Microscopia adattativa a contrasto di fase per compensare l'effetto del menisco / Adaptive phase contrast microscopy to compensate for the meniscus effect

 Microscopia adattativa a contrasto di fase per compensare l'effetto del menisco / Adaptive phase contrast microscopy to compensate for the meniscus effect

Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa

Rappresentazione schematica del percorso di illuminazione in un microscopio a contrasto di fase con diverse posizioni dei pozzetti. ( A ) Percorso ottico semplificato attraverso il microscopio (sono stati omessi elementi non attivi come specchi deflettori e lastre di vetro). (1) Sorgente luminosa (2) Anello del condensatore (3) Lente del condensatore (5) MTP (6) Lente dell'obiettivo (7) Anello di fase (8) Specchio mobile (9) Lente di Bertrand (10) Lente oculare (11) Fotocamera secondaria ( 12) Lente tubolare (13) Fotocamera principale. Spostando lo specchio (8), è possibile commutare tra il percorso ottico principale (I) e il percorso ottico secondario (II) per osservare la sovrapposizione dell'anello di fase e dell'anello del condensatore. ( B ) La luce passa attraverso il centro del pozzo. ( B.1 ) Immagine di sovrapposizione dell'anello di fase e dell'anello del condensatore. Si sovrappongono completamente. (B.2 ) Immagine risultante in contrasto di fase della coltura cellulare. ( C ) A causa della curvatura della superficie verso il bordo del pozzo, il raggio luminoso viene rifratto allontanandosi dal centro. ( C.1 ) Nell'immagine di sovrapposizione è visibile la deviazione tra l'anello del condensatore (2) e l'anello di fase (7). ( C.2 ) L'immagine della cella risultante viene quindi acquisita in condizioni di campo chiaro. Le immagini ( A.2 ) e ( B.2 ) sono state scattate con un obiettivo 10x (Nikon CFI Plan Fluor DL ​​10XF) in un MTP a 6 pozzetti. / Schematic representation of the illumination path in a phase contrast microscope with different well positions. (A) Simplified light path through the microscope (non-active elements such as deflecting mirrors and glass plates have been omitted). (1) Light source (2) Condenser annulus (3) Condenser lens (5) MTP (6) Objective lens (7) Phase ring (8) Movable mirror (9) Bertrand lens (10) Ocular lens (11) Secondary camera (12) Tube lens (13) Main camera. By moving the mirror (8), it can be switched between the main light path (I) and the secondary light path (II) to observe the phase ring and condenser annulus overlap. (B) Light passes through the center of the well. (B.1) Superposition image of phase ring and condenser annulus. They completely overlap. (B.2) Resulting phase contrast image of cell culture. (C) Due to the curvature of the surface towards the edge of the well, the light beam is refracted away from the center. (C.1) In the superposition image, the deviation between the condenser annulus (2) and the phase ring (7) is visible. (C.2) The resulting cell image is thus taken under brightfield conditions. Images (A.2) and (B.2) were taken with a 10x Objective (Nikon CFI Plan Fluor DL 10XF) in a 6-well MTP.

Riassunto

Il contrasto di fase è uno dei metodi microscopici più importanti per rendere visibili cellule trasparenti e non colorate. Le colture cellulari sono spesso coltivate in piastre di microtitolazione, costituite da diversi pozzetti cilindrici. La tensione superficiale del mezzo di coltura forma una lente liquida all'interno del pozzetto, causando il fallimento delle condizioni di contrasto di fase nelle aree dei bordi più curvi, impedendo l'osservazione cellulare. La microscopia adattativa a contrasto di fase è un metodo per aumentare notevolmente l'area osservabile compensando otticamente l'effetto del menisco. L'annulus del condensatore del microscopio è sostituito da un LCD trasmissivo per consentire cambiamenti dinamici. Un prisma deformabile, riempito di liquido, è posizionato nel percorso di illuminazione. L'angolo della superficie del prisma è adattativamente inclinato per rifrangere la luce trasmessa in modo che l'angolo tangenziale della lente liquida possa essere compensato. Oltre all'osservazione dell'immagine in contrasto di fase, un beam splitter consente di visualizzare simultaneamente l'annulus del condensatore e lo spostamento dell'anello di fase. Gli algoritmi analizzano lo spostamento per regolare dinamicamente l'LCD e il prisma per garantire condizioni di contrasto di fase. Gli esperimenti mostrano un aumento significativo dell'area osservabile, specialmente per pozzi di piccole dimensioni. Per le piastre a 96 pozzetti, più di dodici volte l'area può essere esaminata in condizioni di contrasto di fase invece della microscopia a contrasto di fase standard.

