THE IMPORTANCE OF VECTOR COPY NUMBER IN CAR T-CELL THERAPY QUALITY CONTROL / L'IMPORTANZA DEL NUMERO DI COPIA DEL VETTORE NEL CONTROLLO DI QUALITÀ DELLA TERAPIA CAR T-CELL

THE IMPORTANCE OF VECTOR COPY NUMBER IN CAR T-CELL THERAPY QUALITY CONTROL / L'IMPORTANZA DEL NUMERO DI COPIA DEL VETTORE NEL CONTROLLO DI QUALITÀ DELLA TERAPIA CAR T-CELL

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Gene and cell therapies are pioneering treatments where patients receive engineered, functionaltering cells to treat genetic diseases and cancer. For gene therapy, therapeutic genetic material is introduced into a patient, whereas for cell therapy, scientists often genetically alter and then multiply cells in a petri dish prior to administering them to a patient. These strategies gave birth to Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy, and researchers now extend them to other cells, such as Natural Killer (NK) cells, to treat diseases other than cancer. When using a viral vector to manufacture CAR T-cell therapies there is an inherent risk of adverse effects. Measuring the vector copy number with high accuracy and precision is crucial to ensure safety. Additionally, it is necessary to accurately quantify CAR transgene copy number in a batch of transduced T-cells. High accuracy and precision of vector copy number promotes safety and efficacy in CAR T-cell therapy production.

Common Cell and Gene Therapy Workflows 

Viral vectors such as lentiviruses (LVs) and adeno-associated viruses (AAVs) are common gene delivery vehicles. LVs and AAVs are single-stranded nucleic acid viruses whose genomes are encased in protein coats called capsids. Vector assembly for gene therapies takes place in cell lines that express plasmids containing viral coat genes and transgenes of interest. Researchers first purify vector particles and remove impurities such as host cell DNA and mycoplasma. Once they purify LV or AAV particles, they test for their transgene’s presence in the vector and determine the viral concentration as vector genomes per milliliter to establish the correct therapeutic dose. CAR T-cells are cell therapy products typically used against cancer. A patient’s T cells are collected from the blood and modified in vitro to produce surface CARs that mediate cancer cell destruction. Throughout the CAR T development process, researchers employ tools to measure viral vector infectivity, potency titer, vector copy number, and impurities. In cell culture, LVs deliver CAR-encoding transgenes into the T-cell genome. The number of transgene copies that integrate into a cell’s genome determines T-cell potency in preclinical trials. While achieving a high copy number makes CAR T-cell treatment more effective, having too many transgenes increases the risk of toxicity because they can integrate into nearby oncogenes. Therefore, determining transgene copy numbers and selecting cells with transgene copy numbers in the safe but effective range is critical for CAR T-cell product development. ddPCR: A Quality Control Tool Many researchers use quantitative PCR (qPCR) for gene and cell therapy vector characterization, such as viral genome concentration quantification and in vivo monitoring in preclinical mouse models. However, qPCRs leave a lot to be desired because they only provide relative transcript quantification. Moreover, to perform this quantification, researchers need to establish a standard curve that could exhaust precious samples. In recent years, many gene and cell therapy researchers pivoted towards 

Droplet Digital PCR (ddPCR) for mRNA quantitation. 

ddPCR measures absolute transcript levels, reducing measurement variability up to sevenfold compared to qPCR. In ddPCR, a sample is partitioned into thousands of nanoliter size droplets where each droplet serves as an individual unit for product amplification. Then, amplified copies are analyzed at the end of the reaction, allowing researchers to quantify absolute levels of viral vector genomes with higher sensitivity. Determining viral copy numbers is a key quality control step for scientists to decide safe and efficient therapeutic dosages. In a recent study, researchers used ddPCR to measure LV copy numbers per genome integrated into host cells after transduction. The researchers reliably determined the number of genomeintegrated LV copies per endogenous human genomic DNA. Their results demonstrated ddPCR’s ability to efficiently verify the yield in mediumscale LV production for ex vivo transduction gene therapy protocols.

 Reproducibility in CAR T Product Monitoring 

To assess ddPCR’s potential for measuring vector integration efficiency in T cells and determining CAR T-cell dosage, researchers measured integrated transgene copy numbers at various time points and across different laboratories. They also evaluated the effects of various manufacturing protocols on ddPCR’s accuracy in determining transgene copy numbers. The researchers reproducibly measured empty vector concentrations and average CAR vector copy numbers integrated into T-cell genomes. Additionally, ddPCR yielded similar results for both newlygenerated and cryopreserved CAR T samples. Together, ddPCR allows researchers to monitor vector quality, quantity, and copy number in gene and cell therapy applications.

ITALIANO

Le terapie geniche e cellulari sono trattamenti pionieristici in cui i pazienti ricevono cellule ingegnerizzate e funzionanti per curare malattie genetiche e cancro. Per la terapia genica, il materiale genetico terapeutico viene introdotto in un paziente, mentre per la terapia cellulare, gli scienziati spesso alterano geneticamente e quindi moltiplicano le cellule in una capsula di Petri prima di somministrarle ad un paziente. Queste strategie hanno dato vita alla terapia con cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR) ed i ricercatori ora le estendono ad altre cellule, come le cellule Natural Killer (NK), per trattare malattie diverse dal cancro. Quando si utilizza un vettore virale per produrre terapie con cellule CAR-T esiste un rischio intrinseco di effetti avversi. Misurare il numero di copie del vettore con elevata accuratezza e precisione è fondamentale per garantire la sicurezza. Inoltre, è necessario quantificare con precisione il numero di copie del transgene CAR in un lotto di cellule T trasdotte. L'elevata accuratezza e precisione del numero di copie del vettore promuove la sicurezza e l'efficacia nella produzione di terapia con cellule T CAR.

