Engineering T Cell Development for the Next Generation of Stem Cell-Derived Immunotherapies / Ingegneria dello sviluppo delle cellule T per la prossima generazione di immunoterapie derivate da cellule staminali

Engineering T Cell Development for the Next Generation of Stem Cell-Derived Immunotherapies / Ingegneria dello sviluppo delle cellule T per la prossima generazione di immunoterapie derivate da cellule staminali

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

 

FIG. 1. Using developmental biology to guide in vitro T cell differentiation. 

/(A) Top: Schematic outline of T cell development in the human thymus. Bottom: Relative importance of Notch and TCR signaling during T cell development.

(B) Feeder-based and chemically defined T cell differentiation protocols. PSC-derived CD34+ HE cells or HSPCs are cultured on immortalized stromal cells expressing Notch ligands to promote T cell differentiation in monolayer cultures. PSC-derived CD34+ HSPC cells are incorporated into spheroids with stromal cells expressing Notch ligands to promote T cell differentiation in artificial organoid cultures. In chemically defined stepwise differentiation protocols, PSC-derived CD34+ cells are cultured on plates coated with DLL4 and VCAM1, with different chemically defined media to induce EHT, Pro-T, and DP T cell development, respectively. DP cells are then exposed to nonspecific TCR stimulation to promote further maturation to the CD8SP stage. CD8SP, CD8 single positive; DP, double positive; EHT, endothelial to hematopoietic transition; HE, hemogenic endothelium; HSPC, hematopoietic stem and progenitor cell; PSC, pluripotent stem cell; TCR, T cell receptor; TSP, thymus-seeding progenitors.

FIG. 1. Utilizzo della biologia dello sviluppo per guidare la differenziazione delle cellule T in vitro .

(A) In alto: Schema  dello sviluppo delle cellule T nel timo umano. In basso: importanza relativa della segnalazione di Notch e TCR durante lo sviluppo delle cellule T.

(B)Protocolli di differenziazione delle cellule T basati sull'alimentatore e definiti chimicamente. Cellule CD34+ HE o HSPC derivate da PSC sono coltivate su cellule stromali immortalizzate che esprimono ligandi di Notch per promuovere la differenziazione delle cellule T nelle colture monostrato. Le cellule HSPC CD34+ derivate da PSC sono incorporate in sferoidi con cellule stromali che esprimono ligandi di Notch per promuovere la differenziazione delle cellule T nelle colture di organoidi artificiali. Nei protocolli di differenziazione graduale definiti chimicamente, le cellule CD34+ derivate da PSC vengono coltivate su piastre rivestite con DLL4 e VCAM1, con diversi supporti chimicamente definiti per indurre rispettivamente lo sviluppo di cellule EHT, Pro-T e DP T. Le cellule DP vengono quindi esposte a stimolazione TCR non specifica per promuovere un'ulteriore maturazione allo stadio CD8SP. CD8SP, CD8 singolo positivo; DP, doppio positivo; EHT, transizione endoteliale a emopoietica; LUI, endotelio emogeno; HSPC, cellula staminale e progenitrice ematopoietica; PSC, cellula staminale pluripotente; TCR, recettore delle cellule T; TSP, progenitori della semina del timo.

Abstract

Engineered T cells are at the leading edge of clinical cell therapy. T cell therapies have had a remarkable impact on patient care for a subset of hematological malignancies. This foundation has motivated the development of off-the-shelf engineered cell therapies for a broad range of devastating indications. Achieving this vision will require cost-effective manufacturing of precision cell products capable of addressing multiple process and clinical-design challenges. Pluripotent stem cell (PSC)-derived engineered T cells are emerging as a solution of choice. To unleash the full potential of PSC-derived T cell therapies, the field will require technologies capable of robustly orchestrating the complex series of time- and dose-dependent signaling events needed to recreate functional T cell development in the laboratory. In this article, we review the current state of allogenic T cell therapies, focusing on strategies to generate engineered lymphoid cells from PSCs. We highlight exciting recent progress in this field and outline timely opportunities for advancement with an emphasis on niche engineering and synthetic biology.

Introduction

For the past decade, there has been tremendous progress in treating cancer with cellular immunotherapies. In particular, chimeric antigen receptors (CARs) that redirect T cells to recognize CD19 or BCMA have shown remarkable efficacy against certain types of leukemia, lymphoma, and multiple myeloma. So far, six CAR-T therapies have been approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) since 2017, with several hundred more products at various stages of clinical development. CAR-T cells are also being explored for a multitude of nononcology indications, including transplant rejection, infection, autoimmunity, cardiovascular disease, fibrosis, and senescence.

Despite their impressive and expanding resume, several technical hurdles must be overcome before T cell therapies realize their full potential. Questions of safety, efficacy, antigen escape, and translation to solid tumors are important challenges that have been extensively reviewed elsewhere. Another major bottleneck is the manufacturing process itself. The predominant method of manufacturing T cell therapies today is to source T cells from the patient themselves, genetically engineer them to recognize malignant cells using bespoke viral transduction pipelines and infuse the modified cells back into the patient. This personalized manufacturing process adds significant cost and variability to T cell therapies. Building more robust, scalable, and reproducible manufacturing workflows for T cell therapies will help improve product safety and efficacy and will expand access to these lifesaving therapies.

In this review, we examine the current state of allogenic T cell therapies, paying particular attention on strategies to generate engineered lymphoid cells from pluripotent stem cells (PSCs). We also discuss recent progress in the field and consider opportunities for advancement, especially with regard to niche engineering and synthetic biology.

Challenges of autologous CAR-T therapies

Unlike small molecules and biologics, which are produced in scalable, controllable, and fully defined environments inside chemical or biological reactors (Domokos, Nagy, 2021), T cell therapy products are living medicines. Currently, for clinical use, T cell therapies are predominantly produced in single doses, sourcing the unmodified T cells from the patient themselves.

These autologous T cell therapies face several significant manufacturing challenges. One is cost. For allogenic products, each time a patient is prescribed CAR-T, a personalized multistep workflow is initiated. The patient donates peripheral blood and their T cells are isolated. Next, the T cells are stimulated ex vivo and begin to undergo massive expansion. Once the T cells have been activated, they are transduced with a viral vector comprising the CAR transgene. Finally, the CAR-T product undergoes release testing for quality assurance before being infused into the patient.

This entire workflow, including production of the CAR viral vectors, is carried out in compliance with good manufacturing practices. Because of this complex personalized production process, the price of CAR-T is remarkably high compared with other types of therapies, with one dose priced on the order of $500,000. Whether the benefits of CAR-T therapies to patients can justify their current price tag is difficult to quantify and a matter of ongoing debate. Not only do excessive costs limit the number of patients who are able to access currently approved therapies, but they also restrict the scope of future indications for which CAR-T cells are contemplated.

A second challenge is variability in product quality. This variability exists in multiple aspects. There is donor-to-donor variability in the number and quality of T cells available for producing the CAR-T product. Beyond the biological diversity that exists among individuals in the healthy population, this problem is exacerbated by the impact of cancer on a patient's T cell compartment. Radiation and chemotherapy, the first-line treatments for most cancers, diminish the number and functionality of a patient's T cells. Consequently, a meaningful percentage of patients are not able to produce a graft of good enough quality to proceed to infusion.

In addition to donor-to-donor variability, there is also heterogeneity within an individual graft. Depending on the specific manufacturing process, the isolated and expanded T cells comprise a mixture of T cell subtypes at various states of polarization and differentiation along the effector-memory axis. Furthermore, not all T cells in the graft will successfully be transduced with the CAR, leading to a mixture of modified and unmodified cells. Even among modified cells, the semirandom nature of retroviral vector integration leads to heterogeneity in expression level that impacts functionality and carries the risk that important loci are disrupted. As grafts comprise billions of cells, even rare oncogenic events must be considered.

Alternatives to autologous T cell therapies

Cost, variability, and product quality control are widely recognized barriers to expanding on the success of CAR-T therapy. Hereunder, we discuss how gene-edited CARs and allogeneic T cell products can partially address these challenges. We also explore the advantages and limitations of in vivo CAR transduction as a low-cost alternative to ex vivo manufacturing. We then make the case for PSC-derived T cell products as a compelling long-term solution for accessible high-performance immunotherapies.

One way to avoid the gene expression heterogeneity caused by semirandom viral integration is to target the CAR to a defined locus using precision gene editing such as CRISPR-Cas9. In a preclinical model of B cell leukemia, introducing a CD19 CAR into the T cell receptor alpha chain constant (TRAC) locus with CRISPR-Cas9 reduced both median CAR expression and expression variability compared with a virally engineered control. TRAC knock-in also significantly improved tumor clearance compared with virally modified controls. Virally introduced CARs are typically expressed at much higher levels than endogenous T cell receptors. High constitutive CAR expression can drive T cells into an exhausted state and impair their functionality In contrast, knocking a CAR into the TRAC locus leads to a more T cell receptor (TCR)-like expression level, mitigating exhaustion and improving efficacy.

Gene-edited CARs may provide a more consistent and effective product. However, further improvements are required. Although recent designer fusion proteins can improve CRISPR-Cas9 knock-in efficiencies, integration rates for large multikilobase payloads remain low in primary T cells. CRISPR is also prone to off-targets mutagenesis, meaning edited products will still comprise a mix of correctly modified, incorrectly modified, and unmodified cells. Precise editing workflows, especially ones that require both nucleofection and AAV homology donors will add cost to the manufacturing process, although this can be mitigated using nonviral editing. Gene-edited CAR-T cells will not solve the problem of intradonor heterogeneity.

Primary donor-derived allogeneic T cell therapies can partially address the challenge of donor–donor variability. By sourcing T cells from healthy donors, it is possible to circumvent the negative impact that cancer and cancer therapies have on a patient's T cell compartment. Although autologous CAR-T products often fail release testing. in recent trials of primary allogeneic CAR-T therapy, all enrolled patients were able to receive treatment—none were excluded because of poor-quality T cell products. Allogeneic therapies may also simplify the manufacturing process as cell therapy products can be cryopreserved and utilized on demand, reducing the time delay required for autologous production.

Despite their advantages, primary allogeneic therapies must overcome immunological barriers between the donor and recipient. Graft versus host reactivity is an important safety concern and avoidance of graft rejection to achieve a durable therapeutic benefit is an added challenge. Although healthy donors can provide a larger number of functional T cells compared with cancer patients, there is still sizable heterogeneity in T cell abundance and functionality across healthy individuals. Beyond the brief overview provided earlier, the advantages and limitations of primary allogeneic therapy are more thoroughly reviewed elsewhere.

Gene-edited T cells and allogeneic donors can theoretically reduce variability in CAR-T outcomes, but neither approach will eliminate the costly ex vivo T cell manufacturing process. A potential cost-saving solution is to perform a rapid ex vivo transduction step and allow the lengthy expansion process to occur within the patient. In one ongoing clinical trial of this approach, an extremely rapid ex vivo manufacturing step (∼2 days) has shown promising early results.

Beyond shortening and automating the CAR-T manufacturing processes, an elegant alternative is to eliminate the ex vivo cell therapy manufacturing step altogether by delivering the CAR to T cells within a patient's body. This has previously been achieved by infusing mice with CAR expression cassettes using delivery systems such as nanoparticles loaded with DNA or mRNA. or viral vectors. A recently proposed hybrid approach involves taking patient T cells, seeding them in an alginate scaffold along with viral particles and T cell activating reagents, and implanting the biomaterial back into the patient where the cells become transduced and expand in vivo. These in vivo and hybrid manufacturing processes should reduce costs, time, and labor associated with CAR-T manufacturing if they prove to be effective in humans. Nevertheless, these approaches carry additional risks, including the possibility of transducing off-target cell types.

Primary allogeneic CAR-T cells can help address product variability, and in vivo CAR delivery may reduce manufacturing costs. PSCs are an extremely attractive alternative approach because they can simultaneously address both challenges. Rather than obtaining T cells from individual donors, they can be differentiated from PSCs (PSC allogeneic CAR-T). PSCs are amenable to clonal expansion and unlimited self-renewal. This means CARs, or other therapeutic augmentations, can be easily be introduced at targeted loci through gene editing.

