Antibody Internalization: Advanced Flow Cytometry and Live-Cell Analysis Give Rich Insights During Antibody Profiling / Internalizzazione degli anticorpi: la citometria a flusso avanzata e l'analisi delle cellule vive forniscono approfondimenti approfonditi durante la profilazione degli anticorpi
Antibody Internalization: Advanced Flow Cytometry and Live-Cell Analysis Give Rich Insights During Antibody Profiling / Internalizzazione degli anticorpi: la citometria a flusso avanzata e l'analisi delle cellule vive forniscono approfondimenti approfonditi durante la profilazione degli anticorpi
Segnalato dal Dott. Giuseppe Cotellessa / Reported by Dr. Giuseppe Cotellessa
Introduction
The natural characteristics of antibodies, such as high binding affinity, specificity to a wide variety of targets, and good stability, make them ideal therapeutic candidates for many diseases. Monoclonal antibodies (mAbs), in particular, deliver promising therapeutic results in several different disease areas, such as autoimmunity, oncology, and chronic inflammation. Researchers’ abilities to improve the breadth of antibodies have been aided by innovative technologies for antibody discovery, for instance, through humanization of mouse antibodies and phage display. However, advanced antibody design techniques create the need for new screening methods so that lead candidates can be quickly and effectively identified as early in the development process as possible. Part of an effective screening strategy is to identify the desired therapeutic goal for your candidates. For instance, binding and rapid internalization are desirable properties for antibody-drug conjugates (ADCs), as cells must be selectively targeted and killed via delivery of a cytotoxic payload. In contrast, if the goal is to induce antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC), the antibody must remain bound to the cell surface, rather than being internalized, in order to activate an immune response. When designing ADCs, one key attribute to predicting efficacy is the antibody internalization (ABI) rate and the associated kinetics. These internalization kinetics are influenced by factors such as the epitope on the target antigen, affinity of the ADC-antigen interaction, and intracellular trafficking. Evaluating for these factors is critical throughout the antibody screening pathway (Figure 1); however, here, we concentrate on evaluating antibodies’ ABI during functional profiling via rate comparisons during the development process, as well as multiplexed mechanistic studies later in the screening process.
Traditionally, antibody screening workflows have required labor intensive, time consuming, endpoint-only methods, such as FACS, ELISA, or microscopy. One solution to address these screening challenges is to use advanced screening methods that offer maximum insight through high-content data. Herein, we demonstrate an advanced antibody screening method that focuses on speed and insight by using a novel, pH-sensitive reagent for characterizing ABI via both advanced flow cytometry and live-cell imaging.
Challenges with Traditional Antibody
Screening Workflows Monoclonal antibodies (mAbs) are large (about 150 kDa), complex biologic molecules that require post-translational modifications for their activity (Chames et al., 2009). Therefore, researchers face several challenges when engineering and producing mAbs as therapeutics. Engineering antibodies to optimize their biological potencies during the discovery phase can address many of these challenges. However, these attempts to optimize one attribute can have profound and unintended consequences on other antibody attributes. For instance, optimizing an antibody’s specificity may negatively affect activity (Tiller and Tessier, 2015). One way of simultaneously optimizing multiple antibody properties is by using mutagenesis to produce large screening libraries. However, large screening libraries necessitate a thorough in vitro, high-throughput screening method to quickly identify the most suitable drug candidates for further development early in their discovery process. Workflows for antibody screening commonly include fluorescence-activated cell sorting (FACS), enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), and microscopy (such as confocal) techniques. Yet, these in vitro antibody screening methods have several drawbacks:
(1) they can be labor intensive with limited throughput,
(2) they do not allow direct, head-to-head comparisons of antibodies, and
(3) they need large amounts of reagents.
For instance, even though FACS can be used to sort
hundreds of thousands of cells based on their fluorescence properties, it cannot be used to perform
high-throughput, time-dependent studies on individual cells because the cells must be sorted into
single colonies before any further analysis can be
performed (Doerner et al., 2014).
ELISA, on the other hand, is adaptable to
high-throughput screening (Saeed et al., 2017),
and thus has historically been used to screen hybridomas and other libraries for antibody binding
to each of its targets. ELISAs are performed by
coating a single target antigen onto the wells of
assay plates, followed by the addition of individual samples from an antibody library (for instance,
from hybridoma or phage display). Antibodies
that bind to the immobilized antigen are detected by a color change due to an indirect enzyme/
substrate reaction.
In addition to its adaptability to high-throughput
screening, ELISA is rapid, consistent, and relatively
easy to analyze (Saeed et al., 2017). However, ELISA has several disadvantages that can limit its successful use in a modern antibody screening lab.
First, primary screens that test binding to a single
antigen often require subsequent secondary and
sometimes even tertiary screens with control antigens to confirm their specificity and cross- reactivity. Second, ELISA is not the best method for
screening antibodies that bind to cell surface antigens because these antigens are extracted from
the cell membrane and purified before adsorbing to the plastic ELISA plate. Extracting antigens
from the membrane often leads to disruption of
conformational epitopes that can be important
targets for therapeutic antibodies. Finally, to minimize background signal, ELISA requires multiple
wash steps to remove unbound antibodies and
detection reagents, resulting in long, labor-intensive screening workflows.
Also, although ELISA can provide data on the immunoglobulin G (IgG) titer, it offers no reflection
on how the therapeutic antibody candidates affect
the health of the test cells. i.e. how quickly or efficiently they induce death. Thus, candidates that
appear to be productive based on ELISA screening
may be carried forward into the next step of the
production process even though they are unideal
candidates in terms of function or vigour.
