colorata nella camera di conteggio. Lasciare riposare per circa 30 secondi per ottenere un piano focale uniforme.

Configurazione dello strumento

Sia che si utilizzi un dispositivo Countess, un altro contacellule automatizzato o un microscopio ed un emocitometro, l'impostazione dello strumento è fondamentale per ottenere conte accurate e coerenti. Di seguito sono riportate le prime tre impostazioni dello strumento da considerare per ottenere conteggi accurati. Dimostra due delle tre impostazioni critiche dello strumento necessarie per conteggi accurati e precisi.

• Illuminazione uniforme e uniforme

• Messa a fuoco corretta

• Gating coerente (non possibile con il conteggio manuale)

Quando si utilizza uno strumento Countess 3 o Countess 3 FL, si consiglia di selezionare il profilo dello strumento predefinito, in quanto ciò garantisce che tutte le impostazioni di gating siano massimizzate all'inizio del conteggio delle celle. Gli strumenti Countess 3 e Countess 3 FL sono dotati di funzioni di messa a fuoco automatica e illuminazione automatica che ottimizzano la messa a fuoco e l'illuminazione per ciascun campione, eliminando così la variabilità che può influire negativamente sul risultato del conteggio.  Viene mostrato un'illuminazione ed una messa a fuoco uniformi con campioni PBMC umani e di topo. Questi campioni primari mancano di piccole particelle ed altri detriti che si trovano comunemente nelle preparazioni PBMC. Con i precedenti strumenti Invitrogen™ Countess™, si consigliava comunemente di separare gli oggetti più piccoli per ridurre al minimo l'effetto dei detriti sull'accuratezza del conteggio (Figura 1). Il gating è in gran parte superfluo con gli strumenti Countess 3 e Countess 3 FL a causa della messa a fuoco avanzata e degli algoritmi di analisi delle immagini sviluppati con l'intelligenza artificiale (AI). Tuttavia, i clienti che desiderano personalizzare i propri parametri di conteggio possono regolare varie impostazioni, tra cui dimensioni, luminosità e circolarità.

Considerazioni chiave

Quando si confrontano i metodi di conteggio delle cellule e/o le repliche, è comune selezionare semplicemente il risultato "corretto" senza considerare il bias o tenere conto dell'errore intrinseco incorporato in un metodo. In molti casi, un singolo conteggio dell'emocitometro viene selezionato come gold standard senza considerazioni statistiche. All'estremità opposta della complessità del conteggio cellulare ci sono i metodi di citometria a flusso. Sebbene siano estremamente accurati, molti non si rendono conto che la titolazione del reagente è necessaria per ottenere risultati ottimali di citometria a flusso.

Un modello simile può essere osservato nei risultati ottenuti con campioni che contengono quantità elevate o basse di detriti. Il vantaggio delle tecniche basate su immagini è il feedback diretto del campione offerto dalle immagini create. Sia gli utenti inesperti che quelli esperti possono credere ai risultati ottenuti attraverso l'osservazione diretta. Come mostrato sono stati osservati conteggi intercampione e intra-campione ripetibili utilizzando lo strumento Countess 3 FL. Ciascun campione è stato prelevato dallo stesso stock di cellule Jurkat, pipettato in un vetrino a camera e letto quattro volte su uno strumento Countess 3 FL utilizzando il profilo dello strumento predefinito. Sulla base dei dati, è stata osservata una notevole coerenza tra i conteggi replicati. L'accordo generale tra i campioni pipettati separatamente è stato raggiunto seguendo le raccomandazioni delineate. Se la preparazione del campione era incoerente, Figura 2. Esempi di colorante subottimale rispetto alla concentrazione cellulare come mostrato dalla citometria a flusso. Differenti concentrazioni di cellule Jurkat vive sono state marcate con una concentrazione costante (10 μM) di Invitrogen™ Vybrant™ DyeCycle™ Orange Stain. L'utilizzo della stessa concentrazione di colorante ha prodotto istogrammi del ciclo cellulare scadenti sia per le concentrazioni cellulari basse che per quelle alte. La colorazione con la concentrazione cellulare ottimale di 1 x 106 cellule/mL ha fornito l'istogramma del ciclo cellulare ottimale alla stessa concentrazione di colorante. si osserverebbero differenze significative tra i campioni 1 e 2. Se la messa a fuoco, l'illuminazione o il gating dello strumento non fosse coerente tra i replicati del campione o del conteggio, il coefficiente di variazione (CV, %) sarebbe significativamente più alto.

Riepilogo

Indipendentemente dall'applicazione a valle, ottenere un conteggio cellulare accurato e preciso è fondamentale. Conteggi errati delle cellule possono facilmente portare a condizioni di coltura subottimali in semplici applicazioni di divisione cellulare o esperimenti falliti a causa di un'etichettatura errata dei reagenti di titolazione nella citometria a flusso o nelle applicazioni di imaging. I contatori di cellule automatizzati di oggi consentono agli scienziati di contare i campioni di cellule più rapidamente e facilmente che mai grazie ai significativi progressi nelle tecnologie hardware e software e all'analisi delle immagini basata sull'intelligenza artificiale. Tuttavia, una mano ferma e solide pratiche di preparazione del campione possono fare la differenza tra successo e fallimento.

Da:

https://547446.fs1.hubspotusercontent-na1.net/hubfs/547446/Technology%20Networks/Landing%20Pages/Thermo/Rennae/PG2370-PJT7643-COL25000-Countess-Cell-Counting-Accuracy-WhitePaper-Global-FHR.pdf?__hstc=8807082.f3ddaa81584799eacca500769af88bed.1664789177252.1673973908537.1674324023881.33&__hssc=8807082.2.1674324023881&__hsfp=1257453241&hsCtaTracking=7245102a-0e44-41b5-872f-fffa9bcb09ae%7Cb2bc50bb-5641-4efb-abc7-62263ee4ee81