Introduzione

La microscopia a contrasto di fase proposta per la prima volta nel 1932 da Frits Zernike è un metodo ampiamente utilizzato per osservare campioni biologici perché può rendere visibili cellule trasparenti e non colorate. A causa dell'interferenza, gli sfasamenti della luce passante possono essere resi visibili per aumentare il contrasto negli oggetti semitrasparenti.

Tuttavia, le sue applicazioni sono limitate dall'effetto del menisco, che interessa in particolare i campioni in micropiastre con 96 o più pozzetti. Le misure di riferimento hanno mostrato che nelle piastre a 6 pozzetti, le condizioni di contrasto di fase possono essere trovate nel 25% (235 mm 2  di 950 mm 2 ) dell'area superficiale del pozzetto. Nelle piastre a 96 pozzetti, è solo del 2,3% (0,84 mm 2  su 36,3 mm 2 ) .

Microscopia a contrasto di fase

Il contrasto di fase è un metodo di microscopia a luce trasmessa in cui un anello condensatore è posizionato nel percorso del raggio di illuminazione e la luce nell'obiettivo è guidata attraverso un anello di fase (si veda la figura 1  ) . Se l'immagine dell'anello del condensatore e l'anello di fase si sovrappongono, si verificano condizioni di contrasto di fase. Gli sfasamenti si verificano in corrispondenza delle transizioni nel campione osservato, come i confini delle cellule, che vengono evidenziati otticamente. Le condizioni di contrasto di fase possono essere facilmente identificate dall'effetto "halo", che è una regione con uno sfondo scuro e bordi luminosi attorno agli oggetti in sfasamento.

I campioni biologici sono solitamente in un mezzo liquido. Una superficie liquida piatta è essenziale per una buona sovrapposizione dell'anello del condensatore e dell'anello di fase, come mostrato in Fig.  1 B,C. Questa sovrapposizione dell'anello del condensatore e dell'anello di fase può essere osservata tramite un'unità dell'obiettivo Bertrand e una telecamera secondaria.

L'effetto menisco

Le cellule sono spesso coltivate in recipienti standardizzati come le piastre per microtitolazione (MTP), che sono costituite da più pozzetti. La curvatura della superficie del mezzo di coltura in ciascun pozzetto crea una lente liquida a causa delle forze capillari sulla parete del vaso, come mostrato in Fig.  1 . La superficie curva devia la luce in entrata e quindi impedisce una sovrapposizione dell'anello del condensatore e dell'anello di fase. Il contrasto di fase fallisce in particolare nelle aree dei bordi più fortemente curve di questa lente, quindi le cellule in queste aree non possono essere visualizzate.

La forma esatta del menisco può essere approssimata integrando numericamente l'equazione di Young-Laplace. Minore è il diametro di un pozzo, maggiore diventa l'influenza delle forze capillari sulla parete a causa dell'aumento del rapporto tra circonferenza e superficie. Di conseguenza, la proporzione della superficie liquida piatta al centro del recipiente diminuisce. La maggiore curvatura lungo i bordi del pozzo si traduce in un angolo di rifrazione maggiore, che a sua volta aumenta la distorsione e gli spostamenti della luce dell'anello del condensatore che impedisce la sovrapposizione dell'anello.