Microscopy techniques, in contrast to FACS, are
useful for single-cell analysis, as well as for such
localization and temporal studies as antibody internalization and live-cell imaging for monitoring
individual cell behavior. Microscopy techniques,
however, have limited throughput due to data acquisition time, and they have limited multiplexing
capabilities. Thus, for antibody discovery, some
other method, preferably high-throughput, is generally used for the initial selection and screening of
large libraries, followed by a more thorough functional analysis of a smaller set of antibody candidates using microscopy (Doerner et al., 2014).
Like FACS, microscopy techniques also require labeling each antibody with a fluorescent tag, which
must be separated from the free label via a column or wash step because analysis requires robust isolation of internalized antibodies from those outside the cells. To aid isolation of the positive signal,
researchers often resort to perturbing techniques,
such as washing cells, using blocking dyes, and reducing the temperature to slow cellular activity.
However, cells can be lost during washing steps,
and the associated reductions in temperature perturb the cellular environment.
A further drawback to almost all the techniques
used for antibody screening is that they only enable end-point analysis, which means that multiple
experiments are required to follow an antibody attribute, such as internalization, over time.
The best approach to address all the limitations
of traditional antibody screening is to combine
data from advanced screening methods; using advanced methods, researchers can choose their candidates based on a thorough evaluation of all relevant characteristics, such as IgG titer, cell health,
internalization, and their associated kinetics early
in their discovery process.
A Simple Way of Labeling Antibodies
for Addressing Challenges with FACS,
ELISA, and Microscopy
One of the challenges presented above with FACS,
ELISA, and microscopy techniques is the requirement for wash steps to minimize background signal. Among other undesirable effects, such as increased time to results, this need for wash steps
also increases reagent requirements (and cost) and
makes cell loss inevitable. However, an advanced
method for labeling cells could reduce reagent requirements, as well as simplify protocols when analyzing antibody internalization.
ABI Assays Made Simple, With
No-Wash Labeling and Low
Reagent Requirements via a Novel,
Ph-Sensitive Reagent
The key to this simple, no-wash protocol is a novel
reagent composed of Fc-region targeting Fab fragments conjugated to a pH-sensitive fluorescent.
Figure 3: The assay consists of 3 components, each 10 μL: labeled test antibody, cells (encoded or not), and Cell Membrane Integrity Dye (B/Green). Each component is prepared at 3X before addition for a final concentration of 1X and an assay volume of 30 μL. / Il test è costituito da 3 componenti, ciascuno da 10 μL: anticorpo di prova marcato, cellule (codificate o meno) e colorante di integrità della membrana cellulare (B/verde). Ogni componente viene preparato a 3X prima dell'aggiunta per una concentrazione finale di 1X e un volume di dosaggio di 30 μL.
A fluorescent signal is generated as internalized antibody is processed into the acidic endosome and lysosome pathway probe (Nath et al., 2016). This type of novel reagent enables a generic, one-step, no-wash labeling protocol for all isotype-matched, Fc-containing test antibodies when optimized for use on specific instruments. Figure 2 shows how this reagent works: labeled antibodies are added to cells, and a fluorogenic signal is produced as the Fab-Ab complex is internalized and processed via acidic (pH 4.5- 5.5) lysosomes and endosomes. Antibodies of interest are quickly and effectively labeled, with low reagent requirements, by incubating in growth media with this novel, pH-sensitive dye (Figure 3). Cells are then added to 384-well plates, along with the dye-conjugated antibodies, and incubated again. This reagent, when used with an advanced flow cytometry platform, provides a comprehensive, integrated solution for rapid profiling of antibody internalization and other critical antibody attributes using small sample volumes in 96- or even 384-well plate formats (Riedl et al., 2016). Much of the data acquisition and analysis, including generation of serial dilution curves and EC50 calculations, is automated with the help of advanced software packages, for example, as included in the iQue® advanced flow cytometry platform.
Functional Profiling for Comprehensive Cell and Antibody Characterization
Early in the Process with Multiplex Analysis Combining the above-described pH-sensitive dye with other reagents in one assay on an advanced flow cytometry platform enables simultaneous analysis of a variety of cell and antibody characteristics within the same workflow. For instance, you can measure cell viability using a membrane integrity dye to assess general cell health, as well as cell death due to cargo delivery, when optimizing ADCs. Or you can characterize cell specificity using encoding dyes (for cell lines) or directly conjugated fluorescent antibodies (for complex cell models with a variety of cell types). Other reagents, such as those for assessing cytokine release, are also available for more detailed antibody assessments on the sample. Therefore, analysis with an advanced flow cytometry platform can be optimized to deliver rich content very quickly while only using a low sample volume.
Figure 4: Serial dilution curves for internalization-labeled antibodies with a top concentration of 1 mg/mL in different cell types after a three-hour incubation. Multiplexed positive and negative cell lines may be used in an ABI assay to generate high-content data in one assay. Median fluorescent intensity (MFI) for Internalization Reagent-labeled antibodies after three hours. A serial dilution of each antibody with a top concentration of 1 mg/mL was prepared and incubated with encoded Jurkat, Raji, and Ramos cells in the same well. Jurkat cells (a T lymphocyte cell line) show a concentration- dependent increase in internalization of anti-CD3, but not the two B cell markers. Conversely, Raji cells show a concentration-dependent increase in internalization of anti-CD19 and anti-CD22, but not anti-CD3. Ramos cells show a concentration-dependent increase in internalization of anti-CD79b, an ADC drug target for nonHodgkin’s lymphoma. / Curve di diluizione seriale per anticorpi marcati con internalizzazione con una concentrazione massima di 1 mg/mL in diversi tipi di cellule dopo un'incubazione di tre ore. Linee cellulari multiplexate positive e negative possono essere utilizzate in un test ABI per generare dati ad alto contenuto in un test. Intensità fluorescente mediana (MFI) per gli anticorpi marcati con il reagente di internalizzazione dopo tre ore. Una diluizione seriale di ciascun anticorpo con una concentrazione massima di 1 mg/mL è stata preparata e incubata con cellule Jurkat, Raji e Ramos codificate nello stesso pozzetto. Le cellule Jurkat (una linea cellulare di linfociti T) mostrano un aumento dipendente dalla concentrazione nell'internalizzazione dell'anti-CD3, ma non i due marcatori delle cellule B. Al contrario, le cellule Raji mostrano un aumento dipendente dalla concentrazione nell'internalizzazione di anti-CD19 e anti-CD22, ma non di anti-CD3. Le cellule Ramos mostrano un aumento dipendente dalla concentrazione nell'internalizzazione dell'anti-CD79b, un bersaglio farmacologico ADC per il linfoma non Hodgkin.