After rigorous quality control, clones that contain the desired modification and are free from off-target mutations and chromosomal abnormalities can be expanded at scale in bioreactors for subsequent in vitro differentiation into T cells. The resulting cell therapy product can be cryopreserved for on-demand off-the-shelf therapy. PSCs have the potential to serve as a low-cost source of high-quality clonally engineered T cell therapies. To realize this vision and enable large-scale manufacturing of T cells for therapy, researchers have worked to develop and improve PSC-to-T cell differentiation processes.

Efforts to Make PSC-Derived T Cells

PSC differentiation protocols are often designed using insights from embryogenesis; therefore, a thorough understanding of T cell development as it occurs in vivo is critical to the success of efforts to generate PSC-derived T cells. In this section, we briefly outline the process of T cell development, then highlight how our understanding of this process has shaped the development of in vitro T cell differentiation protocols. More comprehensive descriptions of T cell development and hematopoiesis can be found in several excellent reviews.

T cell development in vivo

All cells of the hematopoietic system are derived from a subset of mesoderm. During early embryogenesis, pluripotent cells ingress through a transient structure called the primitive streak, where they receive signals that prime them toward the hematopoietic lineage, forming the so-called hematopoietic mesoderm compartment. The hematopoietic mesoderm gives rise to at least two distinct waves of hematopoietic progenitors, which are distinguished in vivo based on where and when they emerge, as well as the differentiated cell types they produce. The “primitive” wave is the first to emerge, and is first detected at E7 in mouse and day 18.5 of gestation in human. Progenitors of the primitive wave are derived from “blood islands,” or clusters of hematopoietic and endothelial cells in the yolk sac. This early wave of hematopoiesis is transient, and gives rise to a small subset of hematopoietic cell types, including erythrocytes, megakaryocytes, and macrophages.

Importantly, the primitive waves do not produce any cells of the lymphoid lineage, including T cells. In contrast, the “definitive” wave of hematopoiesis emerges later in developmental time, at E11.5 in mouse and CS14 in human. Definitive hematopoietic progenitors are derived from endothelial cells with hematopoietic potential, or hemogenic endothelial (HE) cells, within the embryo proper, predominantly in the aorta-gonad-mesonephros region, which undergo endothelial to hematopoietic transition (EHT) to generate hematopoietic cells. In contrast to the apparently restricted potential of primitive progenitors, the definitive wave gives rise to hematopoietic stem cells (HSCs), or single cells that can reconstitute the entire blood system upon transplantation into a new host.

In recent years, the definitions of primitive versus definitive hematopoiesis have become blurred. For instance, studies in mouse have identified yolk sac-derived hematopoietic progenitors with lymphoid potential, and corresponding populations have been described in studies using human PSCs. In addition, intraembryonic hematopoiesis does not exclusively produce HSCs, as nonengrafting multipotent progenitors, as well as bi- and unipotent progenitors derived from the embryo proper before HSC emergence have been described by multiple independent groups. Although researchers have noted that certain T cell subsets are preferentially derived from progenitors that emerge before HSC development, functional differences between the T cells derived from yolk sac progenitors, intraembryonic progenitors, and HSCs have not yet been characterized.

Regardless of developmental origin, T-competent progenitors initially seed the thymus, the primary organ responsible for T cell development (Fig. 1A). The thymus is organized into various anatomical zones with distinct signaling environments; these different signals promote transition to successive developmental stages as T cell progenitors, or thymocytes, migrate through the thymus. The earliest thymus-seeding progenitors are termed double negative (DN), due to lack of expression of the co-receptors CD4 and CD8. When T-competent progenitors first enter the thymus, they retain the ability to produce myeloid and natural killer (NK) cells. Upon receiving Notch and IL-7 stimulation provided by the thymus, DN cells proliferate and upregulate CD7, CD5, then CD1a, marking the loss of their myeloid and NK differentiation potential.

After T-lineage commitment, DN cells proceed to the immature single positive (iSP) stage, characterized by upregulation of CD4. During this stage, thymocytes become biased toward one of two possible lineages: TCRαβ+ “conventional” T cells, or TCRγδ “innate-like” T cells. The majority of thymocytes will begin rearranging the TCRβ locus. Thymocytes that produce an in-frame TCRβ rearrangement will express a functional TCRβ protein, which complexes with a surrogate pre-TCRα protein and CD3 to form the pre-TCR complex. Thymocytes that fail to produce an in-frame TCRβ rearrangement are eliminated through a process termed beta selection. Although pre-TCR expression biases iSPs toward the αβ-T cell lineage, a small subset of iSPs productively rearrange the TCRγ and TCRδ loci, leading to expression of a functional γδ-TCR that initiates commitment to the γδ-T cell lineage. After pre-TCR expression, αβ-T cell precursors upregulate CD8 to become CD4+CD8+ “double positive” (DP) cells.

Before exiting the thymus cortex, DP thymocytes rearrange their TCRα locus to produce a mature TCRα gene, resulting in expression of the TCRαβ complex on their surface. Positive selection of thymocytes expressing TCRs that can bind with moderate affinity to self-peptide-human leukocyte antigen (HLA) complexes is critical for further differentiation, as nonreactive TCR clones are eliminated in the cortex through nonselection. During this selection process, DP thymocytes also select a CD8+ cytotoxic phenotype or a CD4+ helper phenotype based on whether the TCR interacts with HLA-I molecules through the CD8 co-receptor, or HLA-II molecules through the CD4 co-receptor. Next, thymocytes travel to the medulla, where clones expressing TCRs with highly reactivity to self-antigens are eliminated through negative selection.

Mature T cells exit the thymus and enter the circulation as naive T cells, where they scan throughout the body for their cognate antigen. When a naive CD4 or CD8 T cell encounters its target antigen, it undergoes rapid clonal expansion and differentiates into an effector phenotype. CD8 T cells differentiate into cytotoxic T lymphocytes (CTLs), which can directly kill cells presenting the target antigen. CD4 T cells differentiate into a range of “helper” phenotypes, which secrete subsets of cytokines to support the function of CTLs, as well as other innate immune cells. Once the initial infection is cleared, the majority of differentiated effector cells die; however, a subset of effector cells are maintained as memory T cells. Memory T cells are of particular clinical interest, as they are relatively long-lived, but can mount an immune response to their target antigen much more rapidly than a naive T cell.

Learning from human development to make T cells in vitro with stromal feeder cells

Motivated by therapeutic and research applications, scientists have long sought to recreate T cell development in vitro (Fig. 1B). Early attempts to differentiate T cells have focused on recapitulating key features of the thymus. Among the multitude of molecules produced in the thymus, Notch signals are crucial for T cell development and, in combination with the cytokines FLT3L and IL-7, are sufficient to support T cell development from primary hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) in vitro. Immortalized stromal cell lines engineered to express Notch ligands, such as OP9-DL1 and OP9-DL4 systems, have been used successfully for decades. Additional feeder-based systems have emerged in recent years, including the artificial thymic organoid (ATO) platform, which more accurately phenocopies some aspects of three-dimensional thymic structure.

These feeder-based protocols were originally developed and implemented with primary HSPCs, derived either from cord blood (CB) or bone marrow, as their starting material. But these human-donor-derived cell sources suffer similar limitations as primary T cells in terms of scale and intradonor variability. PSCs can theoretically provide a vastly more scalable, cheaper, and genetically consistent source of T cells. A long-standing goal has thus been to produce HSPCs with T lineage potential from PSCs as starting material.

As blood progenitors are derived from the mesoderm, the majority of established PSC-to-T cell differentiation protocols involve a mesoderm induction step. The first in vitro blood differentiation protocols tended to phenocopy the early yolk sac-derived primitive wave, and generated mixed populations that lacked robust T lineage potential. This is predominantly due to the addition of exogenous Activin A without Wnt supplementation during the mesoderm induction step, which promotes the development of primitive-biased mesoderm. By manipulating Wnt and activin/nodal signaling, multiple groups succeeded in generating so-called definitive HSPC-like cells with T lineage potential. These PSC-derived HSPCs could develop into mature T cells in vitro on stromal feeder layers.

Note that these cells still lack some key attributes of true HSCs as they have thus far failed to engraft and reconstitute immunodeficient mice without extensive genetic manipulation. This could reflect the fact that these cells more closely resemble an HSC-independent hematopoietic progenitor, or that they are similar to true HSCs but require further maturation in a fetal liver-like environment before they attain engraftment potential.

Despite the remaining hurdle of engraftment, protocol advances in both HSPC differentiation and T cell differentiation have had a profound impact across scientific disciplines. Not only have they served as powerful platforms for studying cellular development and modeling disease, but they also have demonstrated the feasibility of PSC-derived T cell immunotherapies. In a landmark study, Themeli et al. demonstrated that induced PSCs (iPSCs) reprogrammed from a T cell clone could be differentiated into cytotoxic CAR T cells in vitro. Although these PSC-derived T cells had functional properties more akin to γσ, as opposed to αβ-T cells, they were capable of eradicating CD19+ tumor cells in vitro and in a xenograft leukemia model.

Chemically defined T cell differentiation systems

Despite this exciting progress, the aforementioned PSC-to-T cell differentiation protocols all require animal derivatives, including serum, immortalized stroma, or basement-membranes extracted from tumor cultures. Undefined animal derivatives, including sera and extracts, introduce lot-to-lot variability, pose a risk of contamination, and mask the underlying signals that drive developmental processes. Furthermore, engineered stromal cell lines such as OP9-DL1 present a constant level of Notch ligand over time. These systems are not ideal for supporting differentiation processes where dynamic changes in signaling strength are required. Collectively these are significant barriers to clinical translation of xenogeneic differentiation processes.

To enable safer, tunable, and robust differentiation protocols, our group and others have focused on building chemically defined methods that avoid feeder cells, serum, and membrane extracts. A major milestone was hit in 2017 when Shukla et al. showed that primary human HSPCs derived from umbilical CB could be directed to become T cell progenitors using recombinant Notch ligands rather than OP9 stroma. Shukla et al. discovered that the cell adhesion molecule VCAM1 can be used to increase the strength of Notch signaling. Although immobilizing recombinant DLL4 alone to a culture surface was insufficient to promote T cell progenitor development, the addition of immobilized recombinant VCAM1 synergized with DLL4 to unlock T lineage differentiation potential. We subsequently extended this method to take CB-derived HSPCs all the way to mature T cell phenotypes using a multistage model-guided media optimization process.

The next key challenge was to extend these chemically defined differentiation protocols to make use of PSCs, rather than CB as starting material. In 2020, Motazedian et al. demonstrated differentiation of CD4+, CD8+ DP, and CD3- cells from iPSCs in feeder-free conditions using an air–liquid-interface culture system. These cells could subsequently mature into CD3+, TCR+ cells on OP9-DL4 cells. The cells produced in their culture system express the T-lineage associated recombinase gene surprisingly early in their development. The authors suggested that these cells represent an HSC-independent T cell progenitor that emerges directly from hemogenic endothelium.

Iriguchi et al. were the first group to differentiate PSCs all the way into mature T cells without the use of immortalized stroma. The authors reprogrammed iPSC lines from T cells and applied a modified version of previously established chemically defined blood differentiation process to make HSPCs. They transferred these HSPCs on to culture vessels coated with recombinant DLL4 and retronectin, a fragment of the fibronectin protein that can bind to a4b1, the same integrin that interacts with VCAM1. This process yielded CD8 single positive (CD8SP) cells that expressed the original TCR from the parent iPSC clone. Impressively, these cells were capable of expansion and produced effector cytokines in response to stimulation, demonstrating important functional properties of primary T cells. They were also capable of specifically killing target cells expressing the cognate peptide antigen of the TCR both in vitro and in vivo.

Although most of the results presented in the Iriguchi et al. study were generated using a serum-based media, the authors also reported a successful, although less efficient, serum-free process. This study is an important milestone for clinical translation of PSC-derived T cells, but the method does not appear to be effective for iPSC lines where the TCR locus is in the un-rearranged germline configuration. This limitation indicates that this protocol fails to capture some key aspect of T cell development.

