Use of Advanced Flow Cytometry to Accelerate Antibody Screening and Characterization and Reveal Deeper Biological Insights / Uso della citometria a flusso avanzata per accelerare lo screening e la caratterizzazione degli anticorpi e rivelare approfondimenti biologici
Use of Advanced Flow Cytometry to Accelerate Antibody Screening and Characterization and Reveal Deeper Biological Insights / Uso della citometria a flusso avanzata per accelerare lo screening e la caratterizzazione degli anticorpi e rivelare approfondimenti biologici
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Fig. 1 - Comparison of sample usage and time to results in typical biologics workflows using ELISA, a conventional flow cytometer and the Sartorius iQue® advanced flow cytometry platform. / Confronto tra l'utilizzo del campione ed il tempo per ottenere i risultati in flussi di lavoro biologici tipici utilizzando ELISA, un citometro a flusso convenzionale e la piattaforma di citometria a flusso avanzata Sartorius iQue®.
Abstract
Flow cytometry allows researchers to examine multiple parameters on several cell types simultaneously and has played a central role in antibody discovery workflows. While the multiplexing capabilities of flow cytometry provide advantages over conventional ELISA assays, its low throughput has proven to be challenging in the biopharmaceutical setting which puts a premium on time to actionable results. In contrast to conventional flow cytometry, the iQue® advanced flow cytometry platform is specifically designed for high-throughput, large-scale screening. The patented technology integrates rapid data acquisition and powerful analysis software to enable multiplexed assays that deliver data with unprecedented speed and clarity (Figure 1).
- Cells and beads can be simultaneously resolved in a single experiment, allowing quantitation of secreted proteins in parallel with cell-based analyses.
- Multiplexing capabilities collapse the screening workflow, allowing multiple assays and platforms to be replaced with one system.
- Experiments can be performed using small sample volumes, preserving precious material for additional downstream applications.
- Continuous plate loading is enabled through connection with any automation system.
- Automated, templated-based iQue Forecyt® analysis software and dynamic data visualization tools further accelerate the time to results even from highly complex data sets.
Hybridoma-Based Antibody Discovery
To be effective as cancer therapeutics, antibodies must contribute to the elimination of tumor cells. A number of therapeutics capitalize on antibody-mediated cell death to achieve this. There are several mechanisms by which antibodies induce cell death including direct targeting of cell-surface antigens, receptor blocking, targeted delivery of cytotoxic agents, antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) and antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP). Regardless of the mechanism of action, the ability to identify antibodies capable of initiating tumor cell killing early in the discovery workflow is essential for success in the oncology field. The discovery campaign described below was designed by a biopharmaceutical company to generate lead antibody candidates that bind to a cell-surface glycoprotein. Desired antibody characteristics included high binding specificity, cross-reactivity to the cynomolgus monkey protein and ability to induce apoptosis. Murine cross-reactivity was considered a bonus, although likely to be challenging due to the low homology (approximately 60%). A hybridoma-based approach was leveraged using a genetically engineered mouse model that generates increased antibody diversity, as measured by broader epitope antigen coverage. The iQue® advanced flow cytometry platform was used to assess the immune response generated in the animals. The platform enabled analysis of an entire 96-well plate in about eight minutes and results were visualized in real time. Figure 2 provides an example of this real time analysis with antibody not binding over time; instead it’s serum titration to determine EC50. An alternative way to view this data is in a heat map format, which the iQue® software can generate after data acquisition is complete. Raw values overlaid on the heat map can be exported directly to a CSV file for further analysis. Alternatively, the data can be plotted using the iQue Forecyt® software to generate graphical representations of the titer results including EC50 curves. Regardless of the final format for data representation, the iQue® platform enables more rapid decision-making to help progress antibody discovery workflows involving on-cell screening.
As part of this discovery campaign, the iQue® platform was
also used for functional characterization of selected
therapeutic candidates. An overview of the apoptosis assay
is provided in Figure 3.
Figure 3: Overview of Apoptosis Assay and a Plate-Based View of Results / Panoramica dell'analisi dell'apoptosi e visualizzazione dei risultati basata su piastra
In the plate view the Y-axis represents the Annexin V FITC
staining whereas the X-axis represents staining with the live/
dead dye. An overall population shift upwards indicates
cells undergoing apoptosis and an overall population shift
to the right indicates dead cells.
A summary of the results are provided in the bar chart and
includes three representative clones, an isotope control,
and camptothecin, an apoptosis-inducing cancer drug.
Clone five stands out among the others with a clear
increase in dead and apoptotic cells compared to the
cancer drug control. This clone includes a note that reads
“Underestimated nearly all cells disappeared.” This is also
highlighted visually in the plate-based summary results,
highlighted in yellow.
Unlike a conventional flow cytometer where the particular
number of events to be interrogated is set, the iQue®
platform operates by a set time in which it pulls a certain
volume of sample from every well on the plate (SIP time).