Sartorius produces such a pH-sensitive reagent for use on our iQue advanced flow cytometry platform. The combination of non-perturbing and validated reagents for multiplexing, no-wash protocols, high-throughput capabilities, flexibility for a robotic interface, and integrated Forecyt® software for multiparametric data analysis and visualization expedite the process of screening drug candidates for potential efficacy and toxicity to accelerate antibody discovery and development.
To demonstrate the multiplexing capabilities of this novel pH-sensitive dye on the iQue platform, we used Ramos and Raji cells stained with two intensities of violet encoding dye, combined with unstained Jurkat cells. We incubated this for three hours with a serial dilution of dye-conjugated specificity antibodies (isotype-matched anti-CD3 as a T cell marker, anti-CD19, anti-CD20, anti-CD22, or anti-CD79b as B cell markers, anti-CD71 as a positive control, and IgG as a negative control), then added a cell membrane integrity dye before acquiring data from the plate. Using this strategy, we were able to identify viable cells, then spectrally separate Ramos, Raji, and Jurkat cells. We then assessed antibody internalization for each cell line. We generated series dilution curves for the specificity markers of each cell type (Figure 4A). As expected, Jurkat cells showed internalization of anti-CD3, but not anti-CD19 or anti-CD22, whereas the Raji cells internalized anti-CD19 and anti-CD22, but not anti-CD3. Only Ramos cells showed a concentration-dependent increase in internalization of anti-CD79b, an ADC drug target for non-Hodgkin’s lymphoma. In the three-hour assay time frame, we did not observe anti-CD20 internalization, but we did see an increase in the two B cell lines by 24 hours (data not shown). Importantly, we saw little difference when we assessed the cells for internalization alone or when we mixed them. This result shows that multiplexing positive and negative cell lines does not interfere with the antibody internalization assay. Compared to performing a series of singleplex assays, a multiplexed assay approach enables you to analyze multiple readouts (internalization, viability, cell type) from a single well, decreasing the number of tests needed to perform a comprehensive functional characterization of the Ab candidate. Full Concentration Profiling with Live-Cell Imaging and Analysis A pH-sensitive dye-coupled antibody fragment designed according to the same principle as that used above (Figure 2) can also be optimized and used in other instruments. For instance, using this pH-sensitive reagent in a real-time, live-cell imaging system such as the Incucyte® Live-Cell Analysis System, allows visualization and automatic quantification of the full time-course of ABI. This combination of reagent and platform thus provides a simple method for directly profiling and comparing ABI for a large number of antibodies (10–100s at a time in a miniaturized format). To demonstrate the power of the pH-sensitive dye approach for high-throughput antibody internalization assays in a real-time, live-cell analysis system, we performed a head-to-head comparison of the internalization properties of six different commercially available anti-CD71 antibodies into HT1080 fibrosarcoma cells. We labeled the anti-CD71 with our pH-sensitive reagent before adding to cells in 96-well plates. We then captured the internalization signal in a live-cell analysis system every 30 minutes over 12 hours using a 10X magnification. The plate view in Figure 5A shows clear positive and negative control responses in column 11 and 12, with concentration-dependent responses for each antibody across the two plates (antibodies 1a and 1b are the same clone from two different sources). We found that three antibodies (Ab1a, Ab2, and Ab1b) gave internalization signals that we detected at low concentrations (< 0.05 μg/ml) (Figure 5). Reassuringly, Ab1a and Ab1b gave similar internalization responses. Antibodies 3, 4, and 5 were internalized more weakly and only at higher concentrations. From the control responses, we calculated a mean Z’ value of 0.82 (two plates: 0.75, 0.87), indicating high robustness for this microplate assay. These data show our method is suitable for comparing the internalization of multiple antibodies at a single target, or one antibody in various cell types. The assay precision and workflow is such that it would be possible to compare 100s of different antibodies at once, and further throughput could be achieved through miniaturization to a 384-well format. Showing a Simple Pharmacological and Kinetic Quantification of Antibody Internalization Using Herceptin In addition, we experimented to determine EC50 values for the internalization of a clinically used monoclonal antibody, Herceptin (Trastuzumab). We constructed a concentration-response curve by labeling Herceptin with the pH-sensitive reagent, then serially diluting (1:2) before adding to BT-474 cells.
Figure 5: Screening test of Abs for internalization. The pH-sensitive reagent is suitable for high-throughput antibody internalization assays in a real-time, live-cell analysis system. / Test di screening di Abs per l'internalizzazione. Il reagente sensibile al pH è adatto per analisi di internalizzazione di anticorpi ad alto rendimento in un sistema di analisi di cellule vive in tempo reale.