Obiettivi

La microscopia adattativa a contrasto di fase mira ad aumentare notevolmente l'area osservabile compensando otticamente l'effetto del menisco. L'obiettivo di questa configurazione è aumentare l'area di contrasto di fase di un pozzo a un valore vicino al limite fisico, che è impostato dall'angolo di superficie per la riflessione totale. La soluzione deve essere un dispositivo compatto che può essere aggiunto ad un microscopio disponibile in commercio senza molta preparazione. Inoltre, dovranno essere utilizzate micropiastre standard al posto delle piastre speciali introdotte. Si desidera la completa automazione del processo per visualizzare interi pozzi senza interferenze umane. Pertanto, questo documento introduce un approccio completamente automatizzato che può essere incluso nei microscopi standard disponibili in commercio.

Approcci concorrenti

A causa dell'importanza delle immagini al microscopio a contrasto di fase delle cellule nelle piastre di microtitolazione, in passato sono state sviluppate varie soluzioni che affrontano il problema dell'effetto del menisco. Tali approcci possono generalmente essere raggruppati nelle seguenti categorie: prevenire la formazione di un menisco, correggere otticamente gli effetti del menisco negli MTP, ridurre l'effetto sulle immagini in modo computazionale e microscopi che compensano otticamente l'effetto del menisco. La configurazione presentata in questo documento appartiene all'ultima categoria.

Le possibilità per prevenire la formazione del menisco vanno dalle micropiastre rivestite idrofobicamente ai coperchi che spingono verso il basso la superficie del solvente in modo che sia piatta. Invece di modifiche dirette della micropiastra, esistono inserti in plastica per l'uso in singoli pozzetti standard.

Un'altra applicazione sono gli MTP con coperchi sagomati in modo tale da funzionare essi stessi come un prisma e quindi compensare la diffrazione causata dall'effetto del menisco. Tali coperchi, tuttavia, funzionano solo per un mezzo cellulare specifico con un indice di rifrazione definito.

Oltre all'hardware speciale, esistono anche approcci computazionali per la compensazione dell'effetto del menisco, come migliorare il contrasto confrontando diverse immagini, ad esempio su diversi piani z. Altri metodi utilizzano immagini in campo chiaro, che vengono modificate da algoritmi di intelligenza artificiale per produrre immagini a contrasto di fase. Quelle immagini, tuttavia, non raggiungono la stessa qualità delle immagini a contrasto di fase reale.

Infine, ci sono approcci per compensare l'effetto del menisco nel percorso ottico del microscopio, come quello proposto in questo articolo. Una soluzione suggerita è quella di deformare e spostare in modo adattativo un anello del condensatore virtuale secondo la superficie del liquido in modo che dopo essere passato attraverso il menisco venga rifratto in modo tale da assomigliare nuovamente ad un anello non distorto. Per creare l'annulus del condensatore virtuale, viene utilizzato un display a cristalli liquidi (LCD). Questo aspetto, vale a dire lo spostamento della forma dell'anello del condensatore, è presentato anche in questo articolo. Tuttavia, il principio di base spiegato da questo documento utilizza anche un prisma liquido deformabile per questo scopo. È protetto dal brevetto europeo EP 3 323 010 B1 di proprietà della Fraunhofer Gesellschaft.

Un altro approccio consiste nell'integrare un modulatore di luce spaziale nel percorso del raggio anziché nell'LCD. In particolare, i modulatori di luce spaziale riflettente hanno una densità di pixel e un rapporto di contrasto molto elevati. Tuttavia, la loro integrazione è molto più complessa, poiché la dimensione del chip è solitamente molto più piccola dell'anello del condensatore da visualizzare. Anche i modulatori di luce spaziale trasmissivi hanno una piccola area attiva, anche se esistono ulteriori possibilità per distorcere l'anello del condensatore. Un dispositivo a specchio digitale può anche essere utilizzato al posto di un modulatore di luce spaziale.