Assuming that the same number of cells are plated per well,
a similar number of events is captured for each well. In this
study, a set number of cells were allocated to each well and
treated with its corresponding IgG sample. The following
day, the samples were handled together in aggregate and
sampled using the same set SIP time for each well. A similar
number of events were collected for all samples, except for
the three samples that were incubated with clone five. The
three wells containing clone five showed a discernable
decrease in the number of events for analysis, suggesting,
perhaps, that the cells may have progressed through
apoptosis and cell death over the course of the 20-hour
incubation. Additional analysis including multiple
concentrations and incubation times are required to further
elucidate the cause of these observations.
In addition to the apoptosis analysis, the iQue® platform
was used to determine on-cell apparent KD for each of the
top five candidates of interest (Figure 4). A titration series
with known antibody concentrations was performed and
then put into the iQue Forecyt® software which collected
events and performed a nonlinear regression algorithm to
determine the KD50 response measurement.
In a matter of seconds, the software outputs the estimated
KD value. The estimated KD for this particular clone as
measured by the Sartorius Octet® system was similar to that
measured via the on-cell apparent KD analysis; these results
are shown on the bottom of Figure 4. Unfortunately, though
not surprisingly, not all clones showed comparable KD
measurements by both Octet® and on-cell apparent KD. This
is to be expected given the observed differences between
binding to the recombinant protein and binding to the
protein expressed on the cell surface.
The remaining clones were also analyzed via on-cell
apparent KD, and the resulting titration curve is shown on
the right of Figure 4. Beneath the graph are the actual KD
measurements that were returned by the iQue®. Two of the
top five clones that were analyzed appeared to exhibit very
poor affinity towards the target proximities with non
saturated profiles observed at the highest concentration of
one micromolar.
The ability to test for biological characteristics such as
specificity and function early in the discovery process
can help facilitate improved discovery of lead candidates
and ultimately, result in better clinical candidates. To
identify the most promising antibody candidates it is
essential to incorporate high-throughput screening and
relevant downstream formats as early as possible. As
shown in this study, advanced flow cytometry is a
beneficial way to handle this triage process. With use of
the advanced iQue® flow cytometer, the company was
able to identify a lead therapeutic candidate capable of
exhibiting apoptosis induction at single-digit nano-molar
affinity to the target of interest.
Multiplexing Nanobody Screening and Characterization
This study demonstrates use of the iQue® platform by a
biotechnology company for screening and characterization
of camelid nanobodies which are single-variable domains
from heavy chain-only antibodies. Nanobodies offer several
advantages for use as therapeutics including the ability to
block challenging targets, delivery via multiple routes, a
customizable half-life from hours to weeks and ease of
manufacturing.
The nanobody discovery workflow starts from either a
synthetic library or from immunized camelids and
incorporates the high throughput iQue® flow cytometer for
primary binding, functional screening assays and
characterization and potency optimization.
In recent years, the company evolved their approach to the
antibody discovery workflow which enabled significant
gains in throughput. The original, general binding
protocol used by the company called for mixing cells
expressing the target together with nanobodies, incubating
the mixture and washing away the unbound nanobody.
Subsequently, mouse anti-tag antibody was added,
incubated and washed, followed by labeled anti-mouse
antibody, also incubated and washed. A major bottleneck to
this workflow was the use of fresh cells. On the day of the
experiment, large quantities of cells were required for
analysis. In 2009, the company purchased a fluorescence
activated cell sorting (FACS) system fitted with a plate
attachment enabling processing of a 96 well plate in 20
minutes or a total of eight plates per day. In 2014, the
company developed a multiplexing assay using different
dyes which enabled use of fresh and frozen cells and
increased throughput from 384 data points per day to 2304.
Adoption of the iQue® platform further increased
throughput to ten 96-well plates per day with five cell lines
per well for a total of 4800 data points per day combined
with the use of iQue Forecyt® software for data analysis.
Recently the company decided to further increase the
number of live events per cell line that were collected to
400 and convert to 384-well plates. In addition, a new
multiplexing assay was developed that no longer used two
different dyes but rather used different intensities of a
single dye.
When comparing dyes used to stain for different intensities,
the iQue® Cell Membrane Cell Encoding B/Green dye
provided the best results and enabled a multiplex of five
different cell lines in each well, including an unstained
control. The dye was shown to be less leaky compared to
the other dyes.
Figure 5 shows an example of the multiplex assay in a 96-
well format. The first dot plot shows separation of the
different cell lines; one is a parental cell line and the two
others express the human or cynomolgus monkey version
of the target. The histogram shows plate level nanobody
binding to all three different cell lines. Using the heatmap
feature in iQue Forecyt® the data is deconvoluted showing
binding in each well to the particular cell line. This data
shows binding to human and cynomolgus versions of the
target protein, but no binding to the parental cell line
except for the positive control wells.