In BT-474 Her2-positive breast carcinoma cells, we saw definite time and concentration-dependent internalization of Herceptin over 48 hours. From an area under the curve (AUC) time-course analysis, we calculated the EC50 value for internalization at 323 ng/mL = 2.1 nM (Figure 6). Our calculated EC50 value is similar to the known KD value for Herceptin for its target receptor (approximately 5 nM). Speed and Insight through Advanced Antibody Screening Quick and accurate identification of suitable drug candidates is key to the development of therapeutic antibodies. ABI is an essential part of the selection criteria for ADC candidates. It can be used for functional profiling and rate comparisons, as well as mechanistic studies when coupled with additional multiplexed readouts, thus reducing the time required for lead generation. To illustrate the capabilities of advanced antibody screening, we have described our solution for efficiently interrogating libraries of candidates early in the screening process. For comprehensive cell and antibody characterization, we used our novel, pH-sensitive reagent and the iQue advanced flow cytometry platform. This combination is best for screening and early full concentration profiling because it enables simultaneous analysis of a variety of cell and antibody characteristics within the same workflow. For quantitative, pharmacological analysis and direct, hlive-cell analysis system. This combination is useful for further functional profiling that requires spateadto- head comparisons of ABI, we used a version of our novel, pH-sensitive reagent and the Incucyte ial and temporal resolution. This advanced antibody screening process is a simple, fast, and insightful way to identify candidates that meet your therapeutic goals early in the drug discovery process.
Figure 6: Quantitative pharmacological analysis of pH-sensitive dye-labeled Herceptin shows time and concentration- dependent internalization and an EC50 value of 2.1 nM. Quantitative pharmacological analysis of pH-sensitive dye-labeled Herceptin. BT-474 Her2- positive cells were treated with increasing concentrations of pH-sensitive dye-labeled Herceptin. The time course graph displays an increasing normalized red area over time with increasing Herceptin concentrations (A). Area under the curve analysis of this response displays a clear concentration dependent response with an EC50 of 323 ng/ mL (B). All data shown as a mean of 3 wells ± SEM, time course data shown as normalized red area. / L'analisi farmacologica quantitativa dell'Herceptin marcato con colorante sensibile al pH mostra l'internalizzazione dipendente dal tempo e dalla concentrazione e un valore EC50 di 2,1 nM. Analisi farmacologica quantitativa di Herceptin marcato con colorante sensibile al pH. Le cellule BT-474 Her2- positive sono state trattate con concentrazioni crescenti di Herceptin marcato con colorante sensibile al pH. Il grafico dell'andamento temporale mostra un'area rossa normalizzata in aumento nel tempo con l'aumento delle concentrazioni di Herceptin (A). L'analisi dell'area sotto la curva di questa risposta mostra una chiara risposta dipendente dalla concentrazione con un EC50 di 323 ng/ml (B). Tutti i dati mostrati come media di 3 pozzetti ± SEM, i dati dell'andamento temporale mostrati come area rossa normalizzata.
Combining Advanced Flow Cytometry and Live-Cell Imaging and Analysis for Complete Antibody Profiling:
Researchers at LifeArc used the iQue platform and Incucyte Live-Cell Analysis System as part of their strategy to develop a new ADC targeting neuroblastoma. Neuroblastoma is a rare cancer that nev ertheless is the most common extra-cranial solid tumor in children, with a 5-year survival rate of 50% for patients with high-risk disease. The researchers found they were able to use these systems in combination, not only for screening, but also for assay development, lead candidate profiling, and characterization. They found that the iQue platform offered fast, high-content analysis, while the Incucyte live-cell analysis system offered kinetic, image-based analysis. Combining data from the two systems gave them a complete antibody profile. In brief, the researchers identified anaplastic lymphoma kinase (ALK) as a target for their therapeutic approach because level of ALK expression correlates with disease stage and ALK antibodies show surface expression in patient samples. In collaboration with colleagues at Mt. Sinai, researchers at LifeArc produced 1,152 candidate hybridoma clones that they were able to narrow to 53 candidates that ELISA and flow cytometry showed bound to ALK. Using the advanced flow cytometry capabilities of the iQue platform, the researchers were able to further narrow this to 20 candidates that bound ALK at the surface of cells, since this is a critical attribute of the mechanism of action of ADCs. Of particular interest, these researchers used internalization assays on both the iQue and Incucyte cell analysis platforms to further narrow their lead candidates to two. Critically, they gained kinetic imaging data and high-content analysis using multiplexed cell viability assays early in their ADC discovery process. Using advanced screening methods that incorporate a novel, innovative reagent for characterizing ABI via both advanced flow cytometry and live-cell imaging, they gained maximum insight through high-content data and were able to make critical decisions early in their process, thus saving time, material, and money.
ITALIANO
Introduzione
Le caratteristiche naturali degli anticorpi, come l'elevata affinità di legame, la specificità per un'ampia varietà di bersagli e la buona stabilità, li rendono candidati terapeutici ideali per molte malattie. Gli anticorpi monoclonali (mAbs), in particolare, forniscono risultati terapeutici promettenti in diverse aree patologiche, come l'autoimmunità, l'oncologia e l'infiammazione cronica. Le capacità dei ricercatori di migliorare l'ampiezza degli anticorpi sono state aiutate da tecnologie innovative per la scoperta di anticorpi, ad esempio attraverso l'umanizzazione degli anticorpi di topo e la visualizzazione dei fagi. Tuttavia, le tecniche avanzate di progettazione degli anticorpi creano la necessità di nuovi metodi di screening in modo che i candidati principali possano essere identificati rapidamente ed efficacemente il più presto possibile nel processo di sviluppo. Parte di una strategia di screening efficace consiste nell'identificare l'obiettivo terapeutico desiderato per i candidati. Ad esempio, il legame e la rapida internalizzazione sono proprietà desiderabili per i coniugati anticorpo-farmaco (ADC), poiché le cellule devono essere bersagliate selettivamente e uccise tramite la consegna di un carico utile citotossico. Al contrario, se l'obiettivo è indurre la citotossicità cellulo-mediata dipendente dall'anticorpo (ADCC), l'anticorpo deve rimanere legato alla superficie cellulare, piuttosto che essere interiorizzato, per attivare una risposta immunitaria. Quando si progettano gli ADC, un attributo chiave per prevedere l'efficacia è il tasso di internalizzazione dell'anticorpo (ABI) e la cinetica associata. Queste cinetiche di internalizzazione sono influenzate da fattori come l'epitopo sull'antigene bersaglio, l'affinità dell'interazione ADC-antigene ed il traffico intracellulare. La valutazione di questi fattori è fondamentale durante tutto il percorso di screening degli anticorpi (Figura 1); tuttavia, qui, ci concentriamo sulla valutazione dell'ABI degli anticorpi durante la profilazione funzionale tramite confronti di velocità durante il processo di sviluppo, nonché studi meccanicistici multiplexati successivamente nel processo di screening.