Less than a year after the Iriguchi et al. study, Trotman-Grant et al. were the first group to report defined differentiation of αβTCR+ DP T cell progenitors starting from PSCs that did not already comprise a rearranged TCR. These authors generated CD34+ HE cells (CD34 marks both HE cells and HSPCs) and then transitioned them to a downstream T cell differentiation culture system where Notch signals were provided by microbeads functionalized with DLL4. This process produced TCR+, CD3+, and DP cells at very high purities, with >80% of cells co-expressing CD4 and CD8β and ∼75% of cells co-expressing αβTCR and CD3 by day 42 of differentiation. A key advantage of this process is the ability to control the timing and dose of Notch signaling by the provision of engineered beads, in a system that may not be limited by two-dimensional surface area.

Our group sought to build on these impressive results and address some important remaining limitations for chemically defined PSC-to-T cell differentiation cell differentiation. We aimed to overcome the low efficiency of converting PSC-derived CD34+ HSPCs into lymphoid cells and to establish defined differentiation media that could take cells all the way to a αβTCR+, CD8 SP T cell state, the phenotype of functional effector T cells that leave the thymus at the end of development.

The CD34+ cells used as input into downstream T cell differentiation in the Trotman-Grant et al. study have an immunophenotype more consistent with HE, rather than HSPC. During ontogeny, HE cells first undergo EHT to become HSPC before they enter the thymus. HE cells likely cannot appropriately respond to differentiation conditions meant to support T cell development. To address this missing step, we established a dedicated chemically defined EHT culture system and showed that this improved the efficiency of T-lineage specification by more than an order of magnitude.

We used a multistage model-guided optimization to build an open media formula that efficiently supports CD3+, αβTCR+, CD4+, and CD8+ DP differentiation from PSC-derived HSPCs. We also used αCD3, αCD28, and αCD2 antibody complexes to mimic the TCR:HLA engagement event that drives positive selection in the thymus, allowing us to mature our DP cells into to CD8SPs. These CD8SPs had a conventional immunophenotype and possessed the ability to expand and secrete cytokines in response to stimulation.

Jing et al. have also demonstrated defined differentiation of PSC-derived functional T cells using a similar process. Jing et al. and Michaels et al. provide independent validation that HSPCs that emerge in the presence of recombinant DLL4 and VCAM1 can mature into functional T cells. The Jing et al. study also showed that knocking down the histone methyltransferase EZH1 can significantly improve the efficiency of T cell differentiation. As EZH1 is a positive regulator of Notch signaling, this study further emphasizes the importance of carefully titrated Notch activation during T cell development.

After decades of enabling foundational work, the past 2 years have seen a burst of publications in the area of defined T cell differentiation from PSCs, moving this paradigm ever closer to clinical translation.

Mastering T Cell Development by Controlling the Magnitude and Timing of Key Signaling Programs

Recent advances in chemically defined T cell differentiation systems will facilitate clinical translation of PSC-derived immunotherapies. In addition to reducing the risk of contamination and improving consistency, defined systems are inherently more tunable. This makes them easier to iteratively optimize.

The past few years have also seen an influx in advanced multiomic analyses of human T cell development as it occurs in vivo. In vivo studies and in vitro differentiation experiments have collectively shown that successful T cell differentiation, and the functional properties of the resulting T cells, depend on the timing and magnitude of a small set of key regulatory programs, including Notch-, TCR-, and cytokine-signaling. Defined differentiation platforms afford the unique and timely opportunity to precisely manipulate these key pathways, setting the stage for an era of rapid progress in T cell manufacturing.

We envision that two foundational approaches will work in concert to realize this vision—bioengineering and synthetic biology. Hereunder, we provide a perspective on some of the most compelling opportunities to advance PSC-derived T cell production by controlling the timing and strength of key signaling programs by engineering the cell-extrinsic niche and cell-intrinsic genetic programs.

Engineering cytokine signaling to improve differentiation efficiency and reduce cost

T cell development from HSPCs requires activation of a collection of cytokine receptors, initiating a cascade of signal-transduction events that ultimately activate and repress a collection of transcription factor programs that drive cells forward through development. IL-7 and FLT3L are both essential for T cell development. Additional cytokines can enhance or accelerate this process. The signal transduction cascades and gene expression programs that mediate the effect of these cytokines are both context dependent and share overlapping nodes with other cellular signaling processes. This makes it extremely difficult to assess the impact of altering the dosage and timing of exogenous cytokines. Getting the dynamic levels of cytokines just right has major implications for the clinical success of T cell differentiation pipelines. The wrong cytokine dosages can drive cells toward alternate fates or completely block differentiation.

Niche engineering of cytokine signaling

To address this challenge, we and others have successfully employed statistical design of experiments to rapidly and comprehensively explore the space of cytokine combinations. Importantly, we encourage the use of models that can account for changing cytokine requirements over time. By understanding the ancestor–progeny relationships during differentiation, it is possible to apply multistage statistical learning to maximize the yields of intermediate and terminal cell types over the course of a long developmental process.

A typical approach is to use one of several statistical models to choose a limited set of cytokine dosage combinations for a fixed time period in the differentiation process. Cytokines of interest could be manually selected from the literature or identified using high-throughput screens of receptor knockouts or cell–cell signaling interactions. Yields of a target population are quantified, often using flow cytometry for a set of cell-state defining surface markers. Next, a model is constructed based on the sampled cytokine combinations and extrapolated to the untested parameter space. Optimal cytokine concentrations are predicted and then experimentally validated for their ability to increase the yield of the target immunophenotype at each interval.

In the future, we propose screening for conditions that maximize the yield of cells with desired functional properties such as target cell killing, cytotoxic cytokine secretion, proliferation, and persistence, as opposed to cell surface phenotypes. Ultimately, the goal of T cell immunotherapy is to safely and effectively eradicate cancer. Producing PSC-derived cells with a surface marker expression profile that matches primary T cells is an important first step and making a “T-cell like” product will ease the path to regulatory approval. But it is not clear whether PSC-derived cells that phenotypical resemble conventional αβT cells are actually the best population for immunotherapy.

Alternatively, PSC-derived cells that resemble other lymphoid types such as NK, invariant NK, or γδT cells may be superior in some therapeutic contexts. It is conceivable that the most useful cells might not even show clear resemblance to any primary equivalent. As our clinical knowledge grows, we will find better phenotypical and functional correlates with therapeutic success. These new markers can serve as the goal posts for optimizing in vitro differentiation conditions.

Cell engineering of cytokine signaling

To complement this dynamic media development strategy, synthetic biology approaches could be used to write differentiation programs into the stem cell genome. Although synthetic biology strategies have not been applied to T cell differentiation extensively as of yet, strategies of interest include “forward programming”—the controlled expression of transcription factors mimicking developmental trajectories; or engineering the differentiating cells to express and secrete factors that can engage with the cells' endogenous receptor signaling programs to promote differentiation.

Because cytokines need to be dosed and timed appropriately for successful differentiation, crude cytokine overexpression techniques have thus achieved limited success. Recent advances in synthetic biology are enabling precise control of gene expression dosage and timing using small molecule inducers, optogenetics, synthetic receptors, and microRNAs. We recently demonstrated the feasibility of this strategy using a PSC model of gastrulation.

We engineered stem cells to express and secrete BMP4, a factor that is typically added exogenously to promote germ-layer differentiation. By fine-tuning BMP4 expression levels using synthetic microRNA target sites, we were able to precisely control the differentiation outcome and completely obviated the need for exogenous BMP4. As the field makes strides to address the ongoing challenges of large payload delivery, off-target editing, and transcriptional silencing, synthetic control over cellular differentiation becomes an increasingly plausible manufacturing strategy.

Making the right T cells by controlling the magnitude and timing of TCR signaling

Recent progress has enabled efficient differentiation of functional CD8+, effector T cells from PSCs with TCR loci in the germline configuration. However, when the starting PSCs comprise a fully recombined TCR or constitutively express a CAR, these differentiation protocols tend to produce cells with innate-like functional properties instead of conventional αβT cells. A related limitation is that chemically defined differentiation protocols can make CD8+ effector T cells but defined differentiation of functional CD4+ helper T cells has not yet been demonstrated. Both of these issues stem from a common underlying problem—failure to provide the correct timing and magnitude of TCR signaling in vitro.

Overcoming premature TCR-like signals to make conventional T cells

A recent study made the interesting observation that premature TCR signaling (that can be imparted by a pre-rearranged TCR or CAR) can dampen Notch pathway activity. This increases the threshold of Notch input signals required to promote conventional T cell development. This model also helps to explain the known phenomena that γδT cells, which produce a fully formed TCR earlier in development, require higher levels of Notch input signals to successfully differentiate. Thus, carefully managing the complex interplay between Notch and TCR signaling is likely to be very important for efficient in vitro differentiation of T cells harboring an engineered TCR or CAR.

Recognizing this phenomenon, the authors elegantly showed that targeting the CAR into the TRAC locus, which delays CAR expression until after beta selection, provides the right timing of complete TCR expression, and makes cells more similar to αβ T cells when coupled with an appropriately strong Notch ligand. This can further be enhanced by modifying the co-stimulatory domains to get the magnitude of CAR signaling closer to a physiologically relevant range. Although this is an important step, the resulting T cells still displayed an unconventional phenotype, producing significantly lower levels of effector cytokines compared with primary T cells.

Finding a way to precisely juggle TCR and Notch signaling over developmental time could enable production of conventional cells from iPSCs engineered to express CARs and TCRs. On the side of the TCR signal, this can be achieved by inserting bona fide TCRs in the TRAC locus, rather than CARs, matching physiological signaling levels. The timing of CAR activation can be regulated using split-CAR designs; for instance, separating the scFV from the intracellular domains or separating different modules of the intracellular domain. These different CAR architectures can be induced to dimerize by the user, enabling specific activation of the CAR at a timepoint of interest during differentiation.

On the side of controlling Notch signaling, stronger Notch ligands can be developed through in vitro protein evolution, as was recently demonstrated by Gonzalez-Perez et al., or through the use of alternate high-affinity binders such as Notch-activating antibodies tethered to beads or biomaterials (Fig. 3A). Alternately, artificial Notch signals could be provided using synthetic biology approaches that bypass mechanical activation at the cell membrane. For example, overexpressing a constitutively active form of Notch, or fusing Notch's DNA-binding partner RBPJ to a generic transcriptional activator like VP64 may provide sufficiently strong Notch signaling to counteract the repressive effects of a CAR (Fig. 3A).

FIG. 3. Niche engineering and synthetic biology strategies to precisely control Notch and TCR signaling.

(A) Methods for manipulating Notch signaling pathway activity. Niche engineering approaches may involve coating plates with immobilized Notch ligands such as DLL4, or anti-Notch receptor antibodies to activate the Notch pathway in developing T cells. Cellular engineering approaches may involve expressing the Notch intracellular domain from a promoter that can be activated by a small-molecule inducer.

(B) Methods for manipulating TCR pathway activity. Niche engineering approaches may involve coating plates with recombinant peptide-MHC complexes for antigen-specific TCR stimulation, or anti-TCR antibodies for nonspecific TCR stimulation. Cellular engineering approaches may involve fusing CD3 and LCK to domains such as FKBP and FRB, which dimerize in response to the chemical inducer Rapamycin, enabling user-regulated fusion of LCK and CD3 to activate TCR signaling.

FIG. 3. Strategie di ingegneria di nicchia e biologia sintetica per controllare con precisione la segnalazione di Notch e TCR.

(A) Metodi per manipolare l'attività del percorso di segnalazione di Notch. Gli approcci ingegneristici di nicchia possono comportare il rivestimento di piastre con ligandi Notch immobilizzati come DLL4 o anticorpi anti-recettore Notch per attivare il percorso Notch nello sviluppo di cellule T. Gli approcci di ingegneria cellulare possono comportare l'espressione del dominio intracellulare di Notch da un promotore che può essere attivato da un induttore di piccole molecole.

(B) Metodi per manipolare l'attività del pathway TCR. Gli approcci ingegneristici di nicchia possono comportare il rivestimento di piastre con complessi peptide-MHC ricombinanti per la stimolazione TCR antigene-specifica o anticorpi anti-TCR per la stimolazione TCR non specifica. Gli approcci di ingegneria cellulare possono comportare la fusione di CD3 e LCK con domini come FKBP e FRB, che dimerizzano in risposta all'induttore chimico Rapamicina, consentendo la fusione regolata dall'utente di LCK e CD3 per attivare la segnalazione TCR.