Figure 5: Nanobody Screening Study Performed on the iQue® Platform / Studio di screening sui nanobody eseguito sulla piattaforma iQue®
Note: The design tab in iQue Forecyt® software was used to design titration curves and select important parameters and models for primary
characterizations. Previously, Graphpad Prism was used for curve fitting and the generation of EC50 statistics. However, Graphpad Prism was found to be
labor intensive and required the exporting and pasting of data. Currently, iQue Forecyt® software is used for automated curve fitting and EC50 statistics
from titration experiments enable streamlined data analysis.
Figure 5 shows an example of the multiplex assay in a 96-
well format. The first dot plot shows separation of the
different cell lines; one is a parental cell line and the two
others express the human or cynomolgus monkey version
of the target. The histogram shows plate level nanobody
binding to all three different cell lines. Using the heatmap
feature in iQue Forecyt® the data is deconvoluted showing
binding in each well to the particular cell line. This data
shows binding to human and cynomolgus versions of the
target protein, but no binding to the parental cell line
except for the positive control wells.
Note: The iQue® system, in combination with the integrated iQue Forecyt® software, allowed this biopharmaceutical company to increase the throughput
for nanobody screening campaigns at least fourfold, compared to conventional flow cytometry. Multiplexing of cell lines in the initial screening provided
insight about species cross-reactivity and the selectivity of the binding epitope that was targeted. In addition, curve-fitting data analysis in primary
characterizations led to further time savings.
Figure 11: Multiplexing of Cells and Capture Beads / Multiplexing di cellule e perline di cattura
Figure 12: IgG Concentration Can Be Detected in Hybridoma Primary Screens / La concentrazione di IgG può essere rilevata negli schermi primari dell'ibridoma
Figure 13: The iQue® Platform Can Be Used to Accelerate and Streamline a Wide Range of Complicated on-Cell Binding Assays / La piattaforma iQue® può essere utilizzata per accelerare e semplificare un'ampia gamma di complicati test di legame su cellula
Multiplexing Specificity and Species Cross Reactivity
Although hybridomas are a mature and well-developed
approach for antibody discovery, there are opportunities to
make the process more efficient. One of the critical steps
for which innovative technology is being applied to achieve
these objectives is target identification. Traditionally, ELISA
has been the most popular method to screen binders from
hybridoma supernatants. However, the main concern with
ELISA is whether the recombinant protein used in direct
coating or the sandwich has the appropriate conformation
to reveal the targeted epitopes, especially after it binds to a
surface. With ELISAs, the dynamic window is limited and it is
easy to reach saturation; in addition, non-specific binding
leads to a high rate of false positives.
While an on-cell binding assay would be more
physiologically relevant, there are some challenges that also
limit its use as a primary screening tool. Conventional flow
cytometers are only suitable for small-scale research, are
not amenable to automation and have limitations in their
data acquisition and management abilities making it
difficult to achieve the necessary throughput. In contrast,
the iQue® platform can acquire high quality data at fast
speeds, utilizing low sample volumes and is also capable of
processing and management of large data sets directly in
iQue Forecyt® software without the need to transfer to third
party software analysis packages.
Figure 7 shows a comparison of the iQue® platform and a
conventional flow cytometer equipped with an optional
plate loader which is limited to use of 96 well plates. The
iQue® platform could not only generate high-quality data
consistent with the FACS, but also achieve this with higher
speed and lower volume.
The iQue® platform was able to sample a 384 well plate in 24
minutes whereas the conventional flow cytometer was able
to sample a 96-well plate in 1 hour. This speed makes it
possible for an on-cell binding assay to serve as the primary
screening tool for hybridoma campaigns.
The following case study describes an on-cell binding assay
used for hybridoma screens and purified antibody affinity
assessments. A two-cell population screen was used with
parental cells labeled with violet cell encoding dye and
unlabeled target-expressing cells. Cell types were mixed
one to one in the same well for the screen. Based on the
intensity in the violet channel, the two cell types could be
identified. A dot plot (Figure 8) shows parental cells circled
in red and target-expressing cells in blue; strong binders,
medium binders, weak binders and non-binders were
readily identifiable.
Figure 8:
Dot plot of Parental and Target-Expressing Cells / Grafico a punti delle cellule parentali e che esprimono il bersaglio
Comparing on-cell binding data with ELISA data revealed
that most of the hits identified in the on-cell binding assay
were saturated with no observable difference in the ELISA,
indicating that the on-cell binding assay had a larger
dynamic range than the ELISA (Figure 9). Additionally,
there was one hit identified in the on-cell binding assay that
was missed in the ELISA; this might reflect the difference in
the target approach and conformation on the cells
compared to the recombinant protein used in the ELISA.
Overall, this study demonstrated that multiplexing of the
target and parental cells in high-throughput flow cytometry
is a powerful and physiologically relevant technology for
antibody screening. This multiplex approach can also be
applied to screens of cross-species activity (Figure 10).