Tradizionalmente, i flussi di lavoro di screening anticorpale hanno richiesto metodi laboriosi, dispendiosi in termini di tempo e solo endpoint, come FACS, ELISA o microscopia. Una soluzione per affrontare queste sfide di screening consiste nell'utilizzare metodi di screening avanzati che offrono la massima comprensione attraverso dati ad alto contenuto. Qui, dimostriamo un metodo di screening anticorpale avanzato che si concentra sulla velocità e sulla comprensione utilizzando un nuovo reagente sensibile al pH per caratterizzare l'ABI tramite citometria a flusso avanzata e imaging di cellule vive.
Sfide con i tradizionali flussi di lavoro di screening degli anticorpi
Gli anticorpi monoclonali (mAb) sono grandi (circa 150 kDa), molecole biologiche complesse che richiedono modifiche post-traduzionali per la loro attività (Chames et al., 2009). Pertanto, i ricercatori devono affrontare diverse sfide durante la progettazione e la produzione di mAbs come terapie. La progettazione di anticorpi per ottimizzare le loro potenze biologiche durante la fase di scoperta può affrontare molte di queste sfide. Tuttavia, questi tentativi di ottimizzare un attributo possono avere conseguenze profonde e indesiderate su altri attributi dell'anticorpo. Ad esempio, l'ottimizzazione della specificità di un anticorpo può influire negativamente sull'attività (Tiller e Tessier, 2015). Un modo per ottimizzare contemporaneamente più proprietà anticorpali consiste nell'usare la mutagenesi per produrre grandi librerie di screening. Tuttavia, le grandi librerie di screening richiedono un metodo di screening in vitro completo ed ad alto rendimento per identificare rapidamente i farmaci candidati più adatti per un ulteriore sviluppo all'inizio del loro processo di scoperta. I flussi di lavoro per lo screening degli anticorpi includono comunemente la selezione delle cellule attivate dalla fluorescenza (FACS), i test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) e le tecniche di microscopia (come confocale). Tuttavia, questi metodi di screening anticorpale in vitro presentano diversi inconvenienti:
(1) possono essere laboriosi con una produttività limitata,
(2) non consentono confronti diretti e testa a testa di anticorpi e
(3) richiedono grandi quantità di reagenti.
Ad esempio, anche se FACS può essere utilizzato per ordinare centinaia di migliaia di cellule in base alle loro proprietà di fluorescenza, non può essere utilizzato per eseguire studi ad alta produttività e dipendenti dal tempo su singole cellule perché le cellule devono essere ordinate in singole colonie prima di qualsiasi è possibile eseguire ulteriori analisi (Doerner et al., 2014).
ELISA, d'altra parte, è adattabile allo screening ad alto rendimento (Saeed et al., 2017), e quindi è stato storicamente utilizzato per schermare ibridomi ed altre librerie per il legame di anticorpi a ciascuno dei suoi bersagli. Gli ELISA vengono eseguiti rivestendo un singolo antigene bersaglio sui pozzetti delle piastre del test, seguito dall'aggiunta di singoli campioni da una libreria di anticorpi (ad esempio, da ibridoma o phage display). Gli anticorpi che si legano all'antigene immobilizzato vengono rilevati da un cambiamento di colore dovuto ad una reazione indiretta enzima/substrato. Oltre alla sua adattabilità allo screening ad alto rendimento, ELISA è rapido, coerente e relativamente facile da analizzare (Saeed et al., 2017).
Tuttavia, l'ELISA presenta diversi svantaggi che possono limitarne l'utilizzo in un moderno laboratorio di screening anticorpale. In primo luogo, gli screening primari che testano il legame a un singolo antigene spesso richiedono successivi screening secondari e talvolta anche terziari con antigeni di controllo per confermare la loro specificità e reattività crociata. In secondo luogo, l'ELISA non è il metodo migliore per lo screening degli anticorpi che si legano agli antigeni della superficie cellulare poiché questi antigeni vengono estratti dalla membrana cellulare e purificati prima dell'adsorbimento sulla piastra ELISA in plastica.