Unlocking CD4 T cell development with niche engineering and synthetic biology

Defined T cell differentiation protocols have thus far failed to generate functional CD4+ helper T cells. CD4+ cells improve the efficacy of CAR T therapy and have applications for treating infection, autoimmunity, and transplant rejection. Thus, producing CD4+ T cells from PSCs has substantial translational potential. Below, we briefly outline the biology underlying CD4 versus CD8 lineage choice, then suggest several strategies by which these biological mechanisms could be leveraged to produce CD4+ T cells in vitro.

The decision to adopt a CD4 helper fate versus CD8 effector fate occurs when a TCR expressed by a CD4+, CD8+ DP progenitor engages with a class I or class II HLA molecule. Cells that successfully engage with HLA-I-expressing cells are directed to become CD8SP, whereas TCR engagement with HLA-II promotes differentiation to CD4SP. CD8 and CD4 are co-stimulatory molecules that enhance downstream TCR signaling. TCR activation downregulates CD8 expression which interrupts signaling for HLA-I restricted cells. In contrast, CD4 expression persists after TCR engagement, leading to an enduring signal in HLA-II restricted T cells.

The duration of TCR signaling during this selection event ultimately dictates whether DP cells become CD8 cytotoxic, or CD4 helper cells. In current in vitro T cell differentiation protocols, positive selection is triggered either by developing cells selecting off of one another, or using antibodies against the TCR complex. In humans, HLA-II expression is largely restricted to antigen-presenting cells and thymic epithelial cells, whereas HLA-I is expressed broadly across cell types. Thus, cells undergoing in vitro differentiation likely have access to HLA-I on other developing T cell progenitors but lack a sufficient source of HLA-II offering one explanation for the lack of CD4+ T cells in current protocols.

One way to provide an appropriate TCR signal to facilitate CD4 differentiation would be to coculture the developing T cell progenitors with primary or immortalized antigen-presenting cells. This is an important advantage of technologies such as the ATO platform, or differentiation systems that utilize PSC-derived thymic epithelial cells.

Rather than using living material to trigger TCR:HLA-II interactions, recombinant proteins provide a scalable and clinically translatable alternative (Fig. 3B). Soluble or plate-bound recombinant peptide-HLA-II complexes may be sufficient to drive CD4+ fate specification from DP progenitors. But it is not clear how the choice of peptide and HLA-II allele will shape the repertoire of TCRs that can successfully undergo positive selection. A more generalizable approach that would be agnostic to the TCR itself is to use plate-bound antibodies that simultaneously ligate the TCR-constant region and CD4 (Fig. 3B).

Longer-term cell engineering could be used to directly activate downstream TCR signaling. When the TCR engages with MHC, protein tyrosine kinases including Lck are recruited to TCR/CD3 complex. Lck phosphorylates immunoreceptor tyrosine-based activation motifs (ITAMs) on the cytosolic domain of CD3, which triggers a complex downstream signaling cascade. It may be possible to construct an inducible protein dimerization system whereby an exogenous small molecule triggers Lck recruitment to the CD3 ITAMs (Fig. 3B). A similar approach was applied to make CAR T activation dependent on a small molecule inducer.

Avoiding unwanted by-products to increase T cell yield and purity

One compelling opportunity to reduce the cost of in vitro T cell manufacturing is to increase the purity and yield of desired target populations at each stage of differentiation. En route to making T cells, protocols first specify PSCs to the mesoderm lineage, then through a HE intermediate, then an HSPC state, next to become T cell progenitors and finally mature T cells. At every stage, unwanted off-target populations are produced.

These cellular by-products consume resources and limit the maximum yield of the target population per-input PSC. Off-target populations may also compete directly with the desired intermediate. A proven solution is to enrich for the target population at key transitions in the culture. Exemplifying this approach, we and others routinely select for CD34+ cells early during differentiation by antibody-mediated magnetic separation. Additional enrichment steps, such as at the CD7+ T cell progenitor stage, would likely increase purity and efficiency but would also further complicate the manufacturing workflow and may not reduce the net product cost (Fig. 4).

FIG. 4. Avoiding unwanted cell populations through affinity-based targeted enrichment and gene editing.

Left: Cell populations of interest can be enriched with antibodies through fluorescence-activated cell sorting or magnetic purification. Right: Gene editing can be deployed to block access to undesired cell fates.

FIG 4. Evitare popolazioni cellulari indesiderate attraverso l'arricchimento mirato basato sull'affinità e l'editing genetico.

A sinistra: le popolazioni cellulari di interesse possono essere arricchite con anticorpi attraverso lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza o la purificazione magnetica. A destra: l'editing genetico può essere implementato per bloccare l'accesso a destini cellulari indesiderati.

As an alternative approach, a cellular engineering solution is to block access to unwanted cell fate trajectories by knocking out genes that are required for their development (Fig. 4). Pruning the developmental tree in this manner should allow cell culture resources to be directed efficiently towards supporting T cell development. There is already a strong precedent that knocking out an important fate-specifying gene can improve the efficiency of in vitro T cell differentiation. By knocking down EZH1, Jing et al. were able to substantially increase the yield of CD3+ T cell production from PSCs by ∼threefold compared with control conditions.101

In addition to blocking access to unwanted developmental paths, cellular engineering can also be applied to enhance or accelerate progression along the target trajectory. Overexpression of hematopoietic transcription factors has enabled or improved in vitro differentiation of multiple blood lineages from pluripotent and primary cell sources. Although this approach has progressed at a modest pace for the past decade, recent advances in high-throughput perturbation screening technologies are poised to drastically accelerate progress in this space.

Summary and Conclusion

T cell therapies are disrupting the way we treat disease, but widespread adoption of this modality is limited by our ability to cost-effectively manufacture the right cell types at scale. PSCs are a compelling solution to this challenge that benefit from decades of fundamental research into T cell development using feeder-based differentiation protocols.

Presently, the field is in transitioning to chemically defined bioengineered differentiation systems. Not only are these contemporary approaches more readily translatable to the clinic, but they also afford much more precise control over the levels and timing of signaling inputs during differentiation. T cell development from PSC follows a complex multistage process that is dependent on a carefully balanced orchestra of signals and bioengineering is well suited to accurately reproduce this process in vitro.

We anticipate that synthetic biology will drive the next major shift in T cell manufacturing from PSCs. Parallel improvements in our fundamental understanding of T cell differentiation and our ability to synthetically control cell function are setting the stage for more efficient and cost-effective cell therapies. Ultimately, our ability to generate multiple T cell subtypes at scale will enable new therapeutic strategies in oncology and beyond.

ITALIANO

Riassunto

Le cellule T ingegnerizzate sono all'avanguardia nella terapia cellulare clinica. Le terapie con cellule T hanno avuto un notevole impatto sulla cura del paziente per un sottogruppo di neoplasie ematologiche. Questa fondazione ha motivato lo sviluppo di terapie cellulari ingegnerizzate pronte all'uso per un'ampia gamma di indicazioni devastanti. Il raggiungimento di questa visione richiederà una produzione economica di cellule di precisione in grado di affrontare molteplici sfide di processo e di progettazione clinica. Le cellule T ingegnerizzate derivate da cellule staminali pluripotenti (PSC) stanno emergendo come soluzione di scelta. Per liberare tutto il potenziale delle terapie con cellule T derivate da PSC, il campo richiederà tecnologie in grado di orchestrare in modo robusto la complessa serie di eventi di segnalazione dipendenti dal tempo e dalla dose necessari per ricreare lo sviluppo funzionale delle cellule T in laboratorio. In questo articolo, esaminiamo lo stato attuale delle terapie con cellule T allogeniche, concentrandoci sulle strategie per generare cellule linfoidi ingegnerizzate da PSC. Evidenziamo gli entusiasmanti progressi recenti in questo campo e delineiamo opportunità tempestive di avanzamento con un'enfasi sull'ingegneria di nicchia e sulla biologia sintetica.

Introduzione

Negli ultimi dieci anni, ci sono stati enormi progressi nel trattamento del cancro con immunoterapie cellulari. In particolare, i recettori chimerici dell'antigene (CAR) che reindirizzano le cellule T per riconoscere CD19 o BCMA hanno mostrato una notevole efficacia contro alcuni tipi di leucemia, linfoma e mieloma multiplo. Finora, sei terapie CAR-T sono state approvate dalla Food and Drug Administration (FDA) statunitense dal 2017, con diverse centinaia di altri prodotti in varie fasi di sviluppo clinico. Le cellule CAR-T vengono anche esplorate per una moltitudine di indicazioni non oncologiche, tra cui il rigetto del trapianto, l'infezione, l'autoimmunità, le malattie cardiovascolari, la fibrosi e la senescenza. 

Nonostante il loro curriculum impressionante ed in espansione, è necessario superare diversi ostacoli tecnici prima che le terapie con cellule T realizzino il loro pieno potenziale. Le questioni di sicurezza, efficacia, fuga dell'antigene e traduzione in tumori solidi sono sfide importanti che sono state ampiamente riviste altrove. Un altro importante collo di bottiglia è il processo di produzione stesso. Il metodo predominante per la produzione di terapie a base di cellule T oggi è quello di procurarsi le cellule T dal paziente stesso, ingegnerizzarle geneticamente per riconoscere le cellule maligne utilizzando pipeline di trasduzione virale su misura e reinfondere le cellule modificate nel paziente. Questo processo di produzione personalizzato aggiunge costi significativi e variabilità alle terapie con cellule T. La creazione di flussi di lavoro di produzione più robusti, scalabili e riproducibili per le terapie con cellule T contribuirà a migliorare la sicurezza e l'efficacia dei prodotti ed amplierà l'accesso a queste terapie salvavita. 

In questa recensione, esaminiamo lo stato attuale delle terapie con cellule T allogeniche, prestando particolare attenzione alle strategie per generare cellule linfoidi ingegnerizzate da cellule staminali pluripotenti (PSC). Discutiamo anche dei recenti progressi nel campo e consideriamo le opportunità di avanzamento, in particolare per quanto riguarda l'ingegneria di nicchia e la biologia sintetica.

Sfide delle terapie CAR-T autologhe

A differenza delle piccole molecole e dei prodotti biologici, prodotti in ambienti scalabili, controllabili e completamente definiti all'interno di reattori chimici o biologici (Domokos, Nagy, 2021), i prodotti della terapia con cellule T sono medicine viventi. Attualmente, per uso clinico, le terapie a base di cellule T sono prodotte prevalentemente in dosi singole, prelevando le cellule T non modificate dal paziente stesso. 

Queste terapie con cellule T autologhe affrontano diverse sfide di produzione significative. Uno è il costo. Per i prodotti allogenici, ogni volta che ad un paziente viene prescritto CAR-T, viene avviato un flusso di lavoro multifase personalizzato.  Il paziente dona sangue periferico e le sue cellule T vengono isolate. Successivamente, le cellule T vengono stimolate ex vivo ed iniziano a subire una massiccia espansione. Una volta che le cellule T sono state attivate, vengono trasdotte con un vettore virale comprendente il transgene CAR. Infine, il prodotto CAR-T viene sottoposto a test di rilascio per garantire la qualità prima di essere infuso nel paziente.

L'intero flusso di lavoro, inclusa la produzione dei vettori virali CAR, viene eseguito in conformità con le buone pratiche di fabbricazione. A causa di questo complesso processo di produzione personalizzato, il prezzo di CAR-T è notevolmente elevato rispetto ad altri tipi di terapie, con un prezzo di una dose dell'ordine di $ 500.000.   Se i benefici delle terapie CAR-T per i pazienti possano giustificare il loro prezzo attuale è difficile da quantificare ed è oggetto di dibattito in corso.  Non solo i costi eccessivi  limitano il numero di pazienti che sono in grado di accedere alle terapie attualmente approvate, ma limitano anche l'ambito delle indicazioni future per le quali sono contemplate le cellule CAR-T .