Figure 9:
On-Cell Binding Assay Had
a Larger Dynamic Range Than Elisa / Il test di legame su cellula aveva una gamma dinamica più ampia rispetto a Elisa
Figure 10: Multiplex of Cell Types Further Increases Throughput in Hybridoma Screening / Il multiplex di tipi di cellule aumenta ulteriormente la produttività nello screening dell'ibridoma
IgG Titer Determination
IgG capture beads, which have a distinguishable scattering pattern from cells, can be multiplexed with cells to measure hybridoma IgG concentration, providing additional insights to guide hit selection. A scatter plot shows that the cell population was clearly distinguished from the capture bead population (Figure 11). The capture beads were able to detect mouse plasma on the mouse IgG type control with a one-hundred-fold signal window compared to the buffer controls without IgG. Capture beads could detect mouse IgG from plasma with a large signal window; this provided confidence in the ability to quantitate IgG from hybridomas.
Figure 12 shows one example of the two-cell multiplex in an
on-cell binding assay. The graph on the left identifies hits
from the hybridoma screening from the cell-based analysis
using the specific ratio and fold increase criteria. Hits were
identified in the darker gray color on the graph. In the
graph on the right, the relative concentration of the IgG was
measured in each of the hybridoma samples.
Figure 12: IgG Concentration Can Be Detected in Hybridoma Primary Screens / La concentrazione di IgG può essere rilevata negli schermi primari dell'ibridoma
Other, more complicated on-cell binding assays used in the
antibody discovery workflow can be easily adapted to the
iQue® high-throughput flow cytometry platform. As shown
in Figure 13, these include competition, blocking and signal
amplification assays.
Figure 13: The iQue® Platform Can Be Used to Accelerate and Streamline a Wide Range of Complicated on-Cell Binding Assays / La piattaforma iQue® può essere utilizzata per accelerare e semplificare un'ampia gamma di complicati test di legame su cellula
Conclusion
The discovery of antibody therapeutics relies on rapid
identification and characterization of candidate molecules
with superior target reactivity and optimized functionality.
Historically, antibody discovery workflows have centered
around use of ELISAs which report antibody binding to single
antigens and require large amounts of the target protein to
coat the wells of assay plates.
With the iQue® platform, a variety of cell types and
parameters can be assessed in the same well, generating
multiple readouts and delivering the data and insights
needed to guide and accelerate discovery efforts. A further
advantage is that target proteins are presented on the cell
surface rather than in the artificial setting of a plastic well.
With the target in its native conformation, assay results are
more likely to be biologically relevant and more
representative of in vivo activity.
In summary, the iQue® advanced flow cytometry platform
offers unparalleled breadth and versatility for the
development and execution of rapid, multiplexed analytical
methods. In the race to cross the finish line with new
therapies, this high throughput platform delivers unique
insights and elucidates complex biology to deliver new
insights and accelerate decision-making
ITALIANO
Riassunto
La citometria a flusso consente ai ricercatori di esaminare contemporaneamente più parametri su diversi tipi di cellule e ha svolto un ruolo centrale nei flussi di lavoro per la scoperta di anticorpi. Sebbene le capacità di multiplexing della citometria a flusso offrano vantaggi rispetto ai test ELISA convenzionali, il suo basso throughput si è dimostrato impegnativo nell'ambiente biofarmaceutico, che privilegia il tempo per ottenere risultati attuabili. Contrariamente alla citometria a flusso convenzionale, la piattaforma avanzata di citometria a flusso iQue® è specificamente progettata per lo screening ad alta produttività e su larga scala. La tecnologia brevettata integra l'acquisizione rapida dei dati ed un potente software di analisi per consentire analisi multiplex che forniscono dati con velocità e chiarezza senza precedenti (Figura 1).
- Cellule e microsfere possono essere risolte simultaneamente in un singolo esperimento, consentendo la quantificazione delle proteine secrete parallelamente alle analisi basate sulle cellule.
- Le funzionalità di multiplexing comprimono il flusso di lavoro di screening, consentendo la sostituzione di più saggi e piattaforme con un unico sistema.
- Gli esperimenti possono essere eseguiti utilizzando piccoli volumi di campione, preservando materiale prezioso per ulteriori applicazioni a valle.
- Il caricamento continuo delle lastre è abilitato tramite collegamento con qualsiasi sistema di automazione.
- Il software di analisi iQue Forecyt® automatizzato e basato su modelli e gli strumenti di visualizzazione dinamica dei dati accelerano ulteriormente il tempo per ottenere risultati anche da set di dati molto complessi.