L'estrazione di antigeni dalla membrana spesso porta alla rottura degli epitopi conformazionali che possono essere bersagli importanti per gli anticorpi terapeutici. Infine, per ridurre al minimo il segnale di fondo, ELISA richiede più fasi di lavaggio per rimuovere gli anticorpi non legati ed i reagenti di rilevamento, con conseguenti flussi di lavoro di screening lunghi e laboriosi. Inoltre, sebbene l'ELISA possa fornire dati sul titolo dell'immunoglobulina G (IgG), non offre alcuna riflessione su come i candidati anticorpali terapeutici influiscano sulla salute delle cellule del test. cioè quanto velocemente o efficacemente inducono la morte. Pertanto, i candidati che sembrano essere produttivi sulla base dello screening ELISA possono essere portati avanti nella fase successiva del processo di produzione anche se non sono candidati ideali in termini di funzione o vigore. Le tecniche di microscopia, a differenza del FACS, sono utili per l'analisi di cellule singole, nonché per tali studi di localizzazione e temporali come l'internalizzazione di anticorpi e l'imaging di cellule vive per il monitoraggio del comportamento delle singole cellule. Le tecniche di microscopia, tuttavia, hanno un throughput limitato a causa del tempo di acquisizione dei dati e hanno limitate capacità di multiplexing. Pertanto, per la scoperta di anticorpi, viene generalmente utilizzato un altro metodo, preferibilmente ad alto rendimento, per la selezione iniziale e lo screening di grandi librerie, seguito da un'analisi funzionale più approfondita di un insieme più piccolo di candidati anticorpali mediante microscopia (Doerner et al., 2014). Come FACS, anche le tecniche di microscopia richiedono l'etichettatura di ciascun anticorpo con un tag fluorescente, che deve essere separato dall'etichetta libera tramite una colonna o una fase di lavaggio perché l'analisi richiede un isolamento robusto degli anticorpi interiorizzati da quelli esterni alle cellule. Per favorire l'isolamento del segnale positivo, i ricercatori ricorrono spesso a tecniche di perturbazione, come il lavaggio delle cellule, l'uso di coloranti bloccanti e la riduzione della temperatura per rallentare l'attività cellulare. Tuttavia, le cellule possono essere perse durante le fasi di lavaggio e le riduzioni di temperatura associate perturbano l'ambiente cellulare. Un ulteriore svantaggio di quasi tutte le tecniche utilizzate per lo screening degli anticorpi è che consentono solo l'analisi del punto finale, il che significa che sono necessari più esperimenti per seguire un attributo dell'anticorpo, come l'interiorizzazione, nel tempo. L'approccio migliore per affrontare tutti i limiti dello screening anticorpale tradizionale consiste nel combinare i dati provenienti da metodi di screening avanzati; utilizzando metodi avanzati, i ricercatori possono scegliere i loro candidati sulla base di una valutazione approfondita di tutte le caratteristiche rilevanti, come il titolo IgG, la salute cellulare, l'interiorizzazione e la cinetica associata nelle prime fasi del processo di scoperta.
Un modo semplice per etichettare gli anticorpi per affrontare le sfide con FACS, ELISA e microscopia
Una delle sfide presentate sopra con FACS, ELISA e tecniche di microscopia è il requisito delle fasi di lavaggio per ridurre al minimo il segnale di fondo. Tra gli altri effetti indesiderati, come l'aumento del tempo per ottenere risultati, questa necessità di fasi di lavaggio aumenta anche il fabbisogno di reagenti (e il costo) e rende inevitabile la perdita di cellule. Tuttavia, un metodo avanzato per l'etichettatura delle cellule potrebbe ridurre i requisiti dei reagenti, nonché semplificare i protocolli durante l'analisi dell'internalizzazione degli anticorpi. Saggi ABI resi semplici, con etichettatura senza lavaggio e bassi requisiti di reagente tramite un nuovo reagente sensibile al pH La chiave di questo semplice protocollo senza lavaggio è un nuovo reagente composto da una regione Fc mirata a frammenti Fab coniugati a un reagente sensibile al pH fluorescente.
Un segnale fluorescente viene generato quando l'anticorpo interiorizzato viene elaborato nell'endosoma acido e nella sonda del percorso del lisosoma (Nath et al., 2016). Questo tipo di nuovo reagente consente un protocollo di etichettatura generico, in un'unica fase, senza lavaggio per tutti gli anticorpi di test contenenti Fc corrispondenti agli isotipi, se ottimizzato per l'uso su strumenti specifici. La Figura 2 mostra come funziona questo reagente: anticorpi marcati vengono aggiunti alle cellule e viene prodotto un segnale fluorogenico mentre il complesso Fab-Ab viene interiorizzato ed elaborato tramite lisosomi ed endosomi acidi (pH 4,5-5,5). Gli anticorpi di interesse vengono etichettati in modo rapido ed efficace, con bassi requisiti di reagenti, incubando in terreni di crescita con questo nuovo colorante sensibile al pH (Figura 3). Le cellule vengono quindi aggiunte a piastre da 384 pozzetti, insieme agli anticorpi coniugati con colorante, e incubate nuovamente. Questo reagente, se utilizzato con una piattaforma di citometria a flusso avanzata, fornisce una soluzione completa e integrata per la profilazione rapida dell'internalizzazione degli anticorpi e di altri attributi critici degli anticorpi utilizzando piccoli volumi di campione in formati di piastre da 96 o anche 384 pozzetti (Riedl et al., 2016 ). Gran parte dell'acquisizione e dell'analisi dei dati, inclusa la generazione di curve di diluizione seriale e calcoli EC50, è automatizzata con l'aiuto di pacchetti software avanzati, ad esempio, inclusi nella piattaforma di citometria a flusso avanzata iQue®.
Profiling funzionale per la caratterizzazione completa di cellule ed anticorpi
All'inizio del processo con l'analisi multiplex la combinazione del colorante sensibile al pH sopra descritto con altri reagenti in un'analisi su una piattaforma di citometria a flusso avanzata consente l'analisi simultanea di una varietà di caratteristiche di cellule ed anticorpi all'interno dello stesso flusso di lavoro. Ad esempio, è possibile misurare la vitalità cellulare utilizzando un colorante di integrità della membrana per valutare la salute generale delle cellule, nonché la morte cellulare dovuta alla consegna del carico, durante l'ottimizzazione degli ADC. Oppure puoi caratterizzare la specificità cellulare utilizzando coloranti codificanti (per linee cellulari) o anticorpi fluorescenti direttamente coniugati (per modelli cellulari complessi con una varietà di tipi cellulari). Sono disponibili anche altri reagenti, come quelli per la valutazione del rilascio di citochine, per valutazioni anticorpali più dettagliate sul campione. Pertanto, l'analisi con una piattaforma di citometria a flusso avanzata può essere ottimizzata per fornire contenuti ricchi molto rapidamente utilizzando solo un volume di campione ridotto.