Una seconda sfida è la variabilità nella qualità del prodotto. Questa variabilità esiste in molteplici aspetti. Esiste una variabilità da donatore a donatore nel numero e nella qualità delle cellule T disponibili per la produzione del prodotto CAR-T. Al di là della diversità biologica che esiste tra gli individui nella popolazione sana, questo problema è esacerbato dall'impatto del cancro sul compartimento delle cellule T di un paziente. Le radiazioni e la chemioterapia, i trattamenti di prima linea per la maggior parte dei tumori, riducono il numero e la funzionalità delle cellule T di un paziente. Di conseguenza, una percentuale significativa di pazienti non è in grado di produrre un innesto di qualità sufficiente per procedere all'infusione. 

Oltre alla variabilità da donatore a donatore, esiste anche l'eterogeneità all'interno di un singolo innesto. A seconda del processo di produzione specifico, le cellule T isolate ed espanse comprendono una miscela di sottotipi di cellule T in vari stati di polarizzazione e differenziazione lungo l'asse effettore-memoria. Inoltre, non tutte le cellule T nell'innesto saranno trasdotte con successo con il CAR, portando ad una miscela di cellule modificate e non modificate. Anche tra le cellule modificate, la natura semicasuale dell'integrazione del vettore retrovirale porta all'eterogeneità nel livello di espressione che influisce sulla funzionalità e comporta il rischio che i loci importanti vengano interrotti. Poiché gli innesti comprendono miliardi di cellule, anche rari eventi oncogenici devono essere considerati.

Alternative alle terapie con cellule T autologhe

Il costo, la variabilità ed il controllo della qualità del prodotto sono ostacoli ampiamente riconosciuti all'espansione del successo della terapia CAR-T. Di seguito, discutiamo di come le CAR geneticamente modificate ed i prodotti a cellule T allogeniche possono affrontare parzialmente queste sfide. Esploriamo anche i vantaggi ed i limiti della trasduzione CAR in vivo come alternativa a basso costo alla produzione ex vivo. Quindi sosteniamo i prodotti a cellule T derivati ​​da PSC come una soluzione convincente a lungo termine per immunoterapie accessibili ad alte prestazioni.

Un modo per evitare l'eterogeneità dell'espressione genica causata dall'integrazione virale semicasuale è indirizzare il CAR ad un locus definito utilizzando l'editing genetico di precisione come CRISPR-Cas9. In un modello preclinico di leucemia a cellule B, l'introduzione di un CAR CD19 nel locus della costante della catena alfa del recettore delle cellule T (TRAC) con CRISPR-Cas9 ha ridotto sia l'espressione CAR mediana che la variabilità dell'espressione rispetto ad un controllo ingegnerizzato viralmente. TRAC knock-in ha anche migliorato significativamente la clearance del tumore rispetto ai controlli modificati viralmente. I CAR introdotti viralmente sono tipicamente espressi a livelli molto più alti rispetto ai recettori delle cellule T endogeni. L'elevata espressione CAR costitutiva può portare le cellule T in uno stato di esaurimento e comprometterne la funzionalità. Al contrario, l'inserimento di un CAR nel locus TRAC porta ad un livello di espressione più simile al recettore delle cellule T (TCR), mitigando l'esaurimento e migliorando l'efficacia. 

Le CAR geneticamente modificate possono fornire un prodotto più coerente ed efficace. Tuttavia, sono necessari ulteriori miglioramenti. Sebbene le recenti proteine ​​​​di fusione di progettazione possano migliorare le efficienze knock-in CRISPR-Cas9, i tassi di integrazione per grandi carichi utili multichilobase rimangono bassi nelle cellule T primarie. CRISPR è anche soggetto a mutagenesi fuori bersaglio, il che significa che i prodotti modificati comprenderanno ancora un mix di cellule correttamente modificate, erroneamente modificate e non modificate. Flussi di lavoro di modifica precisi, in particolare quelli che richiedono sia nucleofezione che donatori di omologia AAV, aggiungeranno costi al processo di produzione, sebbene ciò possa essere mitigato utilizzando l'editing non virale. Le cellule CAR-T geneticamente modificate non risolveranno il problema dell'eterogeneità intradonatore.

Le terapie con cellule T allogeniche derivate da donatore primario possono affrontare parzialmente la sfida della variabilità donatore-donatore. Acquistando cellule T da donatori sani, è possibile aggirare l'impatto negativo che il cancro e le terapie antitumorali hanno sul compartimento delle cellule T di un paziente. Sebbene i prodotti CAR-T autologhi spesso falliscano i test di rilascio,  in studi recenti sulla terapia CAR-T allogenica primaria, tutti i pazienti arruolati sono stati in grado di ricevere il trattamento, nessuno è stato escluso a causa di prodotti a base di cellule T di scarsa qualità. Le terapie allogeniche possono anche semplificare il processo di produzione in quanto i prodotti di terapia cellulare possono essere criopreservati e utilizzati su richiesta, riducendo il ritardo necessario per la produzione autologa. 

Nonostante i loro vantaggi, le terapie allogeniche primarie devono superare le barriere immunologiche tra donatore e ricevente. La reattività dell'innesto rispetto all'ospite è un importante problema di sicurezza ed evitare il rigetto dell'innesto per ottenere un beneficio terapeutico duraturo è un'ulteriore sfida. Sebbene i donatori sani possano fornire un numero maggiore di cellule T funzionali rispetto ai malati di cancro, esiste ancora una considerevole eterogeneità nell'abbondanza e nella funzionalità delle cellule T tra gli individui sani. Al di là della breve panoramica fornita in precedenza, i vantaggi ed i limiti della terapia allogenica primaria sono esaminati in modo più approfondito altrove. 

Le cellule T geneticamente modificate ed i donatori allogenici possono teoricamente ridurre la variabilità nei risultati CAR-T, ma nessuno dei due approcci eliminerà il costoso processo di produzione di cellule T ex vivo. Una potenziale soluzione economica consiste nell'eseguire una rapida fase di trasduzione ex vivo e consentire il lungo processo di espansione all'interno del paziente. In uno studio clinico in corso di questo approccio, una fase di produzione ex vivo estremamente rapida (circa 2 giorni) ha mostrato risultati iniziali promettenti. 

Oltre ad accorciare ed automatizzare i processi di produzione CAR-T, un'alternativa elegante è quella di eliminare del tutto la fase di produzione della terapia cellulare ex vivo consegnando la CAR alle cellule T all'interno del corpo di un paziente. Ciò è stato ottenuto in precedenza infondendo topi con cassette di espressione CAR utilizzando sistemi di consegna come nanoparticelle caricate con DNA o mRNA, o vettori virali. Un approccio ibrido proposto di recente prevede il prelievo di cellule T del paziente, la semina in un'impalcatura di alginato insieme a particelle virali e reagenti di attivazione delle cellule T e l'impianto del biomateriale nel paziente dove le cellule vengono trasdotte ed espanse in vivo. Questi processi di produzione in vivo e ibridi dovrebbero ridurre i costi, i tempi e la manodopera associati alla produzione di CAR-T se si dimostrano efficaci negli esseri umani. Tuttavia, questi approcci comportano rischi aggiuntivi, inclusa la possibilità di trasdurre tipi di cellule fuori bersaglio.

Le cellule CAR-T allogeniche primarie possono aiutare ad affrontare la variabilità del prodotto e la somministrazione di CAR in vivo può ridurre i costi di produzione. I PSC sono un approccio alternativo estremamente attraente perché possono affrontare contemporaneamente entrambe le sfide. Piuttosto che ottenere cellule T da singoli donatori, possono essere differenziate dalle PSC (PSC allogeniche CAR-T). I PSC sono suscettibili di espansione clonale e auto-rinnovamento illimitato.  Ciò significa che i CAR, o altri potenziamenti terapeutici, possono essere facilmente introdotti in loci mirati attraverso l'editing genetico. 

Dopo un rigoroso controllo di qualità, i cloni che contengono la modifica desiderata e sono privi di mutazioni fuori bersaglio ed anomalie cromosomiche possono essere espansi su larga scala nei bioreattori per la successiva differenziazione in vitro in cellule T. Il prodotto di terapia cellulare risultante può essere criopreservato per la terapia standard su richiesta. PSC hanno il potenziale per fungere da fonte a basso costo di terapie con cellule T di alta qualità ingegnerizzate clonalmente. Per realizzare questa visione e consentire la produzione su larga scala di cellule T per la terapia, i ricercatori hanno lavorato per sviluppare e migliorare i processi di differenziazione delle cellule PSC-T.

Sforzi per creare cellule T derivate da PSC

I protocolli di differenziazione PSC sono spesso progettati utilizzando intuizioni dall'embriogenesi; pertanto, una conoscenza approfondita dello sviluppo delle cellule T mentre si verifica in vivo è fondamentale per il successo degli sforzi per generare cellule T derivate da PSC. In questa sezione, descriviamo brevemente il processo di sviluppo delle cellule T, quindi evidenziamo come la nostra comprensione di questo processo ha plasmato lo sviluppo dei protocolli di differenziazione delle cellule T in vitro . Descrizioni più complete dello sviluppo delle cellule T e dell'ematopoiesi possono essere trovate in diverse recensioni eccellenti. 

Sviluppo delle cellule T in vivo

Tutte le cellule del sistema ematopoietico derivano da un sottoinsieme del mesoderma. Durante l'embriogenesi precoce, le cellule pluripotenti entrano attraverso una struttura transitoria chiamata striscia primitiva, dove ricevono segnali che le avviano verso il lignaggio ematopoietico, formando il cosiddetto compartimento mesodermico ematopoietico. Il mesoderma ematopoietico dà origine ad almeno due ondate distinte di progenitori ematopoietici, che si distinguono in vivo in base a dove e quando emergono, nonché ai tipi cellulari differenziati che producono. L'onda "primitiva" è la prima ad emergere e viene rilevata per la prima volta a E7 nel topo  ed al giorno 18,5 di gestazione nell'uomo. I progenitori dell'onda primitiva derivano da "isole del sangue", o gruppi di cellule ematopoietiche ed endoteliali nel sacco vitellino. Questa prima ondata di emopoiesi è transitoria e dà origine ad un piccolo sottoinsieme di tipi di cellule ematopoietiche, inclusi eritrociti, megacariociti e macrofagi. 

È importante sottolineare che le onde primitive non producono alcuna cellula del lignaggio linfoide, comprese le cellule T. Al contrario, l'onda "definitiva" dell'ematopoiesi emerge più tardi nel tempo dello sviluppo, a E11.5 nel topo e CS14 nell'uomo. I progenitori ematopoietici definitivi derivano da cellule endoteliali con potenziale ematopoietico, o cellule endoteliali emogeniche (HE), all'interno dell'embrione vero e proprio, prevalentemente nella regione aorta-gonade-mesonefro, che subiscono la transizione endoteliale-ematopoietica (EHT) per generare cellule ematopoietiche. In contrasto con il potenziale apparentemente limitato dei progenitori primitivi, l'onda definitiva dà origine a cellule staminali ematopoietiche (HSC), o singole cellule che possono ricostituire l'intero sistema sanguigno dopo il trapianto in un nuovo ospite.

Negli ultimi anni, le definizioni di emopoiesi primitiva rispetto a quella definitiva sono diventate confuse. Ad esempio, studi sui topi hanno identificato progenitori ematopoietici derivati ​​​​dal sacco vitellino con potenziale linfoide, e popolazioni corrispondenti sono state descritte in studi che utilizzano PSC umani. Inoltre, l'emopoiesi intraembrionale non produce esclusivamente HSC, poiché progenitori multipotenti non attecchiti, così come progenitori bi- e unipotenti derivati ​​dall'embrione proprio prima dell'emergenza dell'HSC sono stati descritti da più gruppi indipendenti. Sebbene i ricercatori abbiano notato che alcuni sottoinsiemi di cellule T derivano preferenzialmente da progenitori che emergono prima dello sviluppo delle HSC, le differenze funzionali tra le cellule T derivate da progenitori del sacco vitellino, progenitori intraembrionali e HSC non sono state ancora caratterizzate.