Ancora un altro approccio è quello di spostare meccanicamente orizzontalmente l'anello del condensatore. Ciò assicura lo stesso elevato contrasto e intensità luminosa della normale microscopia a contrasto di fase. Tuttavia, è lento e richiede una meccanica complessa.

Metodi

Per dimostrare il concetto di microscopia adattativa a contrasto di fase, è stato costruito un dimostratore che include i componenti principali, un anello condensatore LCD e un prisma pieno di liquido. È stato quindi utilizzato per esperimenti per confrontare la microscopia normale con quella adattiva a contrasto di fase. I dettagli più importanti della configurazione sono presentati di seguito.

Discussione

L'aumento relativo dell'area osservabile è significativo per tutte le dimensioni dei pozzetti esaminati. Varia da quasi il doppio per le piastre a 6 pozzetti a più di 12 volte per le MTP a 96 pozzetti. L'aumento dell'area osservabile è maggiore per le dimensioni del pozzetto più piccole perché l'area relativa che può essere ripresa con il contrasto di fase diminuisce con il diametro del pozzetto. I pozzetti più piccoli negli esperimenti erano quelli delle piastre da 96 pozzetti. Non è chiaro se la tendenza continui per pozzi ancora più piccoli perché l'area osservabile di pozzetti di piastre da 96 pozzetti è già solo del 2,3% e potrebbe non diminuire ulteriormente in modo significativo. Inoltre, i formati più piccoli come le piastre da 384 pozzetti di solito usano pozzetti rettangolari invece di quelli rotondi visti in formati più grandi. Tuttavia, a causa dell'approccio di adattamento, si presume che le condizioni di contrasto di fase possano essere migliorate anche per pozzi non circolari.

Esistono già una moltitudine di approcci di compensazione del menisco. Tuttavia, la maggior parte di essi è progettata per funzionare con uno specifico terreno di coltura cellulare in condizioni predefinite. Pertanto, non sono robusti in circostanze mutevoli o con mezzi diversi. Inoltre, richiedono piastre per microtitolazione, coperchi o inserti speciali che sono significativamente più costosi delle piastre per microtitolazione standard. Le piastre per microtitolazione vengono solitamente utilizzate in grandi quantità e sono progettate come prodotti usa e getta, quindi l'uso di prodotti standard economici è vantaggioso.

La microscopia adattativa a contrasto di fase offre un approccio flessibile per compensare l'effetto del menisco che inoltre funziona con l'hardware di laboratorio convenzionale. La tecnologia presenta numerosi vantaggi rispetto agli approcci concorrenti, come evidenziato dai risultati sperimentali. In particolare, consente un aumento significativo dell'area osservabile in contrasto di fase. Grazie alla sua adattabilità e flessibilità, può essere utilizzato con diversi liquidi con diversi indici di rifrazione. Non richiede nemmeno MTP ma è applicabile a tutti i recipienti riempiti di liquido che si adattano ai microscopi inversi. Poiché l'adattatore per contrasto di fase può essere semplicemente installato in un normale microscopio inverso, la maggior parte delle funzioni standard sono ancora disponibili fornendo al contempo una maggiore area osservabile con la microscopia a contrasto di fase. Inoltre,

Questi vantaggi si applicano anche all'approccio di Douglas che utilizza solo l'annulus del condensatore digitale. Tuttavia, questo da solo non è sufficiente per compensare la rifrazione vicino al bordo, specialmente quando l'angolo della superficie del liquido è ripido. Può solo compensare lo spostamento laterale dei raggi di luce , ma non la rotazione angolare .