Sartorius produce un reagente così sensibile al pH da utilizzare sulla nostra piattaforma di citometria a flusso avanzata iQue. La combinazione di reagenti non perturbanti e convalidati per il multiplexing, i protocolli senza lavaggio, le capacità ad alta produttività, la flessibilità per un'interfaccia robotica e il software Forecyt® integrato per l'analisi e la visualizzazione dei dati multiparametrici accelerano il processo di screening dei farmaci candidati per la potenziale efficacia e tossicità per accelerare la scoperta e lo sviluppo di anticorpi.
Per dimostrare le capacità di multiplexing di questo nuovo colorante sensibile al pH sulla piattaforma iQue, abbiamo utilizzato cellule Ramos e Raji colorate con due intensità di colorante codificante viola, combinate con cellule Jurkat non colorate. Abbiamo incubato questo per tre ore con una diluizione seriale di anticorpi di specificità coniugati con colorante (anti-CD3 abbinato all'isotipo come marcatore di cellule T, anti-CD19, anti-CD20, anti-CD22 o anti-CD79b come marcatori di cellule B, anti-CD71 come controllo positivo e IgG come controllo negativo), quindi ha aggiunto un colorante per l'integrità della membrana cellulare prima di acquisire i dati dalla piastra. Utilizzando questa strategia, siamo stati in grado di identificare le cellule vitali, quindi separare spettralmente le cellule Ramos, Raji e Jurkat. Abbiamo quindi valutato l'internalizzazione degli anticorpi per ciascuna linea cellulare. Abbiamo generato curve di diluizione in serie per i marcatori di specificità di ciascun tipo di cellula (Figura 4A). Come previsto, le cellule Jurkat hanno mostrato l'internalizzazione di anti-CD3, ma non anti-CD19 o anti-CD22, mentre le cellule Raji hanno interiorizzato anti-CD19 e anti-CD22, ma non anti-CD3. Solo le cellule Ramos hanno mostrato un aumento dipendente dalla concentrazione nell'internalizzazione dell'anti-CD79b, un bersaglio farmacologico ADC per il linfoma non Hodgkin. Nel lasso di tempo del test di tre ore, non abbiamo osservato l'internalizzazione anti-CD20, ma abbiamo visto un aumento delle due linee di cellule B di 24 ore (dati non mostrati). È importante sottolineare che abbiamo visto poca differenza quando abbiamo valutato le cellule per l'internalizzazione da sole o quando le abbiamo mescolate. Questo risultato mostra che il multiplexing di linee cellulari positive e negative non interferisce con il test di internalizzazione dell'anticorpo. Rispetto all'esecuzione di una serie di analisi singleplex, un approccio di analisi multiplex consente di analizzare più letture (internalizzazione, vitalità, tipo di cellula) da un singolo pozzetto, riducendo il numero di test necessari per eseguire una caratterizzazione funzionale completa del candidato Ab. Profiling a concentrazione completa con imaging e analisi di cellule vive Un frammento di anticorpo accoppiato a colorante sensibile al pH progettato secondo lo stesso principio utilizzato sopra (Figura 2) può anche essere ottimizzato e utilizzato in altri strumenti. Ad esempio, l'utilizzo di questo reagente sensibile al pH in un sistema di imaging di cellule vive in tempo reale come Incucyte® Live-Cell Analysis System, consente la visualizzazione e la quantificazione automatica dell'intero decorso temporale dell'ABI. Questa combinazione di reagente e piattaforma fornisce quindi un metodo semplice per profilare e confrontare direttamente l'ABI per un gran numero di anticorpi (10-100 alla volta in un formato miniaturizzato). Per dimostrare la potenza dell'approccio del colorante sensibile al pH per i saggi di internalizzazione di anticorpi ad alto rendimento in un sistema di analisi di cellule vive in tempo reale, abbiamo eseguito un confronto testa a testa delle proprietà di internalizzazione di sei diversi anti- Anticorpi CD71 nelle cellule di fibrosarcoma HT1080. Abbiamo etichettato l'anti-CD71 con il nostro reagente sensibile al pH prima di aggiungerlo alle cellule in piastre da 96 pozzetti.
Abbiamo quindi catturato il segnale di internalizzazione in un sistema di analisi di cellule vive ogni 30 minuti per 12 ore utilizzando un ingrandimento 10X. La vista della piastra nella Figura 5A mostra chiare risposte di controllo positive e negative nelle colonne 11 e 12, con risposte dipendenti dalla concentrazione per ciascun anticorpo attraverso le due piastre (gli anticorpi 1a e 1b sono lo stesso clone da due fonti diverse). Abbiamo scoperto che tre anticorpi (Ab1a, Ab2 e Ab1b) hanno dato segnali di internalizzazione che abbiamo rilevato a basse concentrazioni (<0,05 μg/ml) (Figura 5). In modo rassicurante, Ab1a e Ab1b hanno dato risposte di interiorizzazione simili. Gli anticorpi 3, 4 e 5 sono stati internalizzati più debolmente e solo a concentrazioni più elevate. Dalle risposte di controllo, abbiamo calcolato un valore Z medio di 0,82 (due piastre: 0,75, 0,87), indicando un'elevata robustezza per questo test su micropiastra. Questi dati mostrano che il nostro metodo è adatto per confrontare l'internalizzazione di più anticorpi su un singolo bersaglio o un anticorpo in vari tipi di cellule. La precisione e il flusso di lavoro del test sono tali che sarebbe possibile confrontare contemporaneamente centinaia di anticorpi diversi e si potrebbe ottenere un'ulteriore produttività attraverso la miniaturizzazione in un formato a 384 pozzetti. Mostrare una semplice quantificazione farmacologica e cinetica dell'internalizzazione anticorpale mediante l'Herceptin Inoltre, abbiamo sperimentato per determinare i valori EC50 per l'internalizzazione di un anticorpo monoclonale utilizzato clinicamente, l'Herceptin (Trastuzumab).