Indipendentemente dall'origine dello sviluppo, i progenitori T-competenti inizialmente seminano il timo, l'organo principale responsabile dello sviluppo delle cellule T ( Fig. 1A ). Il timo è organizzato in varie zone anatomiche con distinti ambienti di segnalazione; questi diversi segnali promuovono la transizione a successivi stadi di sviluppo mentre i progenitori delle cellule T, o timociti, migrano attraverso il timo. I primi progenitori che seminano il timo sono definiti doppio negativo (DN), a causa della mancanza di espressione dei co-recettori CD4 e CD8. Quando i progenitori T-competenti entrano per la prima volta nel timo, conservano la capacità di produrre cellule mieloidi e natural killer (NK). Dopo aver ricevuto la stimolazione di Notch e IL-7 fornita dal timo. Le cellule DN proliferano e sovraregolano CD7, CD5, quindi CD1a, segnando la perdita del loro potenziale di differenziazione mieloide e NK. 

Dopo l'impegno del lignaggio T, le cellule DN procedono allo stadio immaturo singolo positivo (iSP), caratterizzato dalla sovraregolazione del CD4.  Durante questa fase, i timociti diventano sbilanciati verso uno dei due possibili lignaggi: cellule T TCRαβ+ "convenzionali" o cellule T TCRγδ "simil-innate".  La maggior parte dei timociti inizierà a riorganizzare il locus TCRβ. I timociti che producono un riarrangiamento TCRβ in-frame esprimeranno una proteina TCRβ funzionale, che si complessa con una proteina pre-TCRα surrogata e CD3 per formare il complesso pre-TCR. I timociti che non riescono a produrre un riarrangiamento TCRβ in-frame vengono eliminati attraverso un processo chiamato selezione beta. Sebbene l'espressione pre-TCR distorca gli iSP verso il lignaggio delle cellule αβ-T, un piccolo sottoinsieme di iSP riorganizza in modo produttivo i loci TCRγ e TCRδ, portando all'espressione di un γδ-TCR funzionale che avvia l'impegno per il lignaggio delle cellule γδ-T. Dopo l'espressione pre-TCR, i precursori delle cellule αβ-T sovraregolano il CD8 per diventare cellule CD4 + CD8 + "doppio positivo" (DP).

Prima di uscire dalla corteccia del timo, i timociti DP riorganizzano il loro locus TCRα per produrre un gene TCRα maturo, con conseguente espressione del complesso TCRαβ sulla loro superficie. La selezione positiva di timociti che esprimono TCR che possono legarsi con moderata affinità ai complessi auto-peptide-antigene leucocitario umano (HLA) è fondamentale per un'ulteriore differenziazione, poiché i cloni TCR non reattivi vengono eliminati nella corteccia attraverso la mancata selezione. Durante questo processo di selezione, i timociti DP selezionano anche un fenotipo citotossico CD8+ o un fenotipo helper CD4+ in base al fatto che il TCR interagisca con le molecole HLA-I attraverso il co-recettore CD8 o le molecole HLA-II attraverso il co-recettore CD4. Successivamente, i timociti viaggiano verso il midollo, dove i cloni che esprimono TCR con elevata reattività agli autoantigeni vengono eliminati mediante selezione negativa. 

I linfociti T maturi escono dal timo ed entrano in circolo come linfociti T naive, dove scansionano tutto il corpo alla ricerca del loro antigene affine. Quando una cellula T CD4 o CD8 ingenua incontra il suo antigene bersaglio, subisce una rapida espansione clonale e si differenzia in un fenotipo effettore. Le cellule T CD8 si differenziano in linfociti T citotossici (CTL), che possono uccidere direttamente le cellule che presentano l'antigene bersaglio. Le cellule T CD4 si differenziano in una gamma di fenotipi "helper", che secernono sottoinsiemi di citochine per supportare la funzione dei CTL, così come altre cellule immunitarie innate. Una volta eliminata l'infezione iniziale, la maggior parte delle cellule effettrici differenziate muore; tuttavia, un sottoinsieme di cellule effettrici viene mantenuto come cellule T di memoria. I linfociti T della memoria sono di particolare interesse clinico, in quanto sono relativamente longevi.

Imparare dallo sviluppo umano per creare cellule T in vitro con cellule nutritrici stromali

Motivati ​​da applicazioni terapeutiche e di ricerca, gli scienziati hanno cercato a lungo di ricreare lo sviluppo delle cellule T in vitro ( Fig. 1B ). I primi tentativi di differenziare le cellule T si sono concentrati sulla ricapitolazione delle caratteristiche chiave del timo. Tra la moltitudine di molecole prodotte nel timo, i segnali di Notch sono cruciali per lo sviluppo delle cellule T ed, in combinazione con le citochine FLT3L e IL-7, sono sufficienti per supportare lo sviluppo delle cellule T dalle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche primarie (HSPC) in vitro. Linee cellulari stromali immortalizzate progettate per esprimere i ligandi di Notch, come i sistemi OP9-DL1 e OP9-DL4, sono state utilizzate con successo per decenni. Negli ultimi anni sono emersi ulteriori sistemi basati su alimentatori, inclusa la piattaforma organoide timica artificiale (ATO), che fenocopia in modo più accurato alcuni aspetti della struttura timica tridimensionale.

Questi protocolli basati sull'alimentatore sono stati originariamente sviluppati e implementati con HSPC primari, derivati ​​dal sangue del cordone ombelicale (CB) o dal midollo osseo, come materiale di partenza. Ma queste fonti di cellule derivate da donatori umani soffrono di limitazioni simili a quelle dei linfociti T primari in termini di scala e variabilità intradonatore. Le PSC possono teoricamente fornire una fonte di cellule T molto più scalabile, più economica e geneticamente coerente. Un obiettivo di lunga data è stato quindi quello di produrre HSPC con potenziale di lignaggio T da PSC come materiale di partenza.

Poiché i progenitori del sangue derivano dal mesoderma, la maggior parte dei protocolli di differenziazione delle cellule da PSC a T stabiliti prevede una fase di induzione del mesoderma. I primi protocolli di differenziazione del sangue in vitro tendevano a fenocopiare l'onda primitiva derivata dal sacco vitellino e generavano popolazioni miste prive di un robusto potenziale di lignaggio T. Ciò è dovuto principalmente all'aggiunta di Activin A esogena senza integrazione di Wnt durante la fase di induzione del mesoderma, che promuove lo sviluppo del mesoderma di polarizzazione primitiva. Manipolando Wnt e activina/segnalazione nodale, più gruppi sono riusciti a generare le cosiddette cellule definitive simili a HSPC con potenziale di lignaggio T. Questi HSPC derivati ​​da PSC potrebbero svilupparsi in cellule T mature in vitro su strati di alimentazione stromali.

Si noti che queste cellule mancano ancora di alcuni attributi chiave delle vere HSC poiché finora non sono riuscite ad attecchire e ricostituire topi immunodeficienti senza un'ampia manipolazione genetica. Ciò potrebbe riflettere il fatto che queste cellule assomigliano più da vicino ad un progenitore ematopoietico indipendente dalle HSC, o che sono simili alle vere HSC ma richiedono un'ulteriore maturazione in un ambiente fetale simile al fegato prima di raggiungere il potenziale di attecchimento.

Nonostante l'ostacolo rimanente dell'attecchimento, i progressi del protocollo sia nella differenziazione HSPC che nella differenziazione delle cellule T hanno avuto un profondo impatto in tutte le discipline scientifiche. Non solo sono servite come potenti piattaforme per studiare lo sviluppo cellulare e modellare la malattia, ma hanno anche dimostrato la fattibilità delle immunoterapie con cellule T derivate da PSC. In uno studio fondamentale, Themeli et al. dimostrato che le PSC indotte (iPSC) riprogrammate da un clone di cellule T potrebbero essere differenziate in cellule CAR T citotossiche in vitro. Sebbene queste cellule T derivate da PSC avessero proprietà funzionali più simili a γσ, rispetto alle cellule αβ-T, erano in grado di eradicare le cellule tumorali CD19+ in vitro e in un modello di leucemia xenotrapianto. 

Sistemi di differenziamento delle cellule T chimicamente definiti

Nonostante questo entusiasmante progresso, i suddetti protocolli di differenziazione cellulare da PSC a T richiedono tutti derivati ​​​​animali, inclusi siero, stroma immortalizzato o membrane basali estratte da colture tumorali. I derivati ​​animali non definiti, inclusi sieri ed estratti, introducono variabilità da lotto a lotto, rappresentano un rischio di contaminazione, e mascherano i segnali sottostanti che guidano i processi di sviluppo. Inoltre, le linee cellulari stromali ingegnerizzate come OP9-DL1 presentano un livello costante di ligando di Notch nel tempo. Questi sistemi non sono ideali per supportare i processi di differenziazione in cui sono richiesti cambiamenti dinamici nella forza di segnalazione. Collettivamente, questi sono ostacoli significativi alla traduzione clinica dei processi di differenziazione xenogenica.

Per consentire protocolli di differenziazione più sicuri, sintonizzabili e robusti, il nostro gruppo e altri si sono concentrati sulla creazione di metodi chimicamente definiti che evitino le cellule di alimentazione, il siero e gli estratti di membrana. Un traguardo importante è stato raggiunto nel 2017, quando Shukla et al. ha dimostrato che gli HSPC umani primari derivati ​​dal CB ombelicale potrebbero essere indirizzati a diventare progenitori di cellule T utilizzando ligandi Notch ricombinanti piuttosto che stroma OP9. Shukla et al. scoperto che la molecola di adesione cellulare VCAM1 può essere utilizzata per aumentare la forza della segnalazione di Notch. Sebbene l'immobilizzazione della DLL4 ricombinante da sola su una superficie di coltura non fosse sufficiente per promuovere lo sviluppo del progenitore delle cellule T, l'aggiunta di VCAM1 ricombinante immobilizzato sinergizzava con la DLL4 per sbloccare il potenziale di differenziazione del lignaggio T. Successivamente abbiamo esteso questo metodo per portare gli HSPC derivati ​​da CB fino ai fenotipi delle cellule T mature utilizzando un processo di ottimizzazione dei media guidato da modelli multistadio. 

La prossima sfida chiave è stata quella di estendere questi protocolli di differenziazione definiti chimicamente per utilizzare i PSC, piuttosto che il CB come materiale di partenza. Nel 2020, Motazedian et al. dimostrato la differenziazione delle cellule CD4 +, CD8 + DP e CD3- dalle iPSC in condizioni prive di alimentatore utilizzando un sistema di coltura con interfaccia aria-liquido.  Queste cellule potrebbero successivamente maturare in cellule CD3+, TCR+ su cellule OP9-DL4. Le cellule prodotte nel loro sistema di coltura esprimono sorprendentemente presto il gene della ricombinasi associato al lignaggio T nel loro sviluppo.  Gli autori hanno suggerito che queste cellule rappresentano un progenitore di cellule T HSC-indipendenti che emerge direttamente dall'endotelio emogeno. 

Iriguchi et al. sono stati il ​​primo gruppo a differenziare le PSC fino in cellule T mature senza l'uso di stroma immortalizzato. Gli autori hanno riprogrammato le linee iPSC dalle cellule T e hanno applicato una versione modificata del processo di differenziazione del sangue definito chimicamente in precedenza per produrre HSPC.  Hanno trasferito questi HSPC su recipienti di coltura rivestiti con DLL4 ricombinante e retronectina, un frammento della proteina fibronectina che può legarsi a a4b1, la stessa integrina che interagisce con VCAM1. Questo processo ha prodotto cellule CD8 singole positive (CD8SP) che esprimevano il TCR originale dal clone iPSC genitore. In modo impressionante, queste cellule erano in grado di espandersi e producevano citochine effettrici in risposta alla stimolazione, dimostrando importanti proprietà funzionali delle cellule T primarie. Erano anche in grado di uccidere specificamente le cellule bersaglio che esprimono l'antigene peptidico affine del TCR sia in vitro che in vivo. 

Sebbene la maggior parte dei risultati presentati in Iriguchi et al. studio sono stati generati utilizzando un terreno a base di siero, gli autori hanno anche riferito di un processo privo di siero di successo, anche se meno efficiente. Questo studio è una pietra miliare importante per la traduzione clinica delle cellule T derivate da PSC, ma il metodo non sembra essere efficace per le linee iPSC in cui il locus TCR si trova nella configurazione della linea germinale non riorganizzata. Questa limitazione indica che questo protocollo non riesce a catturare alcuni aspetti chiave dello sviluppo delle cellule T.