Scoperta dell'anticorpo basato sull'ibridoma
Per essere efficaci come terapie contro il cancro, gli anticorpi devono contribuire all'eliminazione delle cellule tumorali. Numerose terapie sfruttano la morte cellulare mediata da anticorpi per raggiungere questo obiettivo. Esistono diversi meccanismi mediante i quali gli anticorpi inducono la morte cellulare, tra cui il targeting diretto di antigeni della superficie cellulare, il blocco dei recettori, la somministrazione mirata di agenti citotossici, la citotossicità cellulare dipendente dall'anticorpo (ADCC) e la fagocitosi cellulare dipendente dall'anticorpo (ADCP). Indipendentemente dal meccanismo d'azione, la capacità di identificare gli anticorpi in grado di avviare l'uccisione delle cellule tumorali all'inizio del flusso di lavoro della scoperta è essenziale per il successo nel campo dell'oncologia. La campagna di scoperta descritta di seguito è stata progettata da un'azienda biofarmaceutica per generare candidati anticorpali guida che si legano a una glicoproteina della superficie cellulare. Le caratteristiche anticorpali desiderate includevano un'elevata specificità di legame, reattività crociata alla proteina di scimmia cynomolgus e capacità di indurre l'apoptosi. La cross-reattività murina è stata considerata un bonus, anche se probabilmente impegnativa a causa della bassa omologia (circa il 60%). È stato sfruttato un approccio basato sull'ibridoma utilizzando un modello di topo geneticamente modificato che genera una maggiore diversità di anticorpi, misurata dalla più ampia copertura dell'antigene dell'epitopo. La piattaforma di citometria a flusso avanzata iQue® è stata utilizzata per valutare la risposta immunitaria generata negli animali. La piattaforma ha consentito l'analisi di un'intera piastra a 96 pozzetti in circa otto minuti ei risultati sono stati visualizzati in tempo reale. La Figura 2 fornisce un esempio di questa analisi in tempo reale con l'anticorpo che non si lega nel tempo; invece è la titolazione del siero per determinare l'EC50. Un modo alternativo per visualizzare questi dati è in un formato di mappa termica, che il software iQue® può generare al termine dell'acquisizione dei dati. I valori grezzi sovrapposti alla mappa termica possono essere esportati direttamente in un file CSV per ulteriori analisi. In alternativa, i dati possono essere tracciati utilizzando il software iQue Forecyt® per generare rappresentazioni grafiche dei risultati del titolo comprese le curve EC50. Indipendentemente dal formato finale per la rappresentazione dei dati, la piattaforma iQue® consente un processo decisionale più rapido per aiutare a far progredire i flussi di lavoro di scoperta degli anticorpi che coinvolgono lo screening cellulare.
Nell'ambito di questa campagna di scoperta, la piattaforma iQue® è stata utilizzata anche per la caratterizzazione funzionale di candidati terapeutici selezionati. Una panoramica del saggio di apoptosi è fornita nella Figura 3.
Nella vista della piastra l'asse Y rappresenta la colorazione con annessina V FITC mentre l'asse X rappresenta la colorazione con il colorante morto vivo. Uno spostamento complessivo della popolazione verso l'alto indica cellule in fase di apoptosi e uno spostamento complessivo della popolazione verso destra indica cellule morte.
Un riepilogo dei risultati è fornito nel grafico a barre e include tre cloni rappresentativi, un controllo isotopico e la camptotecina, un farmaco antitumorale che induce l'apoptosi. Il clone cinque si distingue tra gli altri con un netto aumento di cellule morte e apoptotiche rispetto al controllo del farmaco antitumorale. Questo clone include una nota che recita "Sottovalutato quasi tutte le celle sono scomparse". Ciò è evidenziato anche visivamente nei risultati di riepilogo basati su piastra, evidenziati in giallo. A differenza di un citometro a flusso convenzionale in cui è impostato il numero particolare di eventi da interrogare, la piattaforma iQue® opera entro un tempo prestabilito in cui preleva un certo volume di campione da ogni pozzetto sulla piastra (tempo SIP). Supponendo che lo stesso numero di cellule sia piastrato per pozzetto, viene catturato un numero simile di eventi per ciascun pozzetto. In questo studio, un determinato numero di cellule è stato assegnato a ciascun pozzetto e trattato con il corrispondente campione di IgG. Il giorno successivo, i campioni sono stati manipolati insieme in forma aggregata e campionati utilizzando lo stesso tempo SIP impostato per ciascun pozzetto. Un numero simile di eventi è stato raccolto per tutti i campioni, ad eccezione dei tre campioni che sono stati incubati con il clone cinque. I tre pozzetti contenenti il clone cinque hanno mostrato una notevole diminuzione del numero di eventi per l'analisi, suggerendo, forse, che le cellule potrebbero essere progredite attraverso l'apoptosi e la morte cellulare nel corso delle 20 ore di incubazione. Sono necessarie ulteriori analisi, comprese concentrazioni multiple e tempi di incubazione, per chiarire ulteriormente la causa di queste osservazioni. Oltre all'analisi dell'apoptosi, la piattaforma iQue® è stata utilizzata per determinare la KD apparente sulla cellula per ciascuno dei primi cinque candidati di interesse (Figura 4). Una serie di titolazioni con concentrazioni di anticorpi note è stata eseguita e quindi inserita nel software iQue Forecyt® che ha raccolto gli eventi ed eseguito un algoritmo di regressione non lineare per determinare la misurazione della risposta KD50.