Tutte le immagini per una serie di immagini sono state sempre scattate sullo stesso piano focale. Per migliorare l'acuità, i lavori futuri basati su questa tecnologia dovrebbero incorporare un meccanismo di correzione della messa a fuoco. Tuttavia, l'attuale configurazione era sufficiente per creare immagini espressive come presentato sopra.

Uno svantaggio dell'approccio presentato è la lenta acquisizione delle immagini. Poiché un numero crescente di laboratori diventa automatizzato e richiede una maggiore produttività, è necessario un rapido processo di acquisizione. Un approccio per accelerare il processo di contrasto di fase adattivo sarebbe quello di acquisire immagini durante il movimento del campione, che è già stato dimostrato per la normale microscopia a contrasto di fase. Si prevede di valutare questo approccio in un futuro progetto di ricerca.

Conclusione

La microscopia adattativa a contrasto di fase consente di aumentare significativamente l'area in cui è applicabile la microscopia a contrasto di fase. Sono stati eseguiti studi quantificabili utilizzando piastre per microtitolazione. L'area osservabile è stata misurata e confrontata con la microscopia a contrasto di fase convenzionale. In tutti i casi è stato mostrato un aumento significativo dell'area osservabile, con un effetto maggiore su pozzi più piccoli a causa di un effetto menisco più pronunciato. Per le piastre a 96 pozzetti, l'area utilizzabile è aumentata di oltre 12 volte, da circa il 2,3% dell'area totale del pozzetto a circa il 28%, rendendo così la microscopia a contrasto di fase un'opzione praticabile per la scansione non invasiva delle colture cellulari.

Inoltre, la soluzione può essere completamente automatizzata in modo da renderne possibile l'integrazione in un processo automatico. Contrariamente ad altri metodi per compensare l'effetto del menisco, non è richiesto alcun hardware di laboratorio speciale, ma è possibile utilizzare micropiastre standard.

Per questi motivi, l'approccio presentato ha il potenziale per estendere notevolmente l'area di applicazione della microscopia a contrasto di fase, soprattutto se il tempo di imaging può essere ridotto.

ENGLISH

Abstract

Phase contrast is one of the most important microscopic methods for making visible transparent, unstained cells. Cell cultures are often cultivated in microtiter plates, consisting of several cylindrical wells. The surface tension of the culture medium forms a liquid lens within the well, causing phase contrast conditions to fail in the more curved edge areas, preventing cell observation. Adaptive phase contrast microscopy is a method to strongly increase the observable area by optically compensating for the meniscus effect. The microscope’s condenser annulus is replaced by a transmissive LCD to allow dynamic changes. A deformable, liquid-filled prism is placed in the illumination path. The prism’s surface angle is adaptively inclined to refract transmitted light so that the tangential angle of the liquid lens can be compensated. Besides the observation of the phase contrast image, a beam splitter allows to simultaneously view condenser annulus and phase ring displacement. Algorithms analyze the displacement to dynamically adjust the LCD and prism to guarantee phase contrast conditions. Experiments show a significant increase in observable area, especially for small well sizes. For 96-well-plates, more than twelve times the area can be examined under phase contrast conditions instead of standard phase contrast microscopy.

Introduction

Phase contrast microscopy first proposed in 1932 by Frits Zernike is a widely used method to observe biological samples because it can make transparent, unstained cells visible. Due to interference, phase shifts of passing light can be made visible to increase contrast in semi-transparent objects.

However, its applications are limited by the meniscus effect, which particularly affects samples in microplates with 96 or more wells. Reference measurements have shown that in 6-well-plates, phase contrast conditions can be found in 25% (235 mm2 of 950 mm2) of the well surface area. In 96-well-plates, it is only 2.3% (0.84 mm2 of 36.3 mm2).

Phase contrast microscopy

Phase contrast is a transmitted light microscopy method in which a condenser annulus is placed in the illumination beam path, and the light in the objective is guided through a phase ring (see Fig. 1). If the condenser annulus image and phase ring overlap, phase contrast conditions arise. Phase shifts occur at transitions in the observed specimen, such as cell boundaries, which are optically highlighted. Phase contrast conditions can be easily identified by the "halo" effect, which is a region with a dark background and bright edges around phase shifting objects.