Meno di un anno dopo che Iriguchi et al. studio, Trotman-Grant et al. sono stati il ​​primo gruppo a segnalare una differenziazione definita dei progenitori delle cellule T αβTCR + DP a partire da PSC che non comprendevano già un TCR riorganizzato. Questi autori hanno generato cellule HE CD34+ (CD34 contrassegna sia le cellule HE che gli HSPC) e poi le hanno trasferite a un sistema di coltura di differenziazione delle cellule T a valle in cui i segnali Notch sono stati forniti da microsfere funzionalizzate con DLL4. Questo processo ha prodotto cellule TCR+, CD3+ e DP a purezza molto elevata, con >80% di cellule che co-esprimono CD4 e CD8β e ~75% di cellule che co-esprimono αβTCR e CD3 al giorno 42 di differenziazione. Un vantaggio chiave di questo processo è la capacità di controllare i tempi e la dose di segnalazione Notch mediante la fornitura di perline ingegnerizzate, in un sistema che potrebbe non essere limitato dalla superficie bidimensionale.

Il nostro gruppo ha cercato di basarsi su questi risultati impressionanti ed affrontare alcune importanti limitazioni rimanenti per la differenziazione cellulare di differenziazione cellulare da PSC a T definita chimicamente. Abbiamo mirato a superare la bassa efficienza della conversione di HSPC CD34+ derivati ​​da PSC in cellule linfoidi ed a stabilire mezzi di differenziazione definiti che potrebbero portare le cellule fino a uno stato cellulare αβTCR+, CD8 SP T, il fenotipo delle cellule T effettrici funzionali che lasciano il timo alla fine dello sviluppo.

Le cellule CD34+ utilizzate come input nella differenziazione delle cellule T a valle nello studio di Trotman-Grant et al. studio hanno un immunofenotipo più coerente con HE, piuttosto che con HSPC. Durante l'ontogenesi, le cellule HE subiscono prima l'EHT per diventare HSPC prima di entrare nel timo. Le cellule HE probabilmente non possono rispondere in modo appropriato alle condizioni di differenziazione intese a supportare lo sviluppo delle cellule T. Per affrontare questo passaggio mancante, abbiamo istituito un sistema di coltura EHT definito chimicamente dedicato e abbiamo dimostrato che ciò ha migliorato l'efficienza della specifica del lignaggio T di oltre un ordine di grandezza. 

Abbiamo utilizzato un'ottimizzazione guidata da un modello multistadio per creare una formula multimediale aperta che supporti in modo efficiente la differenziazione CD3+, αβTCR+, CD4+ e CD8+ DP dagli HSPC derivati ​​da PSC. Abbiamo anche usato complessi di anticorpi αCD3, αCD28 e αCD2 per imitare l'evento di coinvolgimento TCR: HLA che guida la selezione positiva nel timo, permettendoci di far maturare le nostre cellule DP in CD8SP. Questi CD8SP avevano un immunofenotipo convenzionale e possedevano la capacità di espandere e secernere citochine in risposta alla stimolazione.

Jin et al. hanno anche dimostrato una differenziazione definita delle cellule T funzionali derivate da PSC utilizzando un processo simile.  Jin et al. e Michaels et al. fornire una convalida indipendente che gli HSPC che emergono in presenza di DLL4 ricombinante e VCAM1 possono maturare in cellule T funzionali. Il Jing et al. Lo studio ha anche dimostrato che l'abbattimento dell'istone metiltransferasi EZH1 può migliorare significativamente l'efficienza della differenziazione delle cellule T. Poiché EZH1 è un regolatore positivo della segnalazione di Notch, questo studio sottolinea ulteriormente l'importanza dell'attivazione di Notch accuratamente titolata durante lo sviluppo delle cellule T. 

Dopo decenni di lavoro di base, gli ultimi 2 anni hanno visto un'esplosione di pubblicazioni nell'area della differenziazione definita delle cellule T dalle PSC, spostando questo paradigma sempre più vicino alla traduzione clinica.

Padroneggiare lo sviluppo delle cellule T controllando l'entità e la tempistica dei programmi di segnalazione chiave

I recenti progressi nei sistemi di differenziazione delle cellule T chimicamente definiti faciliteranno la traduzione clinica delle immunoterapie derivate da PSC. Oltre a ridurre il rischio di contaminazione e migliorare la coerenza, i sistemi definiti sono intrinsecamente più sintonizzabili. Questo li rende più facili da ottimizzare in modo iterativo.

Gli ultimi anni hanno anche visto un afflusso di analisi multiomiche avanzate dello sviluppo delle cellule T umane come avviene in vivo. Studi in vivo ed esperimenti di differenziazione in vitro hanno mostrato collettivamente che il successo della differenziazione delle cellule T e le proprietà funzionali delle cellule T risultanti dipendono dalla tempistica e dall'entità di un piccolo insieme di programmi regolatori chiave, tra cui Notch-, TCR - e segnalazione di citochine. Le piattaforme di differenziazione definite offrono l'opportunità unica e tempestiva di manipolare con precisione questi percorsi chiave, ponendo le basi per un'era di rapidi progressi nella produzione di cellule T. 

Prevediamo che due approcci fondamentali lavoreranno di concerto per realizzare questa visione: la bioingegneria e la biologia sintetica. Di seguito, forniamo una prospettiva su alcune delle opportunità più interessanti per far progredire la produzione di cellule T derivate da PSC controllando i tempi e la forza dei programmi di segnalazione chiave ingegnerizzando la nicchia estrinseca cellulare e i programmi genetici intrinseci cellulari.

Ingegneria della segnalazione delle citochine per migliorare l'efficienza della differenziazione e ridurre i costi

Lo sviluppo delle cellule T da HSPC richiede l'attivazione di una raccolta di recettori delle citochine, avviando una cascata di eventi di trasduzione del segnale che alla fine attivano e reprimono una raccolta di programmi di fattori di trascrizione che guidano le cellule in avanti attraverso lo sviluppo. IL-7 e FLT3L sono entrambi essenziali per lo sviluppo delle cellule T. Ulteriori citochine possono potenziare o accelerare questo processo. Le cascate di trasduzione del segnale ed i programmi di espressione genica che mediano l'effetto di queste citochine dipendono dal contesto e condividono nodi sovrapposti con altri processi di segnalazione cellulare. Ciò rende estremamente difficile valutare l'impatto dell'alterazione del dosaggio e dei tempi delle citochine esogene. Ottenere i livelli dinamici delle citochine giusti ha importanti implicazioni per il successo clinico delle organizzazioni di differenziazione delle cellule T. I dosaggi sbagliati di citochine possono guidare le cellule verso destini alternativi o bloccare completamente la differenziazione. 

Ingegneria di nicchia della segnalazione di citochine

Per affrontare questa sfida, noi e altri abbiamo utilizzato con successo la progettazione statistica di esperimenti per esplorare rapidamente e in modo completo lo spazio delle combinazioni di citochine. È importante sottolineare che incoraggiamo l'uso di modelli che possono tenere conto del cambiamento dei requisiti di citochine nel tempo. Comprendendo le relazioni antenato-progenie durante la differenziazione, è possibile applicare l'apprendimento statistico multistadio per massimizzare i rendimenti dei tipi di cellule intermedie e terminali nel corso di un lungo processo di sviluppo. 

Un approccio tipico consiste nell'utilizzare uno dei numerosi modelli statistici per scegliere un insieme limitato di combinazioni di dosaggio di citochine per un periodo di tempo fisso nel processo di differenziazione. Le citochine di interesse potrebbero essere selezionate manualmente dalla letteratura od identificate utilizzando schermi ad alto rendimento di knockout del recettore o interazioni di segnalazione cellula-cellula. I rendimenti di una popolazione target vengono quantificati, spesso utilizzando la citometria a flusso per una serie di marcatori di superficie che definiscono lo stato cellulare. Successivamente, viene costruito un modello basato sulle combinazioni di citochine campionate ed estrapolato nello spazio dei parametri non testato. Le concentrazioni ottimali di citochine sono previste e quindi convalidate sperimentalmente per la loro capacità di aumentare la resa dell'immunofenotipo target a ciascun intervallo. 

In futuro, proponiamo lo screening per le condizioni che massimizzano la resa delle cellule con le proprietà funzionali desiderate come l'uccisione delle cellule bersaglio, la secrezione di citochine citotossiche, la proliferazione e la persistenza, in opposizione ai fenotipi della superficie cellulare. In definitiva, l'obiettivo dell'immunoterapia con cellule T è quello di sradicare il cancro in modo sicuro ed efficace. La produzione di cellule derivate da PSC con un profilo di espressione del marcatore di superficie che corrisponda alle cellule T primarie è un primo passo importante e la realizzazione di un prodotto "simile a cellule T" faciliterà il percorso verso l'approvazione normativa. Ma non è chiaro se le cellule derivate da PSC che fenotipicamente assomigliano alle cellule αβT convenzionali siano effettivamente la migliore popolazione per l'immunoterapia.

In alternativa, le cellule derivate da PSC che assomigliano ad altri tipi linfoidi come le cellule NK, NK invarianti o γδT possono essere superiori in alcuni contesti terapeutici. È concepibile che le celle più utili potrebbero anche non mostrare una chiara somiglianza con alcun equivalente primario. Man mano che la nostra conoscenza clinica cresce, troveremo migliori correlazioni fenotipiche e funzionali con il successo terapeutico. Questi nuovi marcatori possono fungere da obiettivi per ottimizzare le condizioni di differenziazione in vitro .

Ingegneria cellulare della segnalazione delle citochine

Per completare questa strategia di sviluppo dinamico dei media, gli approcci di biologia sintetica potrebbero essere utilizzati per scrivere programmi di differenziazione nel genoma delle cellule staminali. Sebbene le strategie di biologia sintetica non siano state ancora applicate ampiamente alla differenziazione delle cellule T, le strategie di interesse includono la "programmazione in avanti" - l'espressione controllata di fattori di trascrizione che imitano le traiettorie di sviluppo;  o ingegnerizzare le cellule differenzianti per esprimere e secernere fattori che possono impegnarsi con i programmi di segnalazione del recettore endogeno delle cellule per promuovere la differenziazione.

Poiché le citochine devono essere dosate e cronometrate in modo appropriato per una differenziazione di successo, tecniche di sovraespressione di citochine grezze hanno quindi ottenuto un successo limitato. I recenti progressi nella biologia sintetica stanno consentendo un controllo preciso del dosaggio e della tempistica dell'espressione genica utilizzando induttori di piccole molecole, optogenetica, recettori sintetici e microRNA. Recentemente abbiamo dimostrato la fattibilità di questa strategia utilizzando un modello PSC di gastrulazione.

Abbiamo ingegnerizzato le cellule staminali per esprimere e secernere BMP4, un fattore che viene tipicamente aggiunto in modo esogeno per promuovere la differenziazione dello strato germinale. Mettendo a punto i livelli di espressione di BMP4 utilizzando siti target di microRNA sintetici, siamo stati in grado di controllare con precisione l'esito della differenziazione e abbiamo completamente eliminato la necessità di BMP4 esogeno. Man mano che il campo fa passi da gigante per affrontare le continue sfide della consegna di grandi carichi utili, editing fuori bersaglio e silenziamento trascrizionale, il controllo sintetico sulla differenziazione cellulare diventa una strategia di produzione sempre più plausibile.

Creare le cellule T giuste controllando l'ampiezza e la tempistica della segnalazione TCR

I recenti progressi hanno consentito un'efficiente differenziazione dei CD8+ funzionali, cellule T effettrici dalle PSC con loci TCR nella configurazione della linea germinale. Tuttavia, quando le PSC iniziali comprendono un TCR completamente ricombinato o esprimono costitutivamente un CAR, questi protocolli di differenziazione tendono a produrre cellule con proprietà funzionali simili a quelle innate invece delle cellule αβT convenzionali. Una limitazione correlata è che i protocolli di differenziazione chimicamente definiti possono produrre cellule T effettrici CD8+, ma la differenziazione definita delle cellule T helper CD4+ funzionali non è stata ancora dimostrata. Entrambi questi problemi derivano da un problema sottostante comune: l'incapacità di fornire i tempi e l'entità corretti della segnalazione TCR in vitro.