In pochi secondi, il software emette il valore KD stimato. La KD stimata per questo particolare clone misurata dal sistema Sartorius Octet® era simile a quella misurata tramite l'analisi KD apparente su cellula; questi risultati sono mostrati nella parte inferiore della Figura 4. Sfortunatamente, sebbene non sorprendentemente, non tutti i cloni hanno mostrato misurazioni KD comparabili sia con Octet® che con KD apparente su cella. Ciò è prevedibile date le differenze osservate tra il legame alla proteina ricombinante ed il legame alla proteina espressa sulla superficie cellulare. Anche i restanti cloni sono stati analizzati tramite KD apparente sulla cella e la curva di titolazione risultante è mostrata a destra della Figura 4. Sotto il grafico sono riportate le misurazioni KD effettive che sono state restituite dall'iQue®. Due dei primi cinque cloni analizzati sembravano mostrare un'affinità molto scarsa verso le vicinanze del bersaglio con non profili saturi osservati alla massima concentrazione di un micromolare.
La capacità di testare le caratteristiche biologiche come la specificità e la funzione all'inizio del processo di scoperta può aiutare a facilitare una migliore scoperta dei candidati principali e, in ultima analisi, portare a candidati clinici migliori. Per identificare i candidati anticorpali più promettenti è essenziale incorporare lo screening ad alto rendimento ed i relativi formati a valle il prima possibile. Come mostrato in questo studio, la citometria a flusso avanzata è un modo vantaggioso per gestire questo processo di triage. Con l'uso dell'avanzato citometro a flusso iQue®, l'azienda è stata in grado di identificare un candidato terapeutico principale in grado di esibire l'induzione dell'apoptosi con un'affinità nanomolare ad una cifra per il target di interesse.
Multiplexing Nanobody Screening e caratterizzazione
Questo studio dimostra l'uso della piattaforma iQue® da parte di un'azienda biotecnologica per lo screening e la caratterizzazione di nanobodies camelid che sono domini a variabile singola da anticorpi solo a catena pesante. I nanobodies offrono numerosi vantaggi per l'uso come terapie, tra cui la capacità di bloccare bersagli impegnativi, consegna attraverso percorsi multipli, un'emivita personalizzabile da ore a settimane e facilità di produzione. Il flusso di lavoro per la scoperta di nanobody parte da una libreria sintetica o da camelidi immunizzati e incorpora il citometro a flusso iQue® ad alta produttività per il legame primario, i test di screening funzionale e la caratterizzazione e l'ottimizzazione della potenza. Negli ultimi anni, l'azienda ha evoluto il proprio approccio al flusso di lavoro per la scoperta degli anticorpi, il che ha consentito di ottenere significativi guadagni in termini di produttività. Il protocollo di legame originale e generale utilizzato dalla società richiedeva di mescolare cellule che esprimevano il bersaglio insieme a nanobodies, incubare la miscela e lavare via il nanobody non legato. Successivamente, l'anticorpo anti-tag di topo è stato aggiunto, incubato e lavato, seguito dall'anticorpo anti-topo marcato, anch'esso incubato e lavato. Un importante collo di bottiglia in questo flusso di lavoro è stato l'uso di cellule fresche. Il giorno dell'esperimento erano necessarie grandi quantità di cellule per l'analisi.
Nel 2009, l'azienda ha acquistato un sistema di smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza (FACS) dotato di un attacco per piastra che consente l'elaborazione di una piastra a 96 pozzetti in 20 minuti o un totale di otto piastre al giorno. Nel 2014, l'azienda ha sviluppato un saggio di multiplexing utilizzando diversi coloranti che ha consentito l'uso di cellule fresche e congelate e ha aumentato la produttività da 384 punti dati al giorno a 2304. L'adozione della piattaforma iQue® ha ulteriormente aumentato la produttività a dieci piastre da 96 pozzetti al giorno con cinque linee cellulari per pozzetto per un totale di 4800 punti dati al giorno combinati con l'uso del software iQue Forecyt® per l'analisi dei dati. Recentemente l'azienda ha deciso di aumentare ulteriormente il numero di eventi live per linea cellulare raccolti a 400 e convertirli in piastre da 384 pozzetti. Inoltre, è stato sviluppato un nuovo test di multiplexing che non utilizzava più due coloranti diversi, ma piuttosto utilizzava intensità diverse di un singolo colorante.