Abbiamo costruito una curva concentrazione-risposta etichettando Herceptin con il reagente sensibile al pH, quindi diluendolo in serie (1:2) prima di aggiungerlo alle cellule BT-474.
Nelle cellule di carcinoma mammario BT-474 Her2-positive, abbiamo visto l'internalizzazione dipendente dalla concentrazione e dal tempo definito di Herceptin nell'arco di 48 ore. Da un'analisi dell'andamento temporale dell'area sotto la curva (AUC), abbiamo calcolato il valore EC50 per l'internalizzazione a 323 ng/mL = 2,1 nM (Figura 6). Il nostro valore EC50 calcolato è simile al valore KD noto per Herceptin per il suo recettore target (circa 5 nM). Velocità e comprensione attraverso lo screening anticorpale avanzato L'identificazione rapida e accurata dei farmaci candidati idonei è la chiave per lo sviluppo di anticorpi terapeutici. L'ABI è una parte essenziale dei criteri di selezione per i candidati ADC. Può essere utilizzato per la profilazione funzionale e il confronto dei tassi, nonché per studi meccanicistici se abbinato a letture multiplex aggiuntive, riducendo così il tempo necessario per la generazione di lead. Per illustrare le capacità dello screening anticorpale avanzato, abbiamo descritto la nostra soluzione per interrogare in modo efficiente le librerie di candidati all'inizio del processo di screening. Per una caratterizzazione completa di cellule e anticorpi, abbiamo utilizzato il nostro nuovo reagente sensibile al pH e la piattaforma di citometria a flusso avanzata iQue. Questa combinazione è la migliore per lo screening e la profilazione precoce della piena concentrazione perché consente l'analisi simultanea di una varietà di caratteristiche di cellule e anticorpi all'interno dello stesso flusso di lavoro. Per analisi quantitativa, farmacologica e diretta, sistema di analisi hlive-cell. Questa combinazione è utile per un'ulteriore profilazione funzionale che richiede confronti spatead-to-head di ABI, abbiamo usato una versione del nostro nuovo reagente sensibile al pH e la risoluzione Incucyte ial e temporale. Questo processo avanzato di screening degli anticorpi è un modo semplice, rapido e approfondito per identificare i candidati che soddisfano i tuoi obiettivi terapeutici nelle prime fasi del processo di scoperta del farmaco.
Combinazione di citometria a flusso avanzata e imaging e analisi di cellule vive per un profilo completo degli anticorpi:
I ricercatori di LifeArc hanno utilizzato la piattaforma iQue ed il sistema di analisi delle cellule vive Incucyte come parte della loro strategia per sviluppare un nuovo ADC mirato al neuroblastoma. Il neuroblastoma è un tumore raro che tuttavia è il tumore solido extracranico più comune nei bambini, con un tasso di sopravvivenza a 5 anni del 50% per i pazienti con malattia ad alto rischio. I ricercatori hanno scoperto di essere in grado di utilizzare questi sistemi in combinazione, non solo per lo screening, ma anche per lo sviluppo di test, la profilazione dei candidati principali e la caratterizzazione. Hanno scoperto che la piattaforma iQue offriva analisi rapide e ad alto contenuto, mentre il sistema di analisi delle cellule vive Incucyte offriva analisi cinetiche basate su immagini. La combinazione dei dati dei due sistemi ha fornito loro un profilo anticorpale completo. In breve, i ricercatori hanno identificato la chinasi del linfoma anaplastico (ALK) come bersaglio per il loro approccio terapeutico perché il livello di espressione di ALK è correlato allo stadio della malattia e gli anticorpi ALK mostrano un'espressione superficiale nei campioni dei pazienti. In collaborazione con i colleghi del Monte Sinai, i ricercatori di LifeArc hanno prodotto 1.152 cloni di ibridomi candidati che sono stati in grado di restringere a 53 candidati che l'ELISA e la citometria a flusso hanno mostrato legati ad ALK. Utilizzando le funzionalità avanzate di citometria a flusso della piattaforma iQue, i ricercatori sono stati in grado di restringere ulteriormente questo numero a 20 candidati che legano ALK alla superficie delle cellule, poiché questo è un attributo fondamentale del meccanismo d'azione degli ADC. Di particolare interesse, questi ricercatori hanno utilizzato saggi di internalizzazione su entrambe le piattaforme di analisi cellulare iQue e Incucyte per restringere ulteriormente a due i loro candidati principali. Fondamentalmente, hanno ottenuto dati di imaging cinetico e analisi ad alto contenuto utilizzando saggi di vitalità cellulare multiplex all'inizio del loro processo di scoperta dell'ADC. Utilizzando metodi di screening avanzati che incorporano un nuovo reagente innovativo per caratterizzare l'ABI tramite citometria a flusso avanzata e imaging di cellule vive, hanno ottenuto la massima comprensione attraverso dati ad alto contenuto e sono stati in grado di prendere decisioni critiche all'inizio del loro processo, risparmiando così tempo, materiale e denaro.
Da:
https://www.sartorius.com/resource/blob/1405446/2cc3865f26eb34abcfcece3e0b95f39b/empowering-antibody-discovery-incucyte-ebook-en-l-sartorius-1--data.pdf
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