Superare i segnali prematuri simili a TCR per creare cellule T convenzionali

Uno studio recente ha fatto l'interessante osservazione che la segnalazione TCR prematura (che può essere impartita da un TCR o CAR pre-riorganizzato) può smorzare l'attività del percorso di Notch. Ciò aumenta la soglia dei segnali di ingresso Notch necessari per promuovere lo sviluppo delle cellule T convenzionali. Questo modello aiuta anche a spiegare i fenomeni noti secondo cui le cellule γδT, che producono un TCR completamente formato all'inizio dello sviluppo, richiedono livelli più elevati di segnali di input Notch per differenziarsi con successo. Pertanto, è probabile che una gestione attenta della complessa interazione tra la segnalazione Notch e TCR sia molto importante per un'efficiente differenziazione in vitro delle cellule T che ospitano un TCR o CAR ingegnerizzato.

Riconoscendo questo fenomeno, gli autori hanno elegantemente dimostrato che il targeting del CAR nel locus TRAC, che ritarda l'espressione del CAR fino a dopo la selezione beta, fornisce il giusto tempismo per l'espressione completa del TCR e rende le cellule più simili alle cellule T αβ quando accoppiate con un'espressione adeguatamente forte Legante di tacca. Ciò può essere ulteriormente migliorato modificando i domini costimolatori per avvicinare l'ampiezza della segnalazione CAR a un intervallo fisiologicamente rilevante. Sebbene si tratti di un passaggio importante, le cellule T risultanti mostravano ancora un fenotipo non convenzionale, producendo livelli significativamente inferiori di citochine effettrici rispetto alle cellule T primarie. 

Trovare un modo per destreggiarsi con precisione tra la segnalazione TCR e Notch nel tempo di sviluppo potrebbe consentire la produzione di celle convenzionali da iPSC progettate per esprimere CAR e TCR. Sul lato del segnale TCR, ciò può essere ottenuto inserendo TCR in buona fede nel locus TRAC, piuttosto che CAR, corrispondenti ai livelli di segnalazione fisiologici. I tempi di attivazione CAR possono essere regolati utilizzando i design split-CAR; per esempio, separando l'scFV dai domini intracellulari o separando diversi moduli del dominio intracellulare.  Queste diverse architetture CAR possono essere indotte a dimerizzare dall'utente, consentendo l'attivazione specifica del CAR in un punto temporale di interesse durante la differenziazione.

Per quanto riguarda il controllo della segnalazione di Notch, è possibile sviluppare ligandi di Notch più forti attraverso l'evoluzione proteica in vitro , come è stato recentemente dimostrato da Gonzalez-Perez et al., o attraverso l'uso di leganti alternativi ad alta affinità come gli anticorpi che attivano Notch legato a perline o biomateriali ( Fig. 3A ). In alternativa, i segnali Notch artificiali potrebbero essere forniti utilizzando approcci di biologia sintetica che aggirano l'attivazione meccanica a livello della membrana cellulare. Ad esempio, sovraesprimendo una forma costitutivamente attiva di Notch, oppure la fusione del partner di legame al DNA di Notch, RBPJ, con un generico attivatore trascrizionale come VP64 può fornire una segnalazione di Notch sufficientemente forte da contrastare gli effetti repressivi di un CAR ( Fig. 3A ).

Sbloccare lo sviluppo delle cellule T CD4 con l'ingegneria di nicchia e la biologia sintetica

Finora i protocolli di differenziazione delle cellule T definiti non sono riusciti a generare cellule T helper CD4+ funzionali. Le cellule CD4+ migliorano l'efficacia della terapia CAR T  e hanno applicazioni per il trattamento di infezioni, autoimmunità e rigetto del trapianto. Pertanto, la produzione di cellule T CD4+ da PSC ha un notevole potenziale traslazionale. Di seguito, descriviamo brevemente la biologia alla base della scelta del lignaggio CD4 rispetto a CD8, quindi suggeriamo diverse strategie mediante le quali questi meccanismi biologici potrebbero essere sfruttati per produrre cellule T CD4 + in vitro.

La decisione di adottare un destino helper CD4 rispetto a un destino effettore CD8 si verifica quando un TCR espresso da un progenitore DP CD4+, CD8+ si impegna con una molecola HLA di classe I o di classe II. Le cellule che si impegnano con successo con le cellule che esprimono HLA-I sono dirette a diventare CD8SP, mentre l'impegno del TCR con HLA-II promuove la differenziazione in CD4SP.  CD8 e CD4 sono molecole costimolatorie che migliorano la segnalazione TCR a valle. L'attivazione del TCR sottoregola l'espressione del CD8 che interrompe la segnalazione per le cellule con restrizione HLA-I. Al contrario, l'espressione di CD4 persiste dopo l'impegno del TCR, portando a un segnale duraturo nelle cellule T limitate HLA-II.

La durata della segnalazione TCR durante questo evento di selezione alla fine determina se le cellule DP diventano cellule CD8 citotossiche o CD4 helper. Negli attuali protocolli di differenziazione delle cellule T in vitro , la selezione positiva viene attivata sviluppando cellule che si selezionano l'una dall'altra, o utilizzando anticorpi contro il complesso TCR. Nell'uomo, l'espressione di HLA-II è ampiamente limitata alle cellule presentanti l'antigene e alle cellule epiteliali del timo, mentre l'HLA-I è ampiamente espresso in tutti i tipi di cellule.  Pertanto, le cellule che subiscono in vitro differenziazione probabilmente hanno accesso a HLA-I su altri progenitori di cellule T in via di sviluppo, ma mancano di una fonte sufficiente di HLA-II che offre una spiegazione per la mancanza di cellule T CD4 + nei protocolli attuali.

Un modo per fornire un segnale TCR appropriato per facilitare la differenziazione del CD4 sarebbe quello di co-coltivare i progenitori delle cellule T in via di sviluppo con cellule presentanti l'antigene primarie o immortalizzate. Questo è un importante vantaggio di tecnologie come la piattaforma ATO, o sistemi di differenziazione che utilizzano cellule epiteliali timiche derivate da PSC. 

Piuttosto che utilizzare materiale vivente per innescare interazioni TCR:HLA-II, le proteine ​​ricombinanti forniscono un'alternativa scalabile e clinicamente traducibile ( Fig. 3B ). Complessi peptide-HLA-II ricombinanti solubili o legati alla piastra possono essere sufficienti per guidare la specificazione del destino CD4 + dai progenitori DP. Ma non è chiaro come la scelta del peptide e dell'allele HLA-II modellerà il repertorio di TCR che possono essere sottoposti con successo a una selezione positiva. Un approccio più generalizzabile che sarebbe agnostico rispetto al TCR stesso consiste nell'utilizzare anticorpi legati alla piastra che leghino simultaneamente la regione della costante TCR e CD4  ( Fig. 3B ).

L'ingegneria cellulare a lungo termine potrebbe essere utilizzata per attivare direttamente la segnalazione TCR a valle. Quando il TCR interagisce con l'MHC, le proteine ​​tirosina chinasi, inclusa la Lck, vengono reclutate nel complesso TCR/CD3. Lck fosforila i motivi di attivazione basati sulla tirosina degli immunorecettori (ITAM) sul dominio citosolico del CD3, che innesca una complessa cascata di segnalazione a valle. Potrebbe essere possibile costruire un sistema di dimerizzazione proteica inducibile per mezzo del quale una piccola molecola esogena innesca il reclutamento di Lck negli ITAM CD3 ( Fig. 3B ). Un approccio simile è stato applicato per rendere l'attivazione di CAR T dipendente da un induttore di piccole molecole.

Evitare sottoprodotti indesiderati per aumentare la resa e la purezza delle cellule T

Un'opportunità interessante per ridurre il costo della produzione di cellule T in vitro è aumentare la purezza e la resa delle popolazioni target desiderate in ogni fase della differenziazione. Sulla strada per la produzione di cellule T, i protocolli specificano prima le PSC nel lignaggio del mesoderma, quindi attraverso un intermedio HE, quindi uno stato HSPC, per poi diventare progenitrici delle cellule T e infine cellule T mature. In ogni fase vengono prodotte popolazioni fuori bersaglio indesiderate.

Questi sottoprodotti cellulari consumano risorse e limitano la resa massima della popolazione target per PSC in ingresso. Le popolazioni fuori bersaglio possono anche competere direttamente con l'intermedio desiderato.  Una soluzione collaudata consiste nell'arricchire per la popolazione target nelle transizioni chiave della cultura. Esemplificando questo approccio, noi e altri selezioniamo abitualmente le cellule CD34 + all'inizio durante la differenziazione mediante separazione magnetica mediata da anticorpi. Ulteriori fasi di arricchimento, come nella fase di progenitore delle cellule T CD7+, probabilmente aumenterebbero la purezza e l'efficienza, ma complicherebbero anche ulteriormente il flusso di lavoro di produzione e potrebbero non ridurre il costo netto del prodotto (Fig. 4 ) .

Come approccio alternativo, una soluzione di ingegneria cellulare consiste nel bloccare l'accesso a traiettorie del destino cellulare indesiderate eliminando geni che sono richiesti per il loro sviluppo ( Fig. 4 ). La potatura dell'albero dello sviluppo in questo modo dovrebbe consentire alle risorse della coltura cellulare di essere indirizzate in modo efficiente verso il supporto dello sviluppo delle cellule T. Esiste già un forte precedente secondo cui l'eliminazione di un importante gene che specifica il destino può migliorare l'efficienza della differenziazione delle cellule T in vitro . Abbattendo EZH1, Jing et al. sono stati in grado di aumentare sostanzialmente la resa della produzione di cellule T CD3 + dalle PSC di circa tre volte rispetto alle condizioni di controllo.

Oltre a bloccare l'accesso a percorsi di sviluppo indesiderati, l'ingegneria cellulare può anche essere applicata per migliorare o accelerare la progressione lungo la traiettoria target. La sovraespressione dei fattori di trascrizione ematopoietica ha consentito o migliorato la differenziazione in vitro di più linee di sangue da fonti di cellule pluripotenti e primarie. Sebbene questo approccio sia progredito a un ritmo modesto nell'ultimo decennio, i recenti progressi nelle tecnologie di screening delle perturbazioni ad alto rendimento sono pronti ad accelerare drasticamente i progressi in questo spazio. 

Sommario e conclusione

Le terapie con cellule T stanno sconvolgendo il modo in cui trattiamo le malattie, ma l'adozione diffusa di questa modalità è limitata dalla nostra capacità di produrre in modo conveniente i giusti tipi di cellule su larga scala. Le PSC sono una soluzione convincente a questa sfida che beneficia di decenni di ricerca fondamentale sullo sviluppo delle cellule T utilizzando protocolli di differenziazione basati sull'alimentatore.

Attualmente, il campo è in transizione verso sistemi di differenziazione bioingegneristici definiti chimicamente. Non solo questi approcci contemporanei sono più facilmente traducibili in clinica, ma consentono anche un controllo molto più preciso sui livelli e sui tempi degli input di segnalazione durante la differenziazione. Lo sviluppo delle cellule T da PSC segue un complesso processo a più stadi che dipende da un'orchestra di segnali attentamente bilanciata e la bioingegneria è adatta a riprodurre accuratamente questo processo in vitro .

Prevediamo che la biologia sintetica guiderà il prossimo grande cambiamento nella produzione di cellule T dalle PSC. Miglioramenti paralleli nella nostra comprensione fondamentale della differenziazione delle cellule T e la nostra capacità di controllare sinteticamente la funzione cellulare stanno ponendo le basi per terapie cellulari più efficienti ed economiche. In definitiva, la nostra capacità di generare più sottotipi di cellule T su larga scala consentirà nuove strategie terapeutiche in oncologia ed oltre.

Da:

https://www.liebertpub.com/doi/10.1089/genbio.2023.0008?utm_campaign=GENBIO+FP+Apr+19+2023&utm_content=ReadMore-2&utm_term=&utm_medium=email&utm_source=Adestra