Flussi di lavoro comuni per la terapia genica e cellulare

I vettori virali come i lentivirus (LV) ed i virus adeno-associati (AAV) sono comuni veicoli di consegna genica. LV e AAV sono virus dell'acido nucleico a singolo filamento i cui genomi sono racchiusi in cappotti proteici chiamati capsidi. L'assemblaggio del vettore per le terapie geniche avviene in linee cellulari che esprimono plasmidi contenenti geni del rivestimento virale e transgeni di interesse. I ricercatori prima purificano le particelle del vettore e rimuovono le impurità come il DNA della cellula ospite ed il micoplasma. Dopo aver purificato le particelle LV o AAV, testano la presenza del loro transgene nel vettore e determinano la concentrazione virale come genoma del vettore per millilitro per stabilire la dose terapeutica corretta. Le cellule CAR-T sono prodotti di terapia cellulare tipicamente utilizzati contro il cancro. Le cellule T di un paziente vengono raccolte dal sangue e modificate in vitro per produrre CAR di superficie che mediano la distruzione delle cellule tumorali. Durante il processo di sviluppo di CAR T, i ricercatori impiegano strumenti per misurare l'infettività del vettore virale, il titolo di potenza, il numero di copie del vettore e le impurità. Nella coltura cellulare, i LV forniscono transgeni codificanti CAR nel genoma delle cellule T. Il numero di copie del transgene che si integrano nel genoma di una cellula determina la potenza delle cellule T negli studi preclinici. Mentre il raggiungimento di un numero elevato di copie rende più efficace il trattamento con cellule T CAR, avere troppi transgeni aumenta il rischio di tossicità perché possono integrarsi negli oncogeni vicini. Pertanto, determinare i numeri di copie del transgene e selezionare le cellule con numeri di copie del transgene nell'intervallo sicuro ma efficace è fondamentale per lo sviluppo del prodotto CAR T-cell. ddPCR: uno strumento di controllo della qualità Molti ricercatori utilizzano la PCR quantitativa (qPCR) per la caratterizzazione del vettore di terapia genica e cellulare, come la quantificazione della concentrazione del genoma virale e il monitoraggio in vivo in modelli murini preclinici. Tuttavia, i qPCR lasciano molto a desiderare perché forniscono solo una quantificazione relativa della trascrizione. Inoltre, per eseguire questa quantificazione, i ricercatori devono stabilire una curva standard che potrebbe esaurire campioni preziosi. Negli ultimi anni, molti ricercatori di terapia genica e cellulare si sono orientati verso Droplet Digital PCR (ddPCR) per la quantificazione dell'mRNA.

ddPCR misura i livelli assoluti del trascritto, riducendo la variabilità della misurazione fino a sette volte rispetto a qPCR. In ddPCR, un campione viene suddiviso in migliaia di goccioline di dimensioni nanolitri in cui ciascuna gocciolina funge da singola unità per l'amplificazione del prodotto. Quindi, le copie amplificate vengono analizzate al termine della reazione, consentendo ai ricercatori di quantificare i livelli assoluti dei genomi del vettore virale con una maggiore sensibilità. La determinazione del numero di copie virali è un passaggio chiave del controllo di qualità per gli scienziati per decidere dosaggi terapeutici sicuri ed efficienti. In uno studio recente, i ricercatori hanno utilizzato la ddPCR per misurare il numero di copie LV per genoma integrato nelle cellule ospiti dopo la trasduzione. I ricercatori hanno determinato in modo affidabile il numero di copie LV integrate nel genoma per DNA genomico umano endogeno. I loro risultati hanno dimostrato la capacità di ddPCR di verificare in modo efficiente la resa nella produzione di LV su media scala per i protocolli di terapia genica di trasduzione ex vivo.

Riproducibilità nel monitoraggio del prodotto CAR T

Per valutare il potenziale di ddPCR per misurare l'efficienza di integrazione del vettore nelle cellule T e determinare il dosaggio delle cellule T CAR, i ricercatori hanno misurato i numeri di copie del transgene integrato in vari punti temporali ed in diversi laboratori. Hanno anche valutato gli effetti di vari protocolli di produzione sull'accuratezza di ddPCR nel determinare i numeri di copie del transgene. I ricercatori hanno misurato in modo riproducibile le concentrazioni di vettore vuoto ed il numero medio di copie del vettore CAR integrato nei genomi delle cellule T. Inoltre, ddPCR ha prodotto risultati simili sia per i campioni CAR T di nuova generazione che per quelli criopreservati. Insieme, ddPCR consente ai ricercatori di monitorare la qualità, la quantità ed il numero di copie del vettore nelle applicazioni di terapia genica e cellulare.

Da:

https://offers.the-scientist.com/hubfs/TS_PPL_Bio-Rad%20EU_CAR%20T-Cell%20Therapy_eBook_403220/45745_TS_BioRad_EU_Cell_and_Gene_Therapy_eBOOK_JL_D9_(1)%20(1).pdf?_ga=2.25669821.181454198.1672584824-47781878.1664043971