Quando si confrontano i coloranti utilizzati per la colorazione per diverse intensità, il colorante iQue® Cell Membrane Cell Encoding B/Green ha fornito i migliori risultati e ha consentito un multiplex di cinque diverse linee cellulari in ciascun pozzetto, compreso un controllo non colorato. È stato dimostrato che il colorante perde meno rispetto agli altri coloranti. La Figura 5 mostra un esempio del test multiplex in un formato a 96 pozzetti. Il primo dot plot mostra la separazione delle diverse linee cellulari; uno è una linea cellulare parentale e gli altri due esprimono la versione umana o scimmia cynomolgus del bersaglio. L'istogramma mostra il legame del nanobody a livello di piastra a tutte e tre le diverse linee cellulari. Utilizzando la funzione heatmap in iQue Forecyt® i dati vengono deconvoluti mostrando il legame in ogni pozzetto alla particolare linea cellulare. Questi dati mostrano il legame con le versioni umana e cynomolgus della proteina bersaglio, ma nessun legame con la linea cellulare parentale ad eccezione dei pozzetti di controllo positivi.
Nota: la scheda Design nel software iQue Forecyt® è stata utilizzata per progettare curve di titolazione e selezionare parametri e modelli importanti per le caratterizzazioni primarie. In precedenza, Graphpad Prism veniva utilizzato per l'adattamento della curva e la generazione di statistiche EC50. Tuttavia, Graphpad Prism è risultato essere laborioso e ha richiesto l'esportazione e l'incollaggio dei dati. Attualmente, il software iQue Forecyt® viene utilizzato per l'adattamento automatico della curva e le statistiche EC50 dagli esperimenti di titolazione consentono un'analisi semplificata dei dati.
La Figura 5 mostra un esempio del test multiplex in un formato a 96 pozzetti. Il primo dot plot mostra la separazione delle diverse linee cellulari; uno è una linea cellulare parentale e gli altri due esprimono la versione umana o scimmia cynomolgus del bersaglio. L'istogramma mostra il legame del nanobody a livello di piastra a tutte e tre le diverse linee cellulari. Utilizzando la funzione heatmap in iQue Forecyt® i dati vengono deconvoluti mostrando il legame in ogni pozzetto alla particolare linea cellulare. Questi dati mostrano il legame con le versioni umana e cynomolgus della proteina bersaglio, ma nessun legame con la linea cellulare parentale ad eccezione dei pozzetti di controllo positivi.
Nota: il sistema iQue®, in combinazione con il software integrato iQue Forecyt®, ha consentito a questa azienda biofarmaceutica di aumentare la produttività per le campagne di screening dei nanobody almeno quattro volte, rispetto alla citometria a flusso convenzionale. Il multiplexing delle linee cellulari nello screening iniziale ha fornito informazioni sulla reattività incrociata delle specie e sulla selettività dell'epitopo di legame preso di mira. Inoltre, l'analisi dei dati di adattamento della curva nelle caratterizzazioni primarie ha portato a ulteriori risparmi di tempo.
Specificità di multiplexing e reattività incrociata di specie
Sebbene gli ibridomi rappresentino un approccio maturo e ben sviluppato per la scoperta di anticorpi, esistono opportunità per rendere il processo più efficiente. Uno dei passaggi critici per i quali viene applicata la tecnologia innovativa per raggiungere questi obiettivi è l'identificazione del target. Tradizionalmente, l'ELISA è stato il metodo più popolare per schermare i leganti dai surnatanti di ibridoma. Tuttavia, la preoccupazione principale con ELISA è se la proteina ricombinante utilizzata nel rivestimento diretto o nel sandwich abbia la conformazione appropriata per rivelare gli epitopi mirati, specialmente dopo che si è legata a una superficie. Con gli ELISA, la finestra dinamica è limitata ed è facile raggiungere la saturazione; inoltre, il legame non specifico porta ad un alto tasso di falsi positivi. Mentre un test di legame su cellula sarebbe più fisiologicamente rilevante, ci sono alcune sfide che ne limitano anche l'uso come strumento di screening primario. I citometri a flusso convenzionali sono adatti solo per la ricerca su piccola scala, non sono suscettibili di automazione e hanno limitazioni nelle loro capacità di acquisizione e gestione dei dati che rendono difficile ottenere il throughput necessario. Al contrario, la piattaforma iQue® può acquisire dati di alta qualità a velocità elevate, utilizzando bassi volumi di campioni ed è anche in grado di elaborare e gestire grandi set di dati direttamente nel software iQue Forecyt® senza la necessità di trasferirli a pacchetti di analisi software di terze parti. La Figura 7 mostra un confronto tra la piattaforma iQue® ed un citometro a flusso convenzionale dotato di un caricatore di piastre opzionale che è limitato all'uso di piastre a 96 pozzetti. La piattaforma iQue® non solo è in grado di generare dati di alta qualità coerenti con il FACS, ma anche di ottenere questo risultato con una velocità maggiore e un volume inferiore. La piattaforma iQue® è stata in grado di campionare una piastra a 384 pozzetti in 24 minuti, mentre il citometro a flusso convenzionale è stato in grado di campionare una piastra a 96 pozzetti in 1 ora. Questa velocità consente ad un test di legame su cellula di fungere da strumento di screening principale per le campagne di ibridomi.
Il seguente case study descrive un test di legame a cellule utilizzato per gli schermi dell'ibridoma e le valutazioni di affinità degli anticorpi purificati. È stato utilizzato uno schermo di popolazione a due cellule con cellule parentali etichettate con cellule viola che codificano il colorante e le cellule che esprimono target senza etichetta. I tipi di cellule sono stati miscelati da uno a uno nello stesso pozzo per lo schermo. Sulla base dell'intensità nel canale viola, potrebbero essere identificati i due tipi di cellule. Un diagramma a punti (Figura 8) mostra cellule parentali cerchiate in cellule rosse e che esprimono il bersaglio in blu; I leganti forti, i leganti medi, i leganti deboli ed i non leganti erano prontamente identificabili.
Il confronto dei dati di legame su cella con i dati ELISA ha rivelato che la maggior parte degli hit identificati nel test di legame su cella erano saturati senza alcuna differenza osservabile nell'ELISA, indicando che il saggio di legame su cella aveva un intervallo dinamico più ampio rispetto all'ELISA. Figura 9). Inoltre, è stato identificato un hit nel test di legame on-cell che è stato perso nell'ELISA; questo potrebbe riflettere la differenza nell'approccio target e nella conformazione delle cellule rispetto alla proteina ricombinante utilizzata nell'ELISA. Nel complesso, questo studio ha dimostrato che il multiplexing delle cellule bersaglio e parentali nella citometria a flusso ad alto rendimento è una tecnologia potente e fisiologicamente rilevante per lo screening degli anticorpi. Questo approccio multiplex può essere applicato anche alle schermate dell'attività interspecie (Figura 10).
Determinazione del titolo di IgG
Le sfere di cattura IgG, che hanno un modello di dispersione distinguibile dalle cellule, possono essere multiplexate con le cellule per misurare la concentrazione di IgG dell'ibridoma, fornendo ulteriori approfondimenti per guidare la selezione dei risultati. Un grafico a dispersione mostra che la popolazione cellulare era chiaramente distinta dalla popolazione di perline di cattura (Figura 11). Le microsfere di cattura sono state in grado di rilevare il plasma di topo sul controllo di tipo IgG di topo con una finestra del segnale cento volte maggiore rispetto ai controlli tampone senza IgG. Le sfere di cattura potrebbero rilevare le IgG di topo dal plasma con un'ampia finestra del segnale; ciò ha fornito fiducia nella capacità di quantificare le IgG dagli ibridomi.
La Figura 12 mostra un esempio del multiplex a due celle in un saggio di legame su cella. Il grafico a sinistra identifica i risultati dello screening dell'ibridoma dall'analisi basata sulle cellule utilizzando il rapporto specifico ed i criteri di aumento della piega. Gli hit sono stati identificati nel colore grigio più scuro sul grafico. Nel grafico a destra, la concentrazione relativa di IgG è stata misurata in ciascuno dei campioni di ibridoma.
Altri saggi di legame su cellula più complicati utilizzati nel flusso di lavoro per la scoperta di anticorpi possono essere facilmente adattati alla piattaforma di citometria a flusso ad alto rendimento iQue®. Come mostrato nella Figura 13, questi includono test di competizione, blocco e amplificazione del segnale.
Conclusione
La scoperta di terapie anticorpali si basa sulla rapida identificazione e caratterizzazione di molecole candidate con reattività del bersaglio superiore e funzionalità ottimizzata. Storicamente, i flussi di lavoro per la scoperta di anticorpi si sono incentrati sull'uso di ELISA che segnalano il legame dell'anticorpo a singoli antigeni e richiedono grandi quantità della proteina bersaglio per rivestire i pozzetti delle piastre di analisi. Con la piattaforma iQue®, è possibile valutare una varietà di tipi di cellule e parametri nello stesso pozzetto, generando più letture e fornendo i dati e le conoscenze necessarie per guidare e accelerare gli sforzi di scoperta. Un ulteriore vantaggio è che le proteine bersaglio sono presentate sulla superficie cellulare piuttosto che nell'ambiente artificiale di un pozzetto di plastica. Con il target nella sua conformazione nativa, è più probabile che i risultati del test siano biologicamente rilevanti e più rappresentativi dell'attività in vivo. In sintesi, la piattaforma di citometria a flusso avanzata iQue® offre un'ampiezza ed una versatilità senza precedenti per lo sviluppo e l'esecuzione di metodi analitici rapidi e multiplexati. Nella corsa per tagliare il traguardo con nuove terapie, questa piattaforma ad alto rendimento offre intuizioni uniche e chiarisce la biologia complessa per fornire nuove intuizioni ed accelerare il processo decisionale
Da:
https://www.selectscience.net/downloads/articles/79_Antibody_Characterization_Application_eBook_2022.pdf
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