Biological samples are usually in a liquid medium. A flat liquid surface is essential for a good superposition of the condenser annulus and phase ring, as seen in Fig. 1 B,C. This superposition of condenser annulus and phase ring can be observed via a Bertrand lens unit and a secondary camera.

The meniscus effect

Cells are often cultivated in standardized vessels such as microtiter plates (MTP), which consist of multiple wells. The surface curvature of the culture medium in each well creates a liquid lens due to capillary forces on the vessel wall, as shown in Fig. 1. The curved surface deflects the incoming light and therefore prevents a superposition of the condenser annulus and phase ring. The phase contrast fails particularly in the more strongly curved edge areas of this lens, thus cells in these areas cannot be imaged.

The exact shape of the meniscus can be approximated by numerically integrating the Young–Laplace equation. The smaller the diameter of a well, the higher the influence of the capillary forces at the wall becomes relatively due to the increasing circumference-to-surface area ratio. Consequently, the proportion of the flat liquid surface in the center of the vessel decreases3. The greater curvature along the well’s edges results in a larger refraction angle, which in turn increases the distortion and displacements of the condenser annulus light that prevents ring superposition.

Objectives

Adaptive phase contrast microscopy aims to strongly increase the observable area by optically compensating for the meniscus effect. This setup’s goal is to increase the phase contrast area of a well to a value close to the physical limit, which is set by the surface angle for total reflection. The solution shall be a compact device that can be added to a commercially available microscope without much preparation. Moreover, standard microplates shall be used instead of special plates introduced in “Competing approaches”. Full automation of the process is desired to image whole wells without human interference. Therefore, this paper introduces a fully automated approach that can be included in commercially available standard microscopes.

Competing approaches

Due to the importance of phase contrast microscope images of cells in microtiter plates, various solutions have been developed in the past that address the problem of the meniscus effect. Those approaches can generally be grouped into the following categories: preventing a meniscus from forming, optically correcting the meniscus effects in the MTPs, reducing the effect on images computationally, and microscopes that optically compensate for the meniscus effect. The setup presented in this paper belongs to the last category.

Possibilities to prevent the meniscus from forming range from hydrophobically coated microplates to lids that push down the solvent’s surface so that it is flat. Instead of direct modifications of the microtiter plate, plastic inserts for use in individual standard wells exist.

Another application are MTPs with lids that are shaped such that they work as a prism themselves and thus compensate for the diffraction caused by the meniscus effect. Those lids, however, only work for one specific cell medium with a defined refractive index.

Besides special hardware, computational approaches for meniscus effect compensation also exist, such as enhancing contrast by comparing several images, for instance at different z-planes. Other methods use bright-field images, which are modified by artificial intelligence algorithms to produce phase-contrast-like images. Those images, however, do not reach the same quality as real phase contrast images.

Finally, there are approaches to compensate the meniscus effect in the optical path of the microscope, like the one proposed in this paper. One suggested solution is to adaptively deform and displace a virtual condenser annulus in accordance to the liquid surface so that after passing through the meniscus it is refracted such that it resembles an undistorted ring again. To create the virtual condenser annulus, a liquid crystal display (LCD) is used. This aspect, namely the displacement of the condenser annulus shape, is also presented in this paper. However, the basic principle explained by this paper additionally uses a deformable liquid prism for this purpose. It is protected by European patent EP 3 323 010 B1 which is the property of Fraunhofer Gesellschaft.

Another approach is to integrate a spatial light modulator into the beam path instead of the LCD. In particular, reflective spatial light modulators have very high pixel density and contrast ratio. However, their integration is much more complex, since the chip size is usually much smaller than the condenser annuli to be displayed. Transmissive spatial light modulators also have a small active area, even though further possibilities exist for distorting the condenser annulus. A digital mirror device can also be used instead of a spatial light modulator.

Yet another approach is to mechanically move the condenser annulus horizontally. This assures the same high contrast and light intensity as regular phase contrast microscopy. However, it is slow and requires complex mechanics.

Discussion

The relative increase in observable area is significant for all examined well sizes. It ranges from almost doubling for 6-well-plates to more than 12-fold for 96-well MTPs. The increase in observable area is largest for smaller well sizes because the relative area that can be imaged with phase contrast decreases with the well diameter. The smallest wells in the experiments were those of 96-well-plates. It is not clear if the trend continues for even smaller wells because the observable area of wells of 96-well-plates is already only 2.3% and might not further decrease significantly. Moreover, smaller formats like 384-well-plates usually use rectangular wells instead of the round ones seen in larger formats. Yet, due to the adaptation approach, it is assumed that phase contrast conditions can also be enhanced for noncircular wells.

 A multitude of meniscus compensation approaches already exist. However, most of them are designed to work with one specific cell culture medium under pre-defined conditions. Thus, they are not robust under changing circumstances or with different mediums. Moreover, they require special microtiter plates, lids, or inserts that are significantly more expensive than standard microtiter plates. Microtiter plates are usually used in large quantities and are designed as disposable products, so the use of cost-effective standard products is advantageous.

Adaptive phase contrast microscopy offers a flexible approach to compensate for the meniscus effect that moreover works with conventional laboratory hardware. The technology exhibits several advantages over competing approaches, as evidenced by experimental results. Specifically, it enables a significant increase in the observable area in phase contrast. Due to its adaptability and flexibility, it can be used with different liquids with varying refractive indices. It does not even require MTPs but is applicable for all liquid filled vessels that fit on inverse microscopes. Because the phase contrast adapter can simply be installed in a regular inverse microscope, most standard functions are still available while providing an increased observable area with phase contrast microscopy. Furthermore, this approach also offers a viable non-invasive alternative to fluorescence microscopy.

These advantages also apply to Douglas’ approach which only uses the digital condenser annulus. However, this alone is not sufficient to compensate for refraction close to the edge, especially when the liquid surface angle is steep. It can only compensate for the light beams’ lateral displacement, but not the angular rotation.

All images for one image series were always taken at the same focal plane. To improve acuity, future works that build on this technology should incorporate a focus correction mechanism. Yet, the current setup was sufficient to create expressive images as presented above.

One drawback of the presented approach is the slow image acquisition. Since an increasing number of laboratories become automated and require higher throughput, a fast acquisition process is necessary. One approach to speed up the adaptive phase contrast process would be to acquire images during sample movement, which has already been shown for regular phase contrast microscopy. It is planned to assess this approach in a future research project.

Conclusion

Adaptive phase contrast microscopy makes it possible to significantly increase the area in which phase contrast microscopy is applicable. Quantifiable studies were performed using microtiter plates. The observable area was measured and compared to conventional phase contrast microscopy. A significant increase in the observable area was shown for all cases, with a larger effect on smaller wells due to a more pronounced meniscus effect. For 96-well-plates, the usable area is increased more than 12-fold, from about 2.3% of the total well area to about 28%, thus making phase contrast microscopy a viable option for non-invasive scanning of cell cultures.

Moreover, the solution can be fully automated so that integration in an automatic process is possible. Contrary to other methods to compensate for the meniscus effect, no special laboratory hardware is required, but standard microplates can be used.

Due to these reasons, the presented approach has the potential to extend the application area of phase contrast microscopy greatly, especially if the imaging time can be reduced.

Da:

https://www.nature.com/articles/s41598-023-32917-6?fbclid=IwAR1cVv3LAB75E5wugN9-veiFWPgkZo-64v5XdFMqrQJzgdhyIr242wS